仪器分析笔记《高效液相色谱分析》

1、第二章高效液相色谱分析§ 2高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较经典液相色谱法高效液相色谱法色谱柱长inm1002000100250柱內径/mm10 5036填料粒径屮m75 600310柱刖压力mpa0.001 0.1220柱效（理论塔板数）/m2502x1035x104进样量/g110106 10-2分析时间/h1200.05-1.02、与气相色谱法比较气相色谱法高效液相色谱法对样品要求容易气化或裂解有适当的溶剂溶解流动相惰性气体 动力粘度10-pa-s 柱前压力230mpa极性、非极性液体及缓冲溶液 动力粘度10-3pas 柱前压力0

2、.1-0.5mpa固定相种类较多 粒度 0.10.5mm种类较少 粒度310ym色谱柱（内径 xz）nnnxm填充柱14x 13 毛细管柱0.25 0.5x10100填充柱056x003 毛细管填充柱0 03 0.05x0.15 0一5柱效（理论塔板数）.，m103 1041(/io：柱温/匸室温300室温60分离过程中的作用固定相组分固定相组分流动相分曷机制吸附、分配吸附、分配、离子交换、凝胶阻影响分罔 的重要因 素组分在气相中的扩散系数大， 104cm2/s；柱温影响很大温300）； 柱外效应及死体和影响较小组苓在液相中的扩散系数很小，10?cm2 s；柱温影响很小理温60）；柱外效应及死

3、体积影响很大检测器通用型：tcd、fid 专用型：ecd、fpd、npd 最高灵敏度:io-ug通用型：elsd、rid专用型：uvd、pdad、ed、ecd 最高灵敏度：1042g应用氾围永久性气休；350°c低沸点化合物（分 子量：110?）;易裂解的高分子化合物 （分子量：10210彳）； 可用于制备。曷子型化合物；高分子量、高沸点化合物（分子量：503 x 103）；高分子、生命活性化合物（分子量： 103 106）；难用于制备3、高效液相色谱法的发展a、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。口前，出现使用 l.oym填料的超高压液相色

4、谱。b. 流动相变化目前，出现120220°c超热水为流动相、fid和fpd检测器的hplc。c、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及hplc与ms、nmr、ir联用的 多维液相色谱法。4、高效液相色谱法的特点 高压:采用高压输液设备，（150350） x 105 pa 高速：分析速度快； 高效：柱效很高。（n>30000）,可以在数分钟内完成数百种物质的分离； 高灵敏度：10 9g （uv）； 10_,g （荧光检测）。5、高效液相色谱法的局限 溶剂用量太大; 缺乏诸如气相色谱使用的tcd、fid通用型检测器; 不能替代气相色谱法,难分离化合物（柱效1

5、0万以上），必须使用毛细管气相色谱法进行分离; 不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kpaimpa压力。§ 2.2彰啊色避嵯矿度孚色港金賈驹亘赛（工解）高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于 流动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的彫响讨论如下：uc cl2 c a m p * smd5-mm高效液相色谱的范氏方程：/ = 2阿+少 +若将上式简化，可写作:h = a + + cuu这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。1、涡流扩散项比=2祕 式中

6、2：填充不规则因子；dp：填料平均直径。e它与载体流速无关；愆 若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则2t0=>h,t0=>柱效高；若填充不均匀， 几产=> 巴/ =>柱效低。2、纵向扩散项u式中cd：常数；2”：扩散系数；流动项的线速度。e由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小45个数量级，因此在液相色谱中,当流动相线 速度大于0.5 cims"时,这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的,而气相色 谱法中这一项却是重要的。3、传质阻力项（1）固定相传质阻力项式中c ：与k （容量因子）有关的系数；df：固定液厚度；ds：扩散系数。固定相引起峰扩展

7、解决办法： 液液分配色谱：使用薄的固定相；吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。（2）流动相传质阻力项流动的流动相中的传质阻力项cdh貯%式中5 常数（与£有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）; % 流动相中扩散系数；dp：为填充物的平均直径。滞留的流动相中的传质阻力项hsin“原因：多孔固定相造成的部分流动相滞留。% =2式中常数（与颗粒微孔中被流动相所山据部分的分数及容量因子有关）。固定相的粒度to =其微孔孔径too =传质途径to =传质效率t8 =柱效= too。2. 2.2 液相色谱的h-u曲线1、液相色谱与气相色谱h-u1 .b/u 2.cu 3.a 4.

