北大分子生物学讲义(精)

1、北大分子生物学讲义- 朱玉贤第一讲 序论二、现代分子生物学中的主要里程碑 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从 分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同 一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就 成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。从 1847 年 Schleiden 和 Schwann 提出 细胞学说 ，证明动、植物都是由细胞组成的到今天

2、，虽然不过短短一百多年 时间，我们对生物大分子 - 细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性 认识，而 Morgan 的基因学说则进一步将 性状 与基因相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson 和 Crick 所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继 Sumner 在 1936 年证 实酶是蛋白质之后，Sanger 利用纸电泳及层析技术于 1953 年首次阐明胰岛素的一级结构， 开创了蛋白质序列分析的先 河。而 Kendrew 和 Perutz 利用 X 射线衍射技术解析了肌红蛋白（ myoglobi

3、n ）及血红蛋白（ hemoglobin ）的三维结 构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。1910 年，德国科学家 Kossel 第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。1959 年，美国科学家 Uchoa 第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA 翻译成蛋白质的过程。同年， Kornberg 实现了试管内细菌细胞中 DNA 的复制。1962 年， Watson （美）和 Crick （英）因为在 1953 年提出 DNA 的反向平行双螺旋模型而与 Wilkins 共获 Noble 生 理医学奖，后者通过 X 射线衍射证实了 W

4、atson-Crick 模型。1965 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出并证实了操纵子（ operon ）作为调节细菌细胞代谢的分子机制。此外，他 们还首次推测存在一种与 DNA 序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白 质的 mRNA （信使核糖核酸）。1972 年， Paul Berg （美）第一次进行了 DNA 重组。1977 年， Sanger 和 Gilbert （英）第一次进行了 DNA 序列分析。1988 年， McClintock 由于在 50 年代提出并发现了可移动遗传因子（ jumping gene 或称 mobile e

5、lement ）而获得 Nobel 奖。1993 年，美国科学家 Roberts 和 Sharp 因发现断裂基因（ introns ）而获得 Nobel 奖。 Mullis 由于发明 PCR 仪而与 加拿大学者 Smith（第一个设计基因定点突变）共享 Nobel 化学奖。此外， Griffith （1928 ）及 Avery （ 1944 ）等人关于致病力强的光滑型（ S 型）肺炎链球菌 DNA 导致致病力弱的粗糙 型（ R 型）细菌发生遗传转化的实验； Hershey 和 Chase （ 1952 ）关于 DNA 是遗传物质的实验； Crick 于 1954 年所 提出的遗传信息传递规律（

6、即中心法则） :Meselson 和 Stahl （ 1958 ）关于 DNA 半保留复制的实验以及 Yanofsky 和 Brener （ 1961 ）年关于遗传密码三联子的设想都为分子生物学的发展做出了重大贡献。我国生物科学家吴宪 20 世纪 20 年代初回国后在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、 血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。 20 世纪 60 年代、 70 年代和 80 年 代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二锌猪胰岛素的晶体结构，采用有机 合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨

7、酸转移核糖核酸的人工全合成，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能 等方面都有世所瞩目的建树。三、分子生物学的主要研究内容 所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同方式构成的。不仅如此， 一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的 20 种氨基酸、 DNA 及 RNA 中的 8 种碱基 所组合而成的，由此产生了分子生物学的 3 条基本原理：1 构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；2 生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则；3 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。 分子生物学研究内容

8、:DNA 重组技术基因工程 基因表达调控核酸生物学生物大分子结构功能 - 结构分子生物学DNA 重组技术（又称基因工程）这是 20 世纪 70 年代初兴起的技术科学，目的是将不同 DNA 片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向 连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说， DNA 重组 技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。 DNA 重组技术是核酸化 学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶 DNA 连接酶及其他工具 酶的发现与应用则是这一技术

9、得以建立的关键。DNA 重组技术有着广阔的应用前景 NA 重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价 值或功能得以成百 上千倍的地提高。 DNA 重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信 息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从 DNA 到 RNA ，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调 控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆及分析，都离不开重 组 DNA 技术的应用。基因表达调控研究 因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧

10、核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生 物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。 原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在 转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加 工过程， 其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。 基因表达调控主要表现在信号传导研究、 转录因子研究及 RNA 剪辑 3 个方面。转录因子是一群能与基因 5 端上游特定序

