农作物组织培养

1、第八章第八章 主要农作物的组织培养主要农作物的组织培养 以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且周期长周期长植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面离体无性系的快速繁殖离体无性系的快速繁殖培养无病毒种苗培养无病毒种苗 新品种的选育新品种的选育人工种子和种质的保存。人工种子和种质的保存。第一节第一节 农作物组织培养的意义、方法与应用农作物组织培养的意义、方法与应用 对繁殖系数

2、低的“名、优、新、奇、特”植物品种的推广，兰花、安祖花、马蹄莲、甘薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、非洲菊等经济植物已开始工厂化生产 植物脱毒苗木培育植物脱毒苗木培育 脱毒后的马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉等植物可大幅度提高产量，改善品质，兰花、水仙、大丽花等观赏植物脱毒后植株生长势强，花朵变大，产花量上升，色泽鲜艳 植物新品种培育植物新品种培育 基因工程育种（抗虫棉、抗除草剂大豆、玉米），单倍体育种-烟草单育1号、水稻“中花8号”、小麦“京花1号”，远缘杂交幼胚早期培养，原生质体融合技术，选择细胞突变体 植物种质资源的离体保存植物种质资源的离体保存 超低温离体保存植物种质，可节约大量的人力、物力和土地，

3、还可挽救那些濒危物种 人工种子人工种子 为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段第二节第二节棉花组织培养棉花组织培养 一、大量元素（一、大量元素（20倍）母液倍）母液 (g/L)药品摩 尔 浓度（M/L）质量浓度（g/L）5L母液所需质量（g）备注KNO30.3838190 MgSO40.033.8/7.4(MgSO47H2O)19/37 KH2PO40.0253.417 CaCl20.066.6/8.8(CaCl22 H2O)33/44单独溶解，最后加入二、微量元素（二、微

4、量元素（100倍）母液倍）母液 (g/L) 药品质量浓度(g/L)备注 5倍母液H3BO33.1加热助溶MnSO44H2O（或MnSO4H2O）11.15（或8.45） ZnSO47H2O4.3 20倍母液CoCl26H2O0.05 CuSO45H2O0.05单独溶解，最后加入KI1.66 NaMO42H2O0.5 微量元素二级母液（即我们平时配培养基时使用的微量）：取上述母液200ml，母液50ml，加蒸馏水定容至1L。 铁盐母液配制（所用试剂均为国药产品）铁盐母液配制（所用试剂均为国药产品）B5有机物配制有机物配制 （所用试剂均为（所用试剂均为sigma产品）产品）药品摩尔浓度（M/L）

5、质量浓度（g/L）备注FeSO47H2O0.012.78 Na2EDTA0.013.73加热助溶药品100ml所需质量（g）500ml所需质量（g）备注VB1（硫胺素）15 VB6（盐酸吡哆醇）0.10.5NaOH助溶VB3（烟酸）0.10.5NaOH助溶加入VB6和VB1后加部分水，再加入VB3，再次加水，容量瓶定容各种激素配制（所用试剂均为各种激素配制（所用试剂均为sigmasigma产品）产品） 质量浓度（g/L）备注2,4-D0.1无水乙醇助溶6-BA1 NAA1 L-Gly（甘氨酸）2国药产品肌醇10 IAA0.5 IBA0.5NaOH助溶KT0.5NaOH助溶/盐酸助溶*NH4NO

6、3165国药产品 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 0.5-1cm的下胚轴切段接种于诱导培养基上，一个皿放25-30段下胚轴。一个月后挑选两端膨大，生长正常的下胚轴继代到新的IBA培养基上 非胚性愈伤组织的增殖非胚性愈伤组织的增殖 由于愈伤组织的进一步膨大，一个皿中以20段下胚轴为宜 愈伤组织的分化愈伤组织的分化 愈伤组织经继代（一个月继代一次）几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上，进一步分化成胚状体 成苗生根培养成苗生根培养 将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上 炼苗移栽炼苗移栽 将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一

7、周左右移栽大田棉花下胚轴棉花下胚轴组织培养过程组织培养过程棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生 A1：下胚轴外植体；：下胚轴外植体；A2-A4：胚性愈伤组织在腺体处发生；：胚性愈伤组织在腺体处发生；B1：愈伤组织表面的胚性细胞；愈伤组织表面的胚性细胞；B2-B4：愈伤组织表面形成胚性组织：愈伤组织表面形成胚性组织棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生 A：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚(箭头所指箭头所指)；B：具胚柄的多细胞原胚：具胚柄的多细胞原胚(