8、hplc 的"初 5.gc 的 hplc板高h比gc小一个数量级，说明hplc柱效高； 对于hplc,为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。2、降低h,提高柱效的方法 减小填料粒度； 减小填料孔穴深度； 用低粘度溶剂作流动相； 釆用低速流动相（通常：=1 ml.min）。§2.3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理（理解）粮駆固麺和曲机錘的不面厂浚廂笆谱法可芬乳1、液液分配色谱法（llc）2、液固吸附色谱法（lsc）3、离了对色谱法（ipc）4、离子交换色谱法（iec）5、离子色谱法（ic）6、空间排阻色谱法（sec）2. 3.1液一液分配色谱及化学键合相色谱全多孔型担体

9、表面多孔型担体1、液一液分配色谱基于组分在两相间的分配容量因子力的差异而实现分离的。 a、固定相：载体+固定液 0,严氧二丙月青聚乙二醇异三十烷（角鲨烷）b、c、载体：硅胶；分类：根据固定液和流动相（溶剂）的极性不同，可分为正相液液分配色谱和反相液液分配色谱。e为了避免固定相流失，固定相和流动相极性要相差大。（与gc不同，gc：极性相似相溶）愆分析对象与固定液极性一致;/正相色谱：固定液为极性，流动相为非极性（固定逻极性流动相极性）；z反f片色豎丄保書普经21丄“厂比0、甲醇等使用方便；价格便宜固定液为非极性，流动j由于液一液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。d、原理:由于试样

10、组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。当 达到平衡时，物质的分配同样服从下式：c v«=厶=2g vs式中k：分配系数；k：容量因子；c,：溶质在固定相屮的浓度；c,j溶质在流动相屮的浓度；%：流动相体积；%固定相体积。e分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，后岀峰；e液相色谱法中，流动相的种类对分配系数有着较大的影响。e、应用：液一液色谱能分离多种类型化合物，如烷怪、烯怪、芳怪、染料、番族化合物等。2、化学键合固定相色谱通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。这种固定 相避免了固定相流失，大大改

11、善了固定相功能，适用于梯度洗脱，分离选择性大大增加。e 化学键合相色谱的出现，是hplc的重大突破；e 化学键合色谱是hplc最常用的固定相，大约占hplc固定相的四分之三；愆它适用于分离几乎所有类型的化合物。2.3.2 液一固吸附色谱法流动相：液体，固定相：吸附剂1、原理：基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分离的。组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附。2、固体 极性的硅胶（应用最广）； 氧化铝； 分子筛； 非极性的活性炭。3、应用： 分离几何异构体； 分离含极性基团相同但数目不同的试样，但不能用于分离同系物; 分离具有屮等分子量的非极性或极性的、非离子型的油溶性样品。4、

12、缺点:由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象2. 3. 3 离子对色谱法分离强极性的有机酸、碱存在的问题:用正相色谱：保留值太大、峰拖尾, 用反相色谱：保留太小其至不出峰!口离子对色谱法1、定义：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对电子或反电子）加入到流动相或同定相中，使其于溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行 为。2、分离机理离子对色谱的分离机理有不同的假说，现以离子对分配机理说明：在色谱分离过程中，流动相待分离的有机离子x（也口j以是带负电荷的离子）与固定相或流 动相中带相反电荷的对离子y结合，形成离子对化合物x+y ,然后在两相中分配：e由于离子对疏水性

13、质不同，导致各组分保留时间不同； 愆离子对试剂：分析碱t烷基磺酸钠；分析酸一四丁基季胺盐。2. 3.4 离子交换色谱法1、固定相：离子交换树脂流动相：水缓冲溶液；甲醇；乙醇+水缓冲溶液2、原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离了交换：rso3h+m' =rso3m+ h +阴离子交换：rnr40h+x= rnr4x+oh-3、适合于分析： 在溶液中能形成离子的组分 有机物和生物物质，如：蛋口质、氨基酸、核酸等的分离。2. 3. 5 离子色谱法离子色谱以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析