11、列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白 质分子。真核基因在结构上的不连续性是近 10 年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成 pre-mRNA 后，除了在 5 端加帽及 3 端加多聚 ApolyA之外，还要将隔开各个相邻编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟 mRNA 。 研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含 子，因此生成不同的 mRNA 及蛋白质分子。结构分子生物学 生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能 时，必须

12、具备两个前提 : 首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结 构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、 结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立 3 个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段 是 X 射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重 组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。第二讲 染色体与 DNA一、DNA 的组成与结构Avery 在 1944 年的研究报告中

13、写道： 当溶液中酒精的体积达到 9/10 时，有纤维状物质析出。如稍加搅拌，它就会象 棉线在线轴上一样绕在硬棒上，溶液中的其它成份则呈颗粒状沉淀。溶解纤维状物质并重复数次，可提高其纯度。这一 物质具有很强的生物学活性，初步实验证实，它很可能就是 DNA （谁能想到！） 。对 DNA 分子的物理化学研究导致了 现代生物学翻天覆地的革命，这更是 Avery 所没有想到。所谓 DNA 的一级结构，就是指 4 种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该 DNA 分子的化学构成。核苷酸序列对 DNA 高级结构的形成有很大影响，如 B-DNA 中多聚（ G-C ）区易出现左手螺旋 DNA （ Z-DNA ），而

14、反向重复的 DNA 片段 易出现发卡式结构等。 DNA 不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其 基本特点是：1 、 DNA 分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。2 、 DNA 分子中的脱氧核糖和姿峤惶媪 樱 旁谕獠啵 钩苫 竟羌埽 罨 帕性谀诓唷 ?br3 、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌吟与嘧啶配对，而且腺嘌吟（A）只能与胸腺嘧啶（T ）配对，鸟嘌吟（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C,另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA 分

15、子的碱基虽然只有 4 种，它们的配对方式也只有 A 与 T， C与 G 两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA 分子的多样性。例如，某DNA 分子的一条多核苷酸链有100 个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是 4100 。二、 DNA 聚合酶与 DNA 的合成The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing. The actual rate in bacteria seems to be -10-8-10-10. This correspondsto -1 error per genome

16、 per 1000 bacterial replication cycles, or -10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either （or both） of two stages:1 ， It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base; for example, by spe

17、cifically recongnizingmatching chemical features. This would be a presynthetic error control.2 ， Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has beenmade, remove the most recently added base. This would be a proofreading

18、 control.三、 DNA 的生理意义及成分分析早在 1928 年英国科学家 Griffith 等人就发现肺炎链球菌使小鼠残废的原因是引起肺炎。细菌的毒性（致病力）是由细 胞表面荚膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表 的 R 型因为没有荚膜多糖而失去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞攻击）。首先用实验证明基因就是 DNA 分子的是美国著名的微生物学家 Avery 。 Avery 等人将光滑型致病菌（ S 型）烧煮杀灭 活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R 型）来侵染小鼠，也不能使之

19、发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S 型细菌和活的 R 型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。 解剖死鼠， 发现有大量活的 S 型（而不是 R 型）细菌。 他们推测， 死细菌中的某一成分棗转化源 （ transforming principle ）将无致病力的细菌转化成病原细菌。美国冷泉港卡内基遗传学实验室科学家 Hershey 和他的学生 Chase 在 1952 年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专 门寄生在细菌体内。它的头、尾外部都有由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA 。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5 个步骤：噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面

20、；噬菌体通过尾轴把DNA 全部注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白质外壳则留在细胞外面；噬菌体的DNA 一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成噬菌体自身的 DNA 和蛋白质；新合成的DNA 和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子噬菌体；子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。他们发现被感染的细菌中带有70% 的噬菌体 DNA ，但只带有 20% 的噬菌体蛋白质。子代噬菌体中带有 50% 标记的 DNA ，却只有 1% 的标记蛋白质。四 . C-value 和 Cot1/2The total amount of DNA in the haploid genome is

21、a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-molesxsec on d/liter.五、 染色体结构DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structurescalled chromosome

22、s II , most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及 其间隔序列统称为genomes （基因组）。 如果设想将人体细胞中的 DNA 分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占 1 5 厘米，而一个 2 3kb 的基因只相当于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段！Genotype （ 基因型 ）： The genetic constitut