8、箭箭头所指头所指)；C：具胚柄的体胚；：具胚柄的体胚；D-G：与愈伤组织粘连的体胚；：与愈伤组织粘连的体胚；H-I：游离的体胚：游离的体胚棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育A：培养当天；：培养当天；B1-B2：培养：培养7 d；C1-C3：培养：培养14 d；D1-D3：培养：培养21 d后出现球形胚；后出现球形胚；E1-E3：心：心形胚阶段；形胚阶段；F1-F3：鱼雷形胚阶段；：鱼雷形胚阶段；G1-G3：子叶胚阶段：子叶胚阶段棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化A：球形胚表皮原形成；：球形胚

9、表皮原形成； B：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；C：内部等轴：内部等轴细胞轴向延长形成的心形胚；细胞轴向延长形成的心形胚；D-E：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；F-G：具：具有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；H：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；I：具有：具有Y形微管组织的子叶胚形微管组织的子叶胚棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚棉花单个胚性细胞团培养

10、中不同发育阶段的体细胞胚A1-A6：球形胚；：球形胚；B1-B6：心形胚；：心形胚；C1-C6：鱼雷形胚；：鱼雷形胚；D1-D6：子叶胚：子叶胚第四节第四节 玉米组织培养玉米组织培养主要内容：主要内容： 植物组织培养的意义植物组织培养的意义. 玉米组织培养的目的玉米组织培养的目的. 研究进展研究进展. 目前玉米组织培养的主要目前玉米组织培养的主要方法方法. 植物组织培养的意义植物组织培养的意义 植物组织培养可以生产大量的优良无性系植物组织培养可以生产大量的优良无性系. 细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍杂交不亲和性障碍. 可获得单倍体、三倍

11、体及其它多倍体、非可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体整倍体. 组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料分析研究的理想材料.玉米组织培养的目的玉米组织培养的目的 玉米组织培养的目的是让外植体能够高频玉米组织培养的目的是让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效率地诱导出愈伤组织，建立高效 的体细胞的体细胞再生体系再生体系 ，为玉米遗传转化和细胞工程研，为玉米遗传转化和细胞工程研究创造有利条件究创造有利条件 。玉米组织培养的研究回顾玉米组织培养的研究回顾 LarueLarue在在 1949年用甜玉米的胚乳作外植体年用甜玉米的胚乳作外植体，

12、首首次诱出玉米愈伤组织次诱出玉米愈伤组织，但未获得再生植株但未获得再生植株 。 1975年，年，Green和和Phillips首次用首次用A188的幼胚作的幼胚作外植体外植体，诱导出二倍诱导出二倍 体体 愈伤组织愈伤组织 ，并再生得，并再生得 到第一株无性系植株。到第一株无性系植株。玉米组织培养的研究现状玉米组织培养的研究现状 现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组织，并再生出植株。例如：幼胚、花织，并再生出植株。例如：幼胚、花 药、药、幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前最常用的外植体。最常用的外植体。玉米组织培养的主要方

13、法（简介）玉米组织培养的主要方法（简介）1、玉米花粉和花药组织培养玉米花粉和花药组织培养 玉米花粉和花药的培养一般可获取单倍体玉米花粉和花药的培养一般可获取单倍体植物，有利于促进玉米遗传育种工作的有植物，有利于促进玉米遗传育种工作的有效进展。效进展。2、 玉米茎尖和根尖离体培养玉米茎尖和根尖离体培养 玉米植株的根尖和茎尖分生组织具有良好玉米植株的根尖和茎尖分生组织具有良好的分化性能。玉米茎尖和根尖离体培养有的分化性能。玉米茎尖和根尖离体培养有利于促进完整玉米植株的生长利于促进完整玉米植株的生长,并且在取材并且在取材上不受季节限制。上不受季节限制。3、玉米幼胚的组织培养玉米幼胚的组织培养 玉米幼

14、胚属于二倍体，玉米幼胚属于二倍体， 且分生能力较强。幼且分生能力较强。幼胚是最易诱导，胚是最易诱导， 也是目前最常用的外植体，也是目前最常用的外植体， 但幼胚取材的时间受到严格的季节限制。但幼胚取材的时间受到严格的季节限制。玉米幼胚组织培养的全过程玉米幼胚组织培养的全过程1、准备工作准备工作 接种室消毒接种室消毒 准备诱导培养基（准备诱导培养基（N6+肌醇肌醇+L-脯氨酸脯氨酸1.38g/L+蔗糖蔗糖30g/L+琼脂琼脂7g/L+水解酪蛋白水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D2mg/mL) 灭菌灭菌2、外体消毒及挑幼胚外体消毒及挑幼胚 75%酒精擦玉米外层叶片酒精擦玉米外层叶片 至超净工作台，至