14、对象,近30年有了迅速发展。1、离子交换色谱存在问题：用电导检测器检测，流动相是强电解质，强背景完全掩盖待测离子信号。2、抑制柱：使高背景电导的流动相转变为低背景的流动相。nrh淋洗液阴h養子» 交换树脂 1975年small提出在离子交换柱后，再串结一根抑制柱。抑制柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。如：分析阴离子样品br, naoh为流动相；抑制柱为rh+；為窓母阳黴阴）离子交换树脂t亟声ml通过抑制柱后：naoh +rh* ->h2o +rnanabr +rh+ -> hbr +rna“由于h十淌度为na+的7倍，捉高了检测的灵敏度；/ ic述可以分析氨基酸、

15、糖类及冇机阳离子；/由于抑制柱要定期再生，现代ic中，多采用在离子交换柱后接抑制器来实现以上目的。3、阴离子分析示例：七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离各组分含量：350 ppm；05(a)10图1520 min 04812 bin（b）七种标准阴离子分离谱图|2. 3. 6 空间排阻色谱法（凝胶色谱法）根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术1、分离原理：“固定相凝胶内有一定大小的孔穴；/分子体积犬的不能渗入孔穴而被排阻，较早被淋洗出來；2、分离范围:/小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。相对分子质量20002000000之间合成高分子的分子量（分布）的测定。3、空间排阻色谱的特点： 可提供

16、分子尺寸、结构信息;易检测保留时间短，峰窄，可采用低灵敏度检测器; 柱寿命长固定相与分子间作用力弱; 分了质量差别大于10%才能分离。g总结：选择色谱分离方法的一般原则易挥发、分子量v 200的样品：gc ； 分子量在2002000的样品：hlpc ； 分子量 >2000 : gfco；§2.4液相色谱固定相（了解）2.4.1 液一液色谱、键合相色谱及离子对色谱固定相1、担体（1）全多孔型担体4由直径为510屮n的硅胶微粒凝聚而成；丄颗粒细，孔较浅，传质速率快，柱效高；4是目前应用最广泛的担体。（2）表层多孔型担体丄 实心玻璃球（3040pm ）外面覆盖一层多孔活性材料； 丄

17、孔层厚度小、孔浅，出峰迅速、柱效高；多孔层厚度薄，容量低。2、化学键合相固定相：/硅氧烷型键合相应用最广泛。/ 十八烷基键合硅胶（octadecylsilanc, ods , c18）最常用 制备:sic18h37-si oh-si-oh + ci8h37sicl3一 si oh正和色谱代表性固定相：改性硅胶、鼠基柱；反相色谱代表性固定相：c18； c8；反相色谱是当今液相色谱的最主要分离模式。探 化学键合固定相特点： 固定相传质很快。表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多 固定液不易流失，柱寿命长。由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，增加色谱柱稳定 性和寿命。 可以键合不同官能团，提高

18、了应用范围和选择性。 特别适合于梯度洗脱，有利于高灵敏检测和收集馆分。2. 4. 2 液一固吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱固定相1、液一固吸附色谱法固定相/硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。/常用510微米的硅胶微粒。2、离子交换色谱固定相（1）薄层型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相3、空间排阻色谱固定相（1）软休凝胶（2）半硬质凝胶（3）硬质凝胶§2.5液相色谱流动相（了解）hplc流动和是液体，选择余地大；它参与固定和对组分的竞争（与gc不同）。1、对流动相溶剂的要求是:（1）能溶解样品，但不与样品反应。（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。（3）粘度要尽可能小（保证

19、高的渗透性和柱效）（4）与所用检测器相匹配。（5）高纯度、易精制、价格尽量便宜。e正相色谱代表性流动相：正己烷。愆 反相色谱代表性流动相：甲醇/水、乙月青/水、水和无机盐的缓冲液2、在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据常用溶剂的极性顺序：水（最大）甲酰胺乙睛里蟹乙醇丙醇内酮二氧六环四氢咲喃甲乙酮正丁醇 乙酸乙酯乙瞇异内储 1氯甲烷氯仿渙乙烷菲四氯化碳二硫化碳环己烷己 烷 煤油（最小）在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液液分配分离时：首先选择 中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增 加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。19高