23、ion of a given organism （指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质 ）Phenotype （ 表现型 ）： Visible property of any given organism （某个特定生物体中可观察到的物理或生理现象 ）。Mutations ： 染色体 DNA 中可遗传的核苷酸序列变化。六、 染色体的组成1 染色质和核小体染色质 DNA 的 Tm 值比自由 DNA 高，说明在染色质中 DNA 极可能与蛋白质分子相互作用；在染色质状态下，由DNA聚合酶和 RNA 聚合酶催化的 DNA 复制和转录活性大大低于在自由 DNA 中的反应； DNA 酶 I（ DNaseI

24、 ）对染色质 DNA 的消化远远慢于对纯 DNA 的作用。染色质的电子显微镜图显示出由核小体组成的念珠状结构，可以看到由一条细丝连 接着的一连串直径为 10nm 的球状体。核小体是由 H2A 、H2B 、H3 、H4 各两个分子生成的八聚体和由大约 200bpDNA 组成的。八聚体在中间， DNA 分子 盘绕在外，而 H1 则在核小体的外面。每个核小体只有一个 H1 。在核小体中 DNA 盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成 1/7 ，200bpDNA 的长度约为 68nm ，却被压缩在 10nm 的核小体中。但是，人中期染色体中含3.3X109 碱基对，其理论长度应是180cm，这么长的

25、DNA 被包含在 46 个 51m长的圆柱体（染色体）中，其压缩比约为 104 。2 染色体中的核酸组成不重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA 总量的 40% 80% 。不重复序列长约 750 2000dp ，相当于一个结构基因的长度。单拷贝基因通过基因扩增仍可合成大量的蛋白质，如一个蚕丝心蛋白 基因可作为模板合成 104 个丝心蛋白 mRNA ，每个 mRNA 可存活 4d ，共合成 105 个丝心蛋白，这样，在几天之内， 一个单拷贝丝心蛋白基因就可以合成 109 个丝心蛋白分子 。中度重复序列 这类重复序列的重复次数在 10104 之间，占总 DNA 的

26、10% 40% 。各种 rRNA 、tRNA 及组蛋白 基因等都属这一类。非洲爪蟾的 18S 、5.8S 及 28SrRNA 基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些单位在DNA 链上串联重复约5000 次。在卵细胞形成过程中这些基因可进行几千次不同比例的复制，产生2X106 个拷贝，使 rDNA 占卵细胞 DNA的 75% ，从而使该细胞能积累 1012 个核糖体。高度重复序列 卫星 DNA 这类 DNA 只在真核生物中发现，占基因组的 10% 60% ，由 6100 个碱基组成，在 DNA 链上串联重复几百万次。 由于碱基的组成不同，在 CsCl 密度梯度离心中易与其他 DNA 分开

27、， 形成含量较大的主峰 及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。高等真核生物 DNA 无论从结构还是功能看都极为复杂，以小鼠为例：1. 小鼠总 DNA 的 10 是小于 10bp 的高度重复序列，重复数十万到上百万次 /genome 。2. 总 DNA 的 20 是重复数千次、长约数百 bp 的中等重复序列。3. 总 DNA 的 70 是不重复或低重复序列 ,绝大部分功能基因都位于这类序列中。Centromere ：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point ），这种结合对于染色体对在子细胞中的有序和平均分配至关重要。在酵母中，centromere

28、的功能单位长约 130 bp ，富含 AT 碱基对。在高等真核细胞中， centromere 都是由长约 5 10 bp 、方向相同的高度重复序列所组成。Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。 酵母Telomeres 一般以 100 bp 左右不精确重复序列所组成。5 (TxGy)n3 (AxCy)n其中 X、 Y 一般为 1 4， 单细胞真核生物中 n 常为 20 100 ， 高等真核生物中 1500 。染色体末端的线性重复序列不能被 DNA polymar

29、ase所准确复制，它们一般在 DNA 复制完成以后由 telomarase 合 成后加到染色体末端。Alu (长约 300bp )是人类高度重复序列 , 因为该序列中带有 AluI 的识别序列而得名。数十万个 Alu 重复序列散布于整 个人类基因组中，达到总序列的1 3 。 Alu 与其它高度重复序列共占人类 DNA 的 10 以上。3 染色体中的蛋白质 染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与 DNA 组成核小体。通常可以用 2mol/LNaCl 或 0.25mol/L 的 HCl/H2SO4 处理使组蛋白与 DNA 分开。组蛋白分为 H1 、 H2A 、H2B

