中国野生葡萄芪合成酶基因表达与抗白粉病功能研究

1、中国野生葡萄芪合成酶基因表达与抗白粉病功能研究葡萄是世界性栽培的主要果树之一 ,不仅用途广泛 , 还具有良好的经济效益。 生产上主栽品种欧洲葡萄高产优质风味佳 , 但其突出缺点是易感病 ,尤其是葡萄 白粉病。葡萄中的白藜芦醇及其衍生物 , 在葡萄体内具有植保素的抗病功能 , 人食用 后对身体健康具有抗癌、抗氧化和抗衰老等保健功能。因此 , 研究葡萄芪合成酶 基因及其表达产物白藜芦醇的作用 , 是近年来研究者提高与改良酿酒和鲜食品种 抗病性与品质的重要科学问题之一。本研究以中国野生葡萄种质为材料进一步分析了自然条件下芪合成酶组织 水平和亚细胞水平表达特点 ; 分析调控葡萄芪合成酶基因表达的信号途

2、径和关键 节点基因功能 ; 研究诱导条件下芪合成酶及其产物合成、 转运、降解和作用方式 ; 研究芪类物质抗葡萄白粉病的作用 , 为利用中国野生葡萄的抗病性与芪合成酶基 因改良欧洲葡萄抗病性提供依据 ,主要研究与结果如下 : （1）中国野生华东葡萄 芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性表达。芪合成酶基因STS29在华东葡萄白河 -35-1 '和欧洲葡萄无核白的成熟叶片、毛葡萄丹凤 -2'成 熟果实中高表达。芪合成酶VpSTS29在转基因葡萄株系的根和成熟叶片中积累。 芪合成酶表达的产物白藜芦醇及白藜芦醇苷主要分布在根、茎和成熟叶片中。在转基因拟南芥株系中芪合成酶 V

3、pSTS29及白藜芦醇苷积累在成熟的叶片 中 , 并在发育进程维持较高水平的叶绿素含量和光化学效率以延迟植株衰老。（2）芪合成酶基因VpSTS29受生物与非生物胁迫诱导表达。中国野生华东葡萄白河 35-1'在接种白粉菌后 48 h 至 72 h 和 144 h, 芪 合成酶基因VpSTS29表达量较高。在其他生物小分子SAABAMeJA和Ethylene、 非生物类因子高盐、干旱、创伤、低温和 UV-C光等胁迫处理条件下,VpSTS29基 因均上调表达。此外,UV-C光处理诱导芪合成酶基因 VpSTS29显著表达。进一步研究表明 UV-C畐射诱导VpSTS29蛋白表达和芪类物质合成,且

4、发现从细胞质向叶绿体迁移 的现象。表型观察表明转基因无核白增强了对 UV-C辐射的敏感性：叶片表现出干枯 和烧焦状且降低H<sub>2v/sub>O<sub>2v/sub>勺含量。定量RT-PCF分析表明 VpSTS29专基因无核白改变了响应氧化还原、芪类物质合成和光胁迫相关基因的 表达。拟南芥原生质体瞬时转化实验表明过表达芪合成酶基因VpSTS29也能降低细胞内部H<sub>2v/sub>O<sub>2v/sub啲含量。这些结果说明芪合成酶受环境 胁迫诱导与表达 , 在细胞器间存在动态分布 , 并促进芪类物质的积累。综上芪合成

5、酶基因VpSTS29既受生物胁迫诱导表达,又受非生物胁迫诱导表 达。因此 , 该基因在葡萄生长发育过程中起到抗病与积极适应逆境胁迫的作用。(3) 交叉嫁接实验结果表明芪合成酶 VpSTS29蛋白不存在组织间的运输； 在砧木过表达芪合成酶基因VpSTS29能显著提高接穗芪类物质含量。原位荧光观 察结果表明VpSTS2£g白主要分布在根尖分生区、茎的维管组织以及叶片的叶肉 组织。亚细胞定位分析表明芪合成酶VpSTS29定位于细胞质以及球状体胞器。尼罗 红染色、胞器标记基因共定位以及免疫组化分析证实该球状体为油体 , 且在特定 发育阶段这些油体游离在细胞质和液泡中蛋白表达模式分析证实定位于

6、细胞质、油体和液泡中的绿色荧光为VpSTS29-GF融合蛋白。共定位和抑制试验结果表明油体定位的 VpSTS29是通过 自噬途径转运至液泡的。综上在葡萄体内芪合成酶 VpSTS29经内质网衍生的油体通过自噬途径转运 至液泡中。芪合成酶及其产物在合成后存在动态再分配, 以满足植物生长发育的需要。（4）RT-PCF分析表明在白粉菌接种后24 h至48 h转基因葡萄芪合成酶基 因表达强度显著高于非转基因葡萄,芪合成酶基因VpSTS29改变了感病葡萄无核 白内源芪合成酶基因及病程相关蛋白基因对白粉菌入侵的应答时间以及表达强 度。通过大麦凝集素染色、 基因枪轰击、 原位荧光观察以及免疫印迹分析证明了 转

7、基因葡萄中芪合成酶 VpSTS29是通过增强叶肉组织的表达以及合成有活性的 葡萄素积累在侵入位点 , 进一步抑制病原菌入侵。在不含有芪合成酶基因的模式植物拟南芥中转入VpSTS29基因,转基因拟南芥积累VpSTS29蛋白和白藜芦醇苷,表现出抑制菌丝生长、局部发生过敏反应以 及降低病原菌侵入率。外源施加水杨酸 SA和白藜芦醇均能促进VpSTS29蛋白的 表达和 trans-piceid 的累积。SA信号途径与白藜芦醇合成途径在病原菌防御中密不可分。这些结果表明，芪合成酶基因表达及芪类物质积累增强转基因VpSTS29欧洲葡萄无核白和拟南芥对白粉病抗性。（5）R2R3类型转录因子MYB14和 MYB

8、15在中国野生葡萄和欧洲葡萄中氨基 酸序列较为保守,且直接结合芪合成酶基因VpSTS29的启动子。此外,通过中国野生毛葡萄丹凤 -2'果实发育转录组数据鉴定了调控芪合成酶基因表达的bHLH 类型的转录因子基因 VqICE1共表达分析表明VqlCEl与26个芪合成酶基因存在表达相关性。酵母单杂交 实验表明VqlCEl能结合group-B亚家族的芪合成酶基因 VqSTS15 VqSTS27和 VqSTS48启动子区域,且降低这些芪合成酶基因启动子的转录活性。而VqMYBI和VqMYBI正调控这些芪合成酶基因启动子活性。 VqlCEl可与VqMYBl4口 VqMYBI在细胞核中相互作用,并直接结合VqMYBI启动子，降低 VqMYBl4勺表达和trans-piceid的积累。白粉菌诱导条件下，野生型无核白葡萄中芪合成酶基因整体水平、MYB14和MYB1受诱导表达;过表达VqICE1降低了白粉菌侵染后期芪合成酶基因整体水平 和MYB14的表达。这些结果表明VqICE1负调控芪合成酶基因的表达，以维持抗病 作用后芪类物质含量恢复到正常水平。综上所述,芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性,且受生物与 非生物逆境胁迫诱导表达 ;