流式细胞仪检测HLAB27抗原在强直性脊柱炎诊断中的意义

1、流式细胞仪检测HLAB27抗原在强直性脊柱炎诊断中的意义摘要：目的 经流式细胞仪 (FCM)检测外周血 T 淋巴细胞表面抗原，探讨其在强直性脊柱炎诊断中的临床意义。方法分别用流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测外周血T 淋巴细胞表面抗原并进行对比。结果 流式细胞仪检测 86 例强直性脊柱炎患者标本，79 例阳性，微量淋巴细胞毒法检测为 76 例阳性。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测抗原无显著性差异。结论 通过流式细胞仪检测抗原，方法简便，稳定性好，重复性高。关键词：抗原；流式细胞仪；强直性脊柱炎强直性脊柱炎 (ankylosingspondylitis,AS)是一种原因未明的疾病， 病变主要累及中

2、轴骨骼和肌腱韧带骨附着点的慢性炎症性疾病1。早期以慢性双侧骶髂关节炎为特征，晚期骨突关节融合，韧带赘形成，脊柱韧带钙化，导致脊柱从颈到骶骨完全强直。 一般患者要在发病后7 年左右才能被诊断， 早期诊断有助于早期治疗，防止致残。研究发现与 AS的相关性是迄今为止所知的HLA与疾病相关性最强的， 其相对危险度达 , 超过 90%的 AS患者其抗原表达阳性，普通人群中仅5 %10%为阳性。人群中亚型的研究和转基因动物模型的建立都有力地证实了分子在 AS发病中的重要作用 2。本文采用荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的抗原相结合，通过流式细胞仪检测外周血T 淋巴细胞的表达，并与微量淋巴细胞毒法进行比较。1

3、对象与方法1. 1检测对象20XX 年 5 月 20XX年 5 月本院门诊及住院AS患者 86例，男 74 例, 女 12 例 , 年龄 1360 岁 , 均符合 AS诊断标准；病程3 个月 9 年,排除其它疾病。健康对照组40名,男28名,女12 名, 年龄1558 岁。1. 2方法1. 2. 1 流式细胞仪法： 染色步骤 : 采静脉血 1 ml, 肝素抗凝。取 30 l抗抗 CD3 PE抗体于试管中 , 加入 50 l 抗凝血，混匀，室温避光孵育 15 min。然后加入 110 稀释的裂解液 2 ml，避光 10 min，待红细胞完全溶解后，立即 300 r/min 离心 5 min ，弃

4、上清，用 PBS洗涤 1 次，同上离心后弃去上清。加入 300 l PBS重悬细胞，以备上机检测。 FCM检测：先用 CaliBRITEbeads 和调试机器，并通过试剂批号的后缀确定界值（ decisionmaker）的位置。在BD公司的自动软件下获取15 000个细胞，检测其中的T 淋巴细胞荧光强度 , 进行数据自动分析。微量淋巴细胞毒法：抽取检测对象静脉血4 ml ，肝素抗凝。用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞,Hanks液清洗3 次 , 将细胞浓度调整至。取1l细胞悬液加于板的抗体孔上，30 min后加5 l的补体，室温孵育60 min。用 5%伊红溶液5 l染色2 min，甲

5、醛固定 ,4过夜，次日于倒置显微镜下观察阳性率。 死细胞比例 020%计为 2 分，30% 40% 为 4 分， 60%80%为 6 分， 80%100%为 8 分。结果判定如下：阴性对照孔为 2分，阳性对照孔为 8 分，符合此条件者为有效结果；孔为 4分或 4分以上阳性， 4 分以下为阴性。统计学处理采用 SPSS 11. 0统计软件包分析。2结果自动软件首先通过点图 , 区分经裂解红细胞处理后外周血中淋巴细胞、粒细胞和单核细胞三个细胞群。 然后在点图上确定 CD3强阳性细胞群体的位置 , 自动设定一个 CD3+T 淋巴细胞门， 以去除体积过大或过小的细胞，确保门内至少有 50%的细胞为 C

6、D3+ T淋巴细胞 , 根据双参数 , 可将随后进行的分析定位于T 淋巴细胞。软件随后计算门内细胞抗信号的平均荧光强度， 并与界值比较，如果小于仪器设定的界值，为阴性 , 如大于 ( 或等于 ) 设定的界值为阳性。通过流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者共 86 例，其中阳性 79 例，阳性率为 % 。健康对照组 40 例，其中阳性 4 例，阳性率为 10%。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法分别同时检测外周血T 淋巴细胞抗原，经 2 检验，两种检测方法检测抗原无显著性差异，详见表1。表 1流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测结果比较（略）3 讨论强直性脊柱炎是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学资料显

7、示 ,本病的发病高峰年龄为2030 岁, 40 岁以后发病少见 ,男性比女性多见。过去认为 AS是一种较少见的脊柱疾病,随着风湿病学在我国的起步和发展,认识到本病在国内并不少见。 由于本病起病缓慢而隐匿,首发症状多为十分常见的临床症状腰痛或外周关节痛,临床上容易误诊。自开展检测以来 ,临床误诊明显减少，诊断准确率提高。目前检测的主要方法有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫法、流式细胞术、PCR 法等。酶联免疫法适合大批标本检测，结果重复性好 , 但步骤稍显繁琐。微量淋巴细胞毒法最为常用，这种方法尽管其操作简便准确性尚可， 但仍受细胞纯度、 补体差异、单抗效价及 HLA高度多态性的影响，易出现漏诊或假

8、阳性 3。流式细胞术是一种快速、简便、准确的检测的方法 ,其过程可自动进行 ,每分析一份标本只需30 min ,分析的值可被量化 ,明显减少了人为因素影响。利用荧光标记的抗的单克隆抗体和淋巴细胞表面的抗原结合 , 激光照射细胞表面抗原结合的荧光抗体 , 使其发出荧光，这种荧光的强度可通过流式细胞仪测得的通道值反映。根据通道值的高低判断抗原阳性或阴性。但应注意的是由于其检测的是淋巴细胞表面的抗原 , 该表面的抗原可受感染等因素影响使分子的数量或结构改变而出现假阴性 ; 同时又由于存在抗体交叉性反应，导致可能出现假阳性。 本实验表明流式细胞术快捷、 简便、省时且稳定性和重复性皆优于微量细胞毒试验 , 当根据临床症状、体征及 X 线检查怀疑为 AS时 , 外周血 T 淋巴细胞可作为早期诊断及支持临床的重要指标。【参考文献】1Van Dev LS, Can Der HD. AnkylosingspondylitisJ.Clinicalfeatures,Rheum Dis Clin North Am , 1998, 24 (4) : 663.2rats J. Int