30、、H3 及 H4 。这些组蛋白都含 有大量的赖氨酸和精氨酸，其中 H3 、 H4 富含精氨酸， H1 富含赖氨酸； H2A 、 H2B 介于两者之间。组蛋白的一般特性 进化上的极端保守性。牛、猪、大鼠的 H4 氨基酸序列完全相同。牛的 H4 序列与豌豆序列相比只有两个氨基酸的差异(豌豆 H4 中的异亮氨基酸 60 -缬氨酸 60，精氨酸-赖氨酸)。H3 的保守性也很大，鲤鱼与小牛胸腺的H3 只差一个氨基酸，小牛胸腺与豌豆 H3 只差 4 个氨基酸。无组织特异性。到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1 而带有 H5 ，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。肽链上氨基酸分布的不对称性。

31、碱性氨基酸集中分布在N 端的半条链上。例如， N 端的半条链上净电荷为 +16 ， C 端只有 +3 ，大部分疏水基团都分布在 C 端。组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP 核糖基化等。非组蛋白的一般特性 染色体上除了存在大约与 DNA 等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是 组蛋白的 60%70%，但它的种类却很多，约在20-100 种之间，其中常见的有15-20 种。 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。(3) 几类常见的非组蛋白a. HMG 蛋白( high mobility group protein)。这是一类能用低盐( 0.35m

32、ol/L NaCl )溶液抽提、能溶于 2% 的三氯乙酸、相对分子质量较低的非组蛋白，相对分子质量都在3.0X104 以下。b. DNA 结合蛋白。用 2mol/L NaCl 除去全部组蛋白和 70% 非组蛋白后，还有一部分蛋白必须用 2mol/L NaCl 和 5mol/L 尿素才能与 DNA解离。这些蛋白分子量较低，约占非组蛋白的 20% ，染色质的 8% 。七 . 原核与真核染色体 DNA 比较原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如 整个染色体 DNA 几乎全部由功能基因与调控序列所组成； 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。Viral D

33、NA molecules are relatively smallHIV = 9000 nt RNAQB= 4200 ntBactaria DNA is 100 times than viralE. coli 4639221 bp double-strandedContour length = 1.7mm, 850倍细菌本身长度。细菌中常常带有质粒rRNA 基因是以多拷贝形式存在；DNAEucaryotic cells果蝇带有 25 倍于 E. Coli 的 DNA, 人类带有 600 倍于 E. Coli 的 DNA. Eucaryotic DNA 中基因密度明显低于原核和 病毒。如人 DN

34、A 中平均每毫米只带有 50 个基因 ,而 E. Coli 中基因密度每毫米 DNA 带有 2400 个基因！一个人细胞中所带有的 DNA 约有 2m/1.7mm 细菌。成人带有 1X10F4个细胞，成人体内全部 DNA 的总长度(Contour Length)=2X10A11Km 第三讲 蛋白质合成一 . 基因与基因表达的一般概念 基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA 序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成 mRNA ，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的

35、。只有 mRNA 所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用 U、C、A、G 这 4 种核苷酸而不是 T、C、A、 G 的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将 mRNA 链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每 3 个核苷酸代表 一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。二 . 遗传密码 三联子mRNA 上每 3 个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这 3 个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时 从起始密码子 AUG开始，沿 mRNA5T3 的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。mRNA 中只有 4 种核苷酸，而蛋白质中有 20 种氨基酸，

36、若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4 种(41=4) 。若以两种核苷酸作为一个密码(二联子)，能代表 42=16 种氨基酸。而假定以 3 个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有 43 =64 种密码，满足了编码 20 种氨基酸的需要。50-60 年代破译遗传密码方面的三项重要成果：( 1 ) Paul Zamecnik 等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间 后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。 如果注射后经数小时(或数天)收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质;如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只

37、存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。( 2 ) Francis Crick 等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC 四个字母组成遗传信息(核酸)准确无误地翻译成由 20 种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验 1:用吖啶类试剂(诱导核苷酸插入或丢失)处理 T4 噬菌体 rII 位点上的两个基因，使之发生移码突变( frame-shift )， 就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验 2:研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由 400 个氨基酸组成，相应的 RNA 片段长 1200 个核苷酸，与密码三联 子体系正好相吻合。实验 3:以均聚物为模板指导多肽

