Westernblotting蛋白免疫印迹实验

1、1会计学Westernblotting蛋白免疫印迹实验蛋白免疫印迹实验 WB的基础一一2 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二31.WB的概念2.WB的应用3.WB的原理4.WB的特点 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二4567891.试剂2.耗材3.设备 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二u甲叉双丙烯酰胺uTrisHCLuSDS10u过硫酸铵uTEMED2.1 试剂11uSDS-PAGE loading Bufferu封闭液uECL显影液2.1 试剂12131415u离心管u烧杯

2、u96孔板uPVDF 膜u海绵垫16u垂直电泳仪u化学发光成像系统u台式离心机17u高压灭菌锅u电子天平u电热恒温鼓风干燥箱18u磁力搅拌器u4、-20冰箱19201.实验步骤2.结果分析3.注意事项 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二蛋白样品制备蛋白含量测定21在六孔板中，按照一个孔添加150L的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量说明：通常6孔板

3、每孔细胞加入150L裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200L或250L。23管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/mL)01246810蒸馏水(L) 10986420待测样(L) 10BCA工作液(L)200200 200 200 200 200 200200f).用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量。24所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。25上样缓冲液的作用SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构在强还原剂（-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键

4、断裂蛋白质(SDS-蛋白质复合物)-PAGE胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸铵的作用下聚合，形成胶。26清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳27 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶 配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拨出。（插梳子时

5、要使梳子保持水平。） 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳28测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4。加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样

6、品溢出。）清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。2930清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，平衡至少5min。（转膜液可回收）打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫31转膜条件：45V，1.5hu 用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭(26,80rpm/min, 2-4h)。32u弃

7、封闭液，加入用Western一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液, 置于4杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h)33u回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次(置于振荡培养箱中,26,80rpm/min,10min/每次)u弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h); 34放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物 呈色DAB35404142 WB的基础一一43 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二没信号 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？重新进行实验，

8、重新稀释抗体； 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策。背景过高目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；转膜效率过低。44 在目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高

9、TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500nM； 杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间。有杂带目的带弱4546玻璃未洗净过硫酸铵和TEMED加量过多可导致胶凝固过快而使胶不平加入试剂后未摇匀，导致局部聚合剂浓度过高，聚合较快而使胶不平加入不均匀，应注意手法灌胶后应进行压胶(可用水或正丁醇)温度会影响胶聚合，若受热不均匀，也会影响胶聚合不均匀。47 微笑是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。 “倒微笑“也称“皱眉”现象常常是

10、由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象 ；中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。48玻璃板需用洗洁精洗后再用双蒸水冲洗，晾干配胶时应沿管壁缓缓加入各成分，用手轻轻摇匀；若用枪头吹打需缓慢且不要打到头倒胶时，用枪沿一侧缓缓加入，不要打到底，以免带入气泡封胶时，可用200L枪加水，减小压力，以免把胶冲起室温制胶时，由于温差及凝胶聚合反应放热可产生气泡分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子49试剂：uSDSuRIPA裂解液

11、u丙烯酰胺u甲叉双丙烯酰胺uTEMEDuECL显影液u封闭液uTrisHCLu过硫酸铵uSDS-PAGE loading Buffer50耗材：u离心管u烧杯u96孔板uPVDF 膜u海绵垫u移液枪/枪头u滤纸u蓝盖玻璃瓶u量筒u容量瓶设备：u台式离心机u化学发光成像系统u垂直电泳仪u电热恒温鼓风干燥箱u电子天平u高压灭菌锅u磁力搅拌器u4、-20冰箱5152在六孔板中，按照一个孔添加150L的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Wes

12、tern和免疫沉淀等操作5354管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/ml)01246810蒸馏水(L)10986420待测样(L)10BCA工作液(L)200200200200200200200200配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品、待测样品和工作液按表1加入到96孔板中，混匀。在37烘箱中温浴30min，冷却至室温。酶标仪562nm波长下测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量清洗玻璃板配胶上样

13、电泳玻璃板对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶配分离胶，加入TEMED立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置，胶上加一层水，液封后胶凝的更快。（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。（插梳子时要使梳子保持水平）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。） 测完蛋白含量后，计算含50m

14、g蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4。 加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）停止电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。55ComponentVolumeddH

15、2O3.3ml30%丙烯酰胺溶液4.0 mlTris-HCl(1.5M,pH8.8)2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.004mlTotal10ml12%分离胶配方ComponentVolumeddH2O2.7ml30%丙烯酰胺溶液0.67 mlTris-HCl(1.0M,pH6.8)0.5ml10%SDS0.04 ml10%AP0.04 mlTEMED0.004 mlTotal4.0ml5%浓缩胶配方56剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，平衡至少5min。（转膜液可回收。）打开电转印夹，在

16、黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫57用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭(26,80rpm/min, 2-4h)。弃封闭液，加入用Western一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液, 置于4杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h)转膜条件：45V，1.5h58回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次(置于振荡培养箱中，26，80rpm/min，10min/每次)弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交(26，80rpm/min，1h)弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡培养箱中，26， 8

17、0rpm/min, 10min/每次）；ECL工作液的配制：等体积混合Detection reagent 1和Detection reagent 2现配现用。根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。利用化学发光系统采集图像和进行图像分析。59 WB的基础一一60 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二u甲叉双丙烯酰胺uTrisHCLuSDS61u离心管u烧杯u96孔板uPVDF 膜u海绵垫62清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳63 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶 配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拨出。（插梳子时要使梳子保持水平。） 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，