20、喷權相色谱仪结悔肓址圏:§2.6高效液相色谱仪（了解）贮液器 咼压泵 梯度洗提装置进样器色谱柱检测器恒温器 色谱工作站2.6. 1 高压泵1、作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱柱hplc柱径较细，所填固定相粒度很小，对流动相的阻力较大，高压泵可使流动相能较 快地流过色谱柱。2、工作压力:150x10m50x 105pa,流量可调3、分类：恒流泵和恒压泵（1）往复式柱塞泵;（2）气动放大泵。2. 6. 2梯度洗提1、原理：用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，使流动相的强度、极 性、ph值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度

21、洗提装置所起的作用与gc中的程序升温十分相似。区别： 梯度洗脱：通过改变流动相极性、ph值和离子强度等改变k值； 程序升温：通过改变温度达到改变&值的目的。2、梯度洗提特别适合复杂样品的分离2. 6. 3 进样装置1、注射器进样装置（停留进样，性麻烦；不准，重现性差）2、高压定量进样阀通过六通阀直接向压力系统进样，不必停止流动相流动。 由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复好。进装入样品谱柱采样环3、六通阀工作原理:(体积小于进样器)采样状态诳祥状态对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线性范宽、死体积小、噪声小、响应快。2. & 4 色谱柱 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制

22、成；为了使工作压力不致过高，柱长比较短。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm,长25cm。柱内装有510pm的填料填充方式：干法填充、湿法填充2. 6. 5检测记录系统hplc常用的检测器有:紫外检测器荧光检测器示差折光检测器电导检测器蒸发光散射检测器(1)紫外检测器检测原理同uvvis方法一样。采用微量吸收池：光程为210mm,体积约为110)il。 hplc中约有80%的物质可在254nm或280nm处产生紫外吸收。要求：溶剂必须能让所选择的光透过。i接色谱柱光电倍增管废液i二极管阵列检测器(diodearray detector, dad,或 pda) 二极管阵列检测器快速、方便，近

23、些年应用普及。 dad无需停留扫描，可观察色谱流出物的动态光谱。 经计算机处理可以得到三维色谱一光谱图。光电二极管阵列检测所获得的三维色谱光谱图(2)荧光检测器(fluorescence detector)利用试样的荧光特性來检测。灵敏度比uv检测器高23个数量级。特别适合的物和生物化学样品分析：稠环芳坯、氨基酸、蛋口质、酶局限性：应用范围窄(3) 示差折光检测器(ri) 依据样品组分与流动相对光的折射率不同来检测 特点'是-种通用型检测器；灵敏度低(低uv等13个数量级)；温度要求严格，不能用于梯度洗提；应用：无紫外吸收的有机物、高分了化合物、糖类、脂肪烷姪凝胶色谱必备的检测器，也常

24、用在制备色谱屮。不镌钢底板光源i液休 流动相(4) 电导检测器(electrical conductivity detector)离子色谱必备的检测器根据物质电离后产生电导变化來测定电离物质含量。主要部件：电导池特点和要求： 需恒温，不能用于梯度洗提 ph>7,不灵敏，(5) 蒸发光散射检测器(elsd) 基于溶质的光散射性质的检测器构成：雾化器、加热漂移管、激光光源和光检测器原理： 色谱柱流出液雾化后通过加热漂移管; 流动相屮溶剂被蒸发，留下溶质； 激光束照在溶质颗粒上产生散射光； 散射光信号t电信号。 特点和应用：/ 属通用型检测器。“ 适合于无紫外吸收、无电活性和无荧光发射样品的检

25、测。/ 优于ir：信噪比高，可梯度洗提hplctt蒸发激光散射检测器工作原理示意图表2-6-1 hplc中常见检测器的基本特性检测器检测下限/（0ml）线性范围选择 性梯度 淋洗主要特点紫外可见光io-10l(p-104有可对流速和温度变化敏感；池体 积可制作得很小；对溶质的响 应变化大。荧光10上103103有可选择性和灵敏度高；易受背景、示差折光l(h7104无水口可检测所有物质； 不适合微量分析； 对温度变化敏感物质电导10103有不可离子性物质通用检测器, 受温度和流速彩响,田>ti-纭发光散 射io-9无可可检测所有物质。§2.7高效液相色谱分离类型的选择（了解）2.