38、的合成。 在含有 tRNA 、核糖体、 AA-tRNA 合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入 m RNA 或人工合成的均聚物作为模板以及 ATP、 GTP 、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加 的模板来决定。1961 年，Nirenberg 等以 poly ( U)作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推岀UUU 代表苯丙氨酸(Phe )。以 poly (C)及 poly (A)做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。实验 4:以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由 2 个氨基酸组成的多肽，编码链( coding strand)又称 sen

39、se strand ，是指与又称 antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导Genetic information is perpetuated by replicationduplicated to give identical copies. 基因表达包括转录( transcription )和翻译 ( translation 了 TTU 之外)的 RNA 单链的过程，是基因表达的核心步骤mRNA 序列相同的那条链。非编码链( anticoding strand )， mRNA 生物合成的 DNA 链。(复制) in which a double- stranded n

40、ucleic acid is)两个阶段。 转录是指拷贝出一条与 DNA 链序列完全相同 (除 翻译是指以新生的mRNA 为模板，把核苷酸三联子遗传5UGU GUG UGU GUG UGU GUG 3,不管读码从 U 开始还是从 G 开始，都只能有 UGU ( Cys )及 GUG (Vai ) 两种密码子。实验 5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有 3 种氨基酸组成的多肽。如以多聚( UUC )为模板，可能有 3 种起读方式：5 UUC UUC UUC UUC UUC 或5 UCU UCU UCU UCU UCU 或5CUU CUU CUU CUU CUU 3 分别产生 UUC (Phe )、

41、UCU (Ser )或 CUU ( Leu ).多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2 种多肽：5 GUA GUA GUA GUA GUA 或 5 UAG UAG UAG UAG UAG 3 或 5 AGU AGU AGU AGU AGU 由第二种读码方式产生的密码子UAG 是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA (Val )或 AGU (Ser )。实验 6:以随机多聚物指导多肽合成。 Nirenberg 等及 Ochoa 等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C 的多聚核苷酸作模板，任意排列时可岀现 8 种三联子，即 CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、

42、AAC、AAA，获得由 A sn 、His 、Pro 、Gln 、Thr 、Lys 等 6 种氨基酸组成的多肽。(3 )氨基酸的舌化 I 与核糖体结合技术。如果把氨基酸与 ATP 和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA 分子( transfer RNA ，tRNA )上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA (ami no acyl-tRNA )，并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶( aminoacyl-tRNA Synthetase)。以人工合成的三核苷酸如 UUU 、UCU 、UGU 等为模板，在含核糖体、 AA-tRNA 的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，

43、 只有游离的AA-tRNA 因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA 则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的 AA-tRNA 分开。当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA 相结合。如果把核糖体与 poly ( U )和 Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly ( U )和 Phe-tRNAPhe相结合。4种核苷酸组成 61 个编码氨基酸的密码子和 3 个终止密码子，它们不能与 tRNA 的反密码子配对，但能被终止因子或 释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并(degene

44、racy )，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子( synonymous codon )。三密码子和反密码子的相互作用蛋白质生物合成过程中， tRNA 的反密码子通过碱基的反向配对与 mRNA 的密码子相互作用。 1966 年， Crick 根据立 体化学原理提岀摆动假说( wobble hypothesis )，解释了反密码子中某些稀有成分如I 以及许多有 2 个以上同源密码子的配对问题。Wobble hypothesis1任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon 中的相应碱基形成 Watson-Crick 碱基配对。2反密码子第一位是 A 或 C 时，只能识别一个密码

45、子。当反密码子第一位是 U 或 G 时，能识别两个密码子。当 Inosi ne (I )作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。4根据上述规则，至少需要32 种不同的 tRNA 才能翻译 61 个密码子。四 tRNAtRNA 在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。所有的tRNA 都能够与核糖体的 P 位点和 A 位点结合，此时，tRNA 分子三叶草型顶端突起部位通过密码子：反密码子的配对与mR