15、超净工作台，用用75%酒精擦玉米外层叶片，剥一层擦一层至酒精擦玉米外层叶片，剥一层擦一层至完完 用刀去掉用刀去掉1/3玉米籽粒玉米籽粒 挑幼胚挑幼胚 接种到准备好的诱导培养基上接种到准备好的诱导培养基上（暗培养）（暗培养）3、继代继代 准备继代培养基准备继代培养基(N6+水解酪蛋白水解酪蛋白0.1g/L+L-脯氨酸脯氨酸0.69g/L+甘露醇甘露醇20g/L+蔗糖蔗糖30g/L+琼琼脂脂6.5g/L+2,4-D1mg/ml) 诱导两次后，转入继代培养基每诱导两次后，转入继代培养基每7天继代一天继代一次，直至出透明、黄色、坚硬的愈伤组织，次，直至出透明、黄色、坚硬的愈伤组织，可用于转化可用于转化

16、（一般继代三次（一般继代三次）4 4、转化、转化 侵染培养（侵染培养（22-25，暗培养，暗培养3天）天） 恢复培养（暗培养恢复培养（暗培养3天）天） 筛选培养筛选培养 分化培养分化培养 生根培养生根培养 壮苗壮苗5、移栽及管理、移栽及管理 移栽前，应对移栽用的基质进行灭菌。移栽前，应对移栽用的基质进行灭菌。 移栽前，可将培养物不开口移到自然移栽前，可将培养物不开口移到自然 光照下锻炼光照下锻炼2-32-3天，然后再开口练苗天，然后再开口练苗1-1-2 2天，以适应将来自然湿度的条件。天，以适应将来自然湿度的条件。 玉米组培苗移栽时首先应把根部的培玉米组培苗移栽时首先应把根部的培养基清洗干净，

17、以免受细菌或真菌污养基清洗干净，以免受细菌或真菌污染而影响幼苗生长。染而影响幼苗生长。 移栽移栽玉米茎尖组织培养的全过程玉米茎尖组织培养的全过程1、准备工作准备工作 接种室消毒接种室消毒 准备培养基（准备培养基（MS+蔗糖蔗糖30g/L+琼脂琼脂6.5g/L) 灭菌灭菌1 1、玉米种子消毒、玉米种子消毒a)a)在在500ml500ml三角瓶中装入三角瓶中装入200300200300粒玉米种子粒玉米种子b)b)用用75%75%酒精清洗酒精清洗8min8minc)c)0.1%0.1%升汞升汞5min5mind)d)无菌水洗无菌水洗2 2遍遍e)e)加入无菌水静置加入无菌水静置8h8hf)f)0.1

18、%0.1%升汞升汞8min8ming)g)无菌水洗无菌水洗5 5遍遍h)h)装入钣盒装入钣盒i)i)2828暗培养暗培养3 3天天2、接种、接种 取出培养三天后的种子，接种到取出培养三天后的种子，接种到MS固体固体培养基中，根向下伸入培养基中，芽向上，培养基中，根向下伸入培养基中，芽向上，芽萌发得不太好的继续放进饭盒中再培养。芽萌发得不太好的继续放进饭盒中再培养。接种到接种到MS固体培养基中的芽放回固体培养基中的芽放回28暗培暗培养养3-4天。天。3 3、玉米茎尖转化、玉米茎尖转化取出取出MS固体培养基中的芽放在无菌滤纸上固体培养基中的芽放在无菌滤纸上切根切根 镊子夹胚轴，在茎尖处用刀尖切半边

19、。镊子夹胚轴，在茎尖处用刀尖切半边。 在茎尖生长点划一小口。在茎尖生长点划一小口。 转化后，接种于转化后，接种于MS培养基中，进行暗培养培养基中，进行暗培养。3、移栽及其管理、移栽及其管理 培养培养35天后，将其移栽至至花盆中，其天后，将其移栽至至花盆中，其 中注意事项与前面的相同。后期的管理也中注意事项与前面的相同。后期的管理也于前者相近。于前者相近。 滨 州 职 业 学 院第五节 马铃薯的脱毒培养目的要求: (1)掌握马铃薯脱毒培养的大致过程，了解马铃薯脱毒苗的鉴定方法; (2)掌握马铃薯的生物学习性： (3)熟悉微型薯的生产过程滨 州 职 业 学 院微型薯滨 州 职 业 学 院滨 州 职