26、 7.1 色谱分离类型的选择1、根据相对分子质量选择 200以下-气相色谱法 2002000-液固吸附、液液分配和离子交换色谱法。高于2000 ->凝胶色谱法2、根据溶解度选择水溶性样品-> 离子交换和液液分配色谱法；微溶于水、易电离样品-用离子交换色谱法;油溶性或相对非极性样品-液固色谱法。3、根据化学结构选择异构体的分离-液固色谱法；同系物和具有不同官能i才i化合物-> 液一液分配色谱;生物大分子或高分子聚合物-> 凝胶色谱法；离子基团和能电离基团组分-> 离子交换色谱。表2-7-1液相色谱分离类型选择参考表分子量水溶性>2000可溶不涪不溶<20

27、00可溶但不解离可溶且不解离可溶离子或非藹子方法流动相排阻色谱水排阻色谱水分配色谱（同系物）各种吸附色谱（异构物）各种排阻色谱（分子大小）各种反相液液色谱各种排阻色谱水阳离子交换色谱（碱）缓冲液阴离子交换色谱（酸）缓冲液反相蛊子色谱缓冲液；§2.8高效液相色谱应用实例（了解）2. 8.1高效液相色谱应用领域与分析对象举例领域分析对象举例环境常见无机阴阳咼子、多环芳姪、多氯联苯、硝基化合物.有害重金属 及其形态、除草剂.农药、酸沉降成分。衣业土壤矿物成分.肥料.饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。石油姪类族组成、石油中微量成分。化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤

28、剂成分.化妆 品、染料。材料液晶材料.合成高分子材料。食品无机阴阳禺子、有机酸.氨基酸.糖.维生素.脂肪酸.香料、甜味 剂.防腐剂.人工色素.病原微生物.霉菌毒素.多核芳坯。生物氨基酸.多肽、蛋白质、核糖融.生物胺.多糖、酶、天然高分子 化合物。医药入休化学成分、各合成药物成分.各种天然植物和动物药物化学成分。§2.9液相制备色谱（了解）冇机复杂样品的组成、结构分析时常需要纯化=制备色谱成为最冇力的手段 制备色谱：以色谱技术来分离、制备较大量的纯组分2. 9.1液相制备色谱的特点与优势1、与分析色谱的区别:柱容量大 冇组分收集器2、用hplc制备的优势:分离条件温和 一般不破坏试样

29、有利于试样收集2. 9. 2 液相色谱制备的几个主要问题1、色谱柱容量制备柱比与分析型柱柱容量要大。 分析型柱：内径：4.6 mm 制备柱： 内径：10mm, 20 mm , 50 mm. 一次可以制备0.1lmg纯品e 制备色谱主要限制之一：进样量 w柱效t0 =分离度t0 ;2、液相制备色谱方法：在分析型hplc试验，优化，试出最大允许量。3、液相制备色谱仪检测器后增加自动帼分收集器；可将试样组分按顺序收集在玻璃管内。§2.10毛细管电泳（ce） （了解）2.10.1 毛纠9管电泳的基本原理与仪器装置1、基本原理电泳：在电场作用下，带电粒子在介质屮定向移动。毛细管电泳：利用被分析离子在电场作用下移动速率不同而达到分离目的。 ce分析对象：在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。它有多种分离模式可以分离离子和中性分子可以采用hplc中的各种检测方法（1）经典电泳的局限性电场强度低：离子迁移速度慢，分离吋间长，组分扩散严重，分离效果差。焦耳热使组分扩散严重（电泳电流大）。（2）高效毛细管电泳在技术上的两项重要改进：采用了极细内径的毛细管（2575pm）,减小了焦耳热导致峰扩展（毛细管散热效率高）采用了数