46、NA 相结合，而其 3 末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的 tRNA 称为同工 tRNA 。在一个同工 tRNA 组内，所有 tRNA 均专一于相同的 氨基酰 - tRNA 合成酶。1 、 tRNA 的三叶草型二级结构受体臂（ acceptor arm ）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3端末配对的 3-4 个碱基所组成，其 3端的最后 3 个碱基序列永远是 CCA，最后一个碱基的 3 或 2 自由羟基（一 0H ）可以被氨酰化。TC臂是根据 3 个核苷酸命 名的，其中$表示拟尿嘧啶，是 tRNA 分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于套索中央的三联

47、反密码子命 名的。 D 臂是根据它含有二氢尿嘧啶（ dihydrouracil ）命名的。最常见的 tRNA 分子有 76 个碱基，相对分子质量约为2.5X104。不同的 tRNA 分子可有 74-95 个核苷酸不等，tRNA分子长度的不同主要是由其中的两条手臂引起的。tRNA 的稀有碱基含量非常丰富，约有 70 余种。每个 tRNA 分子至少含有 2 个稀有碱基，最多有 19 个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子 3 端邻近部位出现的频率最高，且大多为 嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。2 tRNA 的 L 形三级结构酵母和大肠杆菌 tRNA

48、 的三级结构都呈 L 形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA 的三级结构与 AA- tRNA 合成酶的识别有关。受体臂和 T$C臂的杆状区域构成了第一个双螺旋， D 臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。tRNA 的 L 形高级结构反映了其生物学功能，因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点， 而它的反密码子必须与小亚基上的 mRNA 相配对，所以两个不同的功能基团最大限度分离。3 tRNA 的功能转录过程是信息从一种核酸分子（ DNA ）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（ RNA ）的过程，信息转移靠的是碱 基配对。翻译阶段遗传信息从 mRNA 分子转移

49、到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子 密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。4 tRNA 的种类（ 1 ）起始 tRNA 和延伸 tRNA能特异地识别 mRNA 模板上起始密码子的 tRNA 叫起始 tRNA ，其他 tRNA 统称为延伸 tRNA 。原核生物起始 tRNA 携 带甲酰甲硫氨酸（ fMet ），真核生物起始 tRNA 携带甲硫氨酸（ Met ）。（ 2 ）同工 tRNA代表同一种氨基酸的 tRNA 称为同工 tRNA ，同工 tRNA 既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要 有某种结构上的共同性，能被 AA- tRNA 合成酶识别

50、。（ 3 ）校正 tRNA校正 tRNA 分为无义突变及错义突变校正。在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA ），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。五 AA- tRNA 合成酶 是一类催化氨基酸与 tRNA 结合的特异性酶，其反应式如下：它实际上包括两步反应：第一步是氨基酸活化生成酶 - 氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+ 酶（E）TE-AA-AMP+PPi第二步是氨酰基转移到tRNA 3末端腺苷残基上，与其2或 3-羟基结合。E-AA-AMP+ tRNA AA- tRNA +E+AMP蛋

51、白质合成的真实性主要决定于 AA- tRNA 合成酶是否能使氨基酸与对应的 tRNA 相结合。 AA-tRNA 合成酶既要能识 别 tRNA ，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。不同的tRNA 有不同碱基组成和空间结构，容易被 tRNA合成酶所识别，困难的是这些酶如何识别结构上非常相似的氨基酸。有两道关口 :The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the bindin

52、g of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖体像一个能沿 mRNA 模板移动的工厂， 执行着蛋白质合成的功能。 它是由几十种蛋白质和几种核糖体 RNA（ ribos omal RNA ，rRNA ）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000 个核糖体，而真核细胞内可达 106 个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达 1012 。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。1. 核糖体的组成原核生物核糖体由约 2/3 的 RNA 及 1/3 的蛋白质组成。真核生物核糖体中 RNA

53、 占 3/5 ，蛋白质占 2/5 。核糖体是一个 致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的 rRNA 和许多不同的蛋白质分子。 大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21 表示，大亚基由 33 种蛋白质组成，分别用L1L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有 49 种蛋白质，小亚基有 33 种蛋白质。2 、 rRNA3. 核糖体的功能核糖体包括至少 5 个活性中心，即 mRNA 结合部位、结合或接受 AA- tRNA 部位（ A 位）、结合或接受肽基 tRNA 的 部位、肽基转移部位（ P 位）及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还有负责肽链延