20、 业 学 院 马铃薯是一种全球性的重要经济作物。适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。滨 州 职 业 学 院但是，当发现从外地引种栽培12个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶的现象产生，经检测证明这是由于病毒引起的退化现象。 滨 州 职 业 学 院 危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化。马铃薯病毒可使块茎产量减少50%80%。

21、滨 州 职 业 学 院法国Morel和他的同事们，1955年从患病马铃薯植株中选取到了无病植株，为治疗作物病毒开辟了新途径。 滨 州 职 业 学 院一、特性和生物学习性1、马铃薯的形态特性(1)根 马铃薯的根系由初生根和匍匐根两部分组成。(2)茎 马铃薯分地上部分和地下部分，地上主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。滨 州 职 业 学 院（3）叶 马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。（4）花 马铃薯的花为聚伞花序，第一或第二花序开放，

22、恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。 (5) 果实、种子 马铃薯果实为球形或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。种子可用来繁殖，但后代性状分离大。滨 州 职 业 学 院2、 生物学习性马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4下发芽，发芽适温为1218。地上茎叶生长温度为1721，25以上时生长不良，叶变小，超过30和7以下茎叶停止生长，-1时受冻。块茎形成要求昼温1424，夜温1214，土温1618。土温20以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，2530时已经长成的块茎也变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以

23、及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。滨 州 职 业 学 院马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐降低，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老而导致种性退化，而病毒和细菌病害的侵染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。 滨 州 职 业 学 院二、马铃薯脱毒技术马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50以上。研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响马铃薯的生产。通过微茎尖组织

24、培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。滨 州 职 业 学 院因此，采用组织培养技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。滨 州 职 业 学 院全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，且有逐步增加的趋势，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景，对于增加农民收入和发展马铃薯产业化生产具有十分重要的意义。滨 州 职 业 学 院我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国这瑞士（48.80吨/公顷）的1/4。造成如此大的差别，最主

25、要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。采用脱毒快繁技术，种用脱毒种薯，一般可增产30-50%，甚至成倍增产，充分发挥品种的潜能，提高马铃薯生产能力。如果我国现有马铃薯播种面积的1/3（即114万公顷）用脱毒种薯，就可年增产粮食100多亿公斤。滨 州 职 业 学 院我国在70年代用茎尖组织培养方法得到脱毒马铃薯试管苗，并成功地获得脱毒复壮的马铃薯，开始了脱毒种薯的生产和推广。八五期间，农业部在全国范围内设立了6个马铃薯原原种基地建设和种薯生产项目，初步形成了脱毒草种薯生产体系。共推广脱毒种薯36.5-40万公顷，获经济效益近30.8亿元。 滨 州 职 业 学 院我国已有许多科研、推广单位开展了

26、脱毒马铃薯的研究和生产，在生产上产生了一定的经济效益和增产效果，但由于长期以来各自为政，技术方法和脱毒标准不尽统一，未能发挥出脱毒种薯应有的增产潜力。到目前为止，我国仍未建立国家级的脱毒种薯质量监督和病毒检测制度。 滨 州 职 业 学 院1脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。滨 州 职 业 学 院试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代

27、，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。滨 州 职 业 学 院滨 州 职 业 学 院2茎尖培养脱毒（1） 取材和培养一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70的酒精浸润组织15-20秒，再用2的次氯酸钠溶液浸泡4-5min，然后用无菌水冲洗3次。 滨 州 职 业 学 院把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1-2个叶原基，0.20.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA 、 0.2mgGA3、0.5mgBA，2%蔗糖，p H值5.8。培养条件：2125、2000-3

28、000 lx、12h/d。2-3周愈伤，4-5周绿点，3-6月长成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。（2） 继代和生根培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA（试剂盒）鉴定后（试管苗应每3月检测一次，每年4次）鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右发育成510cm高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖58倍，试管苗多接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。滨 州 职 业 学 院培养基：MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸钙10，3%蔗糖，20-25度，3000-4000LX，14-16小时光照，每3周继代一次，单芽茎段约1厘米，可插也可平放，原则试管苗用2年3年。 滨 州 职 业 学 院滨 州 职 业 学 院(3) 驯化 为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度：白天2327，夜间不低于14。炼苗的具体方法是：移植前7d左右，将长有35片叶、高23cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从