ELISA试验中本底及假阳性产生的原因分析

1、ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析？1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别1.1基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：a. 分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。b. 稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。c. 基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率

2、。d. 纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。1.2合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：a. 分子量太小b. 一般只含有一个抗原决定簇c. 纯度高d. 稳定性差由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就 HCV ELISA试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是 HCV特异性抗 原决定簇的肽片段； 第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了 HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗 原包括更

3、多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。2. 假阳性本底产生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。2.1.2 错误排序的影响。合成肽

4、在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变 而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV核甘酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。2.2. 3抗原纯度对特异性的影响。以HCV抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100%,因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。2.2人血清中的正常IgG人血清中Ig

5、G的浓度对HCV试剂盒有较大的影响。HCV试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有IgG结合，而IgG吸附于板孔的能力很强，因此我们采用 100微升样稀加10微升血清 来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的IgG为12mg/ml ,而有些人的IgG浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA反应后往往会显色。2.3人血情中异常的IgG结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG（IgG浓度达到50mg/ml ）会引起本底升高或假阳性。2.4 溶血的影响当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“

6、PP效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B液显色而造成假阳性。2.5操作不当引起任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键和基础。2.5.1 加样2.5.1.1 样品稀释液少加， 或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。2.5.1.2

7、 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附， 将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120卬l。如果加入的酶多于120卬l或加在较高的孔壁上或孔口，也会弓I起本底升高或假阳性。2.5.2 温育5.2.1由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴 性高值或假阳性。5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37度，在这个温度下放置30分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后

8、的值升高。因此温育时应盖上胶贴。5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的这和水浴的条件不一样。水浴可是酶联板迅速升温, 37度，同样会引起高值阴性。热运动，增加反应的机会。5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于2.5.3.洗板是根据各自试剂的条件配制的，采用不配套的洗液本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司2.5.3.1各个厂家使用的洗液配方是不同的，常会得到不正常的反应结果，包括本底过高的试剂盒混用。2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响

9、洗液的效果，而使反应的本底过高。2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸偕水，电导率小于1.2卬s。如果水中含有过多的Ca2+、Mg2+,这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为 400卬l ,比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量， 以避免加液量不满。2.5.3.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原(抗体)或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力

10、不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A值偏高。2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸， 纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。2.5.4 显色。加A、B液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在 3分钟内读数，否 则强阳性会变低。2.5.5. 枪头、加样槽或其它来源的污染如果使用的枪头、加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头、加样槽清洗不当，也会干扰反应。如将枪头使用84消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为 84是强氧化剂，加入 AB液后就会显色。同样

11、 枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH值，反应的结果也会不正常。常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。2.5.6. 测A值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A值的升高。酶联免疫吸附试验；影响因素；控制方法论文摘要： 酶联免疫吸附试验 (enayme liked immunosorbent assay , ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。但ELISA测定中影响因素较

12、多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨1试剂的因素1.1试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。要选购知名度相对高、具有竺证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。1.2试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿其直接的后果是对一些弱阳出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题, 性标本的检测出现假阴性

13、。因此，在 ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先 从冰箱中拿出来，在室温下放置 2030 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平 衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。2样本的因素2.1内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等1。1.1类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子（RF）,其一般为IgM型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在 E LISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG

14、结合，从而出现假阳性结果。避免其发生的方法有：用 F（ab）2替代完整的IgG。标本用联有 热变性IgG的固相吸附剂处理。 检测抗原时，可用2-疏基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。1.2补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补 体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构， 使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使 C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性 结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的办法是：用EDTA稀释标本。56 C 30 min加热血清使C1q灭活1 ,

15、2。2.2外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。2.1标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标志的ELISA测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的 HRP底物反应显色。所以在采血时应注意手法，采集的血液勿用力振荡， 严防标本溶血。2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d之内应4C保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。2.3标本的保

16、存标本在冰箱中保存过久，血清中IgG可聚合成多聚体,AFP可形成二聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用，可引起假阴性结果。因此， ELISA检测尽量采用新鲜标本， 长时冻存的样本避免反复融冻。2.4标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。解决的方法 有：于采血管中加入适当的抗凝剂；将采集后的血液放在架子上再放入37C水浴中1h,待充分凝固后再离心分离血清。3操作中的因素3.1加样孵育前加样时间过长， 酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时， 滴加的角度不同和挤压 的力度不同，致使滴加的试剂

17、量不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样 本一个移液头，防止交叉污染。3.2温育温育是ELISA测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37C和室温，其次是 43C和28C。目前国内售 ELISA 试剂盒温育时间为 37C , 30 min1 h, 进口 ELISA试剂盒则通常为 37C, 12 h能有较完全的结合。2.1温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔

18、板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37 C需要一定时间，如果是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。控制方法：如有两种温度，尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件；用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。2.2边缘效应”的排除边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中，夕卜周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。3.3洗板ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之 间液体易交叉，采用半自动洗板机时， 洗液量不足导致洗板不彻底，洗板针堵塞导致抽吸不完全，洗板不畅导致清洗效果差。控制方法：手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；为了洗涤效果好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板12次，或适当增加洗板的次数，有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果。3.4显色市售ELISA试剂盒中，如以四甲基联苯胺 （TMB）为底物，则提供的底物为 A和B两 瓶应用液；如以邻苯二胺（OPD）为底物，则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂。显色反应条件 为