54、伸的各种延伸因子的结合位点。小亚基上拥有 mRNA 结合位点， 负责对序列特异的识别过程， 如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。 大亚 基负责氨基酸及 tRNA携带的功能，如肽键的形成、 AA- tRNA 、肽基 - tRNA 的结合等。 A 位、 P 位、转肽酶中心等主 要在大亚基上。核糖体可解离为亚基或结合成 70S/80S 颗粒。翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成 70S/80S 颗粒，继续翻 译进程。体外反应体系中，核糖体的解离或结合取决于Mg2+ 离子浓度。在大肠杆菌内， Mg2+ 浓度在 10-3mol/L 以下时， 70S 解离为亚基，浓度达 10-2mol/L

55、 时则形成稳定的 70S 颗粒。细胞中大多数核糖体处于非活性的稳定状态， 单独存在，只有少数与 mRNA 一起形成多聚核糖体。它从 mRNA 的 5 末端向 3 末端阅读密码子，至终止子时合成一条 完整的多肽链。 mRNA 上核糖体的多少视 mRNA 的长短而定，一般 40 个核苷酸有一个核糖体。七 . 信使核糖核酸mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.虽然 mRNA 在所有细胞内执行着相同的功能，即通过三联子密码翻译生成蛋白质，其生物合成的具体过程和成熟mRNA 的结构在原核和真核生物细胞内是不同的。八、蛋白质的生物

56、合成核糖体是蛋白质合成的场所， mRNA 是蛋白质合成的模板， tRNA 是模板与氨基酸之间的接合体。此外，有 20 种以上的 AA-tRNA 及合成酶、 10 多种起始因子、延伸因子及终止因子， 30 多种 tRNA 及各种 rRNA 、mRNA 和 100 种以上 翻译后加工酶参与蛋白质合成和加工过程。蛋白质合成消耗了细胞中 90% 左右用于生物合成反应的能量。细菌细胞中的 2 万个核糖体， 10 万个蛋白质因子和 20 万个 tRNAs 约占大肠杆菌干重的 35% 。在大肠杆菌中合成一个 100 个氨基酸的多肽只需 5 分钟。1. 蛋白质生物合成的主要步骤：翻译的起始 核糖体与 mRNA

57、 结合并与氨基酰 -tRNA 生成起始复合物。肽链的延伸 核糖体沿 mRNA5 端向 3端 移动，导致从 N 端向 C 端的多肽合成。肽链的终止以及肽链的释放 核糖体从 mRNA 上解离，准备新一轮合成反应。 主要分为五步1 、 Activation of Amino Acids （This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome）.2 、 Initiation. The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subu

58、nit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3 、 Elongation. Peptide bonds are formed in this stage.4 、 Termination and Release. Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5 、 Folding and Post translational Processing. 肽链延伸分为三步1Binding of an incoming aminoacyl-tRN

59、A.2Peptide bond formation.3Translocation.2. 与蛋白质合成有关的因子起始因子 Initiation factor (IF )延伸因子 Elongation factor( EF)终止因子。原核中有 RF1-3。RF-1 识别 UAA和 UAG; RF-2 识别 UAA 和 UGA; RF-3 仅能促进 RF-1 和 RF-2 的功能。终止因子行使功能时需要 GTP 。真核生物 中只有一个 RF，能识别 3 个终止子。3 、蛋白质合成的起始蛋白质合成的起始复合物 :30S 核糖体小亚基模板 mRNAfMet-tRNAfMet起始因子GTP50S 核糖体大

60、亚基Mg2+合成的起始可分为三步 :1、 30S 核糖体小亚基与起始因子IF -1 和 IF-3 相结合，诱发模板 mRNA 与小亚基结合。2、 由 30S 小亚基、起始因子IF T 和 IF-3 及模板 mRNA 所组成的复合物立即与GTP-IF-2 及 fMet-tRNAfMet 相结合。反密码子与密码子配对。3、 上述六组分复合物再与50S 大亚基结合，水解GTP 生成并释放 GDP 和 Pi。释放三个起始因子。真核因子 功能eIF2 促进 Met-tRNAMet 与核糖体 40S 小亚基结合。eIF2BeIF3是最早与核糖体 40S 小亚基结合的促进因子，蛋白质合成反应的正常进行。eIF4A