电分析化学期末作业模板

1、西南大学研究生课程考试答 卷 纸考试科目 现代仪器分析 院 、所、中心 化学化工学院 专业或专业领域 研究方向 级 别 2012级 学 年 2012-2013 学 期 第一学期 姓 名 学 号 类 别 全日制硕士 （全日制博士 全日制硕士 教育硕士 高师硕士工程硕士 农推硕士 兽医硕士 进修)2012年12月30日研究生院制姓名：学号专业：翻译文献：An electrochemiluminescent DNA sensor based on nano-gold enhancement and ferrocene quenching纳米金增强和二茂铁淬灭的电化学发光的DNA传感器摘要：电化学发光

2、的DNA（ECL-DNA）传感器是依靠纳米金增强电信号（纳米金即是GNP）和二茂铁信号淬灭的出现。一个电极通过电沉积法被纳米金修饰，进而固定单链的DNA探针接到钌的化合物上。因而传感器可以依靠自身表面的高密度的DNA探针产生更强的ECL电信号。当和二茂铁上的靶向DNA探针形成互补的杂交DNA链时，由于ECL的标记在空间上从二茂铁的表面分离，ECL的信号明显减弱。因此，ECL的信号同时被二茂铁淬灭。纳米金电沉积的时间和二茂铁关于ECL-DNA传感器的功能的详细研究的影响和可能对这些有影响的原因都被提出来了。报道说ECL-DNA传感器显示很强的敏感性而且在诊断学上的DNA检测和基因分析上可能提供可

3、选责性。关键字： 电化学发光 DNA传感器 纳米金 二茂铁1. 引言DNA检测在诊断学上、食品安全、环境污染分析、法医鉴定上有很多很重要的应用(Berney 等人., 2000; Ricci 和 Plaxco, 2008;Sassolas 等人, 2008)。在过去的十年里面很多分析方法都发展的相当成熟了，包括荧光分析技术（(Zhao 等人, 2003）、质谱（Turesky 和 Vouros,2004）、电化学方法(Fan et al., 2003; Jin et al., 2007; Lai et al., 2006; Liu et al., 2008; Peng et al., 2007

4、; Wang et al., 2003)，和近来发展应用纳米技术的DNA传感器(Elghanian et al., 1997; Erdem, 2007; Zhang et al., 2005)。在所有的方法中，电化学方法的优点是比其他的方法都要简单、具有更高的灵敏性、具有更高的选择性、行对于其他体系比较高的动态量程。近几年，只有少量关于电化学发光的DNA传感器的论文发表(Li et al., 2007, 2009; Miao and Bard, 2003, 2004; Wang et al., 2006, 2010; Wu et al., 2010; Yang et al.,2002; Zha

5、ng et al., 2008)。 由于电子、光学、催化剂和生物适应性的这些特点 ，纳米金在表面修饰和生物信号应用方面已经广泛应用。方等人(2007)做了一系列的使用电沉积法把纳米金修饰到电极表面研究和获得了薄于10nm的纳米金电极。二茂铁以能够通过双分子转移淬灭3-（2,2-二吡啶）钌（II）和能够通过在处理技术能够再生而著名(Cao 等人., 2006)。 在这，我们演示了一个新颖的具有结合单信号的纳米金和二茂铁的淬灭信号优点的，具有高灵敏度、高选择行的电化学发光的DNA传感器。这个ECL-DNA传感器通过使用钌化合物作为一个灵敏点修饰大圈的DNA得到。这个DNA探针通常是在两末端有六个特

6、定的互补的碱基对，在5的末端和3的末端分别用硫醇和钌的化合物修饰。首先DNA探针通过已形成的Au-S键自组装到到纳米金电极的表面，接着通过钝化的2-硫基乙醇（ME）去取代不特殊的低聚核酸去包含未组装的表面。第二，修饰的电极被浸在高离子浓度的溶液中形成线圈结构的枝桠。ECL的标记被加在靠近电极的表面以便引起高的ECL的信号，如图一所示。当和互补的靶向DNA杂交，在5-位置被二茂铁分子修饰，圈状的带有枝桠的DNA分子被被转换成刚性的、线状的双螺旋DNA分子。明显减弱的ECL信号因此被观察到，可能是由于ECL的标记从电极上分离出来或ECL的信号被二茂铁的淬灭导制。ECL-DNA传感器的原理图1说明了

7、基于纳米金信号增强和二茂铁信号淬火2. 实验2.1 试剂与仪器 4-甲基-4-羰基吡啶-二（2,2-吡啶） 钌（II） N-琥珀酰亚胺 脂 六氟双磷酸酯 Ru(b-py)2(cbpy)NHS) 交联葡聚糖G-25通过丙烯酰胺获得 三丙基胺(TPA), N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 二茂铁羧酸通过ACROS获得。N,N-二环己基碳化二亚胺(DCC), 2-乙基三羧酸 磷化氢 氯化氢(TCEP) 和 2-巯基乙醇(ME)从中国的阿尔法蛇丘（天津）有限公司买的。氯金酸国药控股化学试剂有限公司买的。交联葡聚糖是从上海Sangon生物工程技术和服务有限公司购买。具有5HS-(CH2)6-GCA CCT

8、TCC TCC GCA ATA CTCCCC CAG GTG C-(CH2)6-NH2-30(pDNA)碱基序列的DNA分子探针是通过六个碱基的化合物的5和3处，在5和3处DNA 股比较容易接近碱基对，以这种方式形成杆循环的结构并且其中一个末端靠近金表面。这一连串的碱基互补的靶向DNA链是50GCA CCT GGGGGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-30(DNA1) and 50NH2-(CH2)6-GCA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-30(DNA2),DNA2分子被二茂铁修饰，所有别的试剂都是分析纯试剂，蒸馏水通过试验获得，所有的溶

9、液和水均在使用之前被纯净的氮气脱气。电化学发光研究通过使用BPCL-2-KIC的方式使用极弱的电化学发光分析器，通过使用个人电脑的BPCL程序控制（生物物理研究所,中国科学院,北京）联合一个型号为660c的CH仪器的电气化学分析仪（上海Chenhua仪器有限公司，中国）。U-3010型号的紫外分光光度计（日本本州岛东岸港式，日本），8400S型号的红外分光光度计（岛京，日本），S-4800的高分辨标准电子组件（日本本州岛东岸港式，日本），AV-300 NMR (Bruker, Switzerland)被用来合成和修饰产品。2.2 pDNA-Ru的合成 DNA探针是根据文献的基础上，进行小的修改

10、的进而合成（URL: Yao et al., 2009)合成路线如图S1所示。简要的介绍下，0.25 mg of Ru(bpy)2(cbpy)NHS首先溶解在15 mL 的DMSO中，然后加入85 mL 的浓度为0.1 M四硼酸盐缓冲溶液中(pH 8.5)，混合溶液加入到.含有50 mL 的 pDNA (1 OD)溶液的小瓶中，然后在室温下，充分搅拌一夜。已标记质粒DNA 记作pDNA-Ru。振荡过夜后，30mL的3M乙酸钠和600毫升冷无水乙醇加入到反应瓶中。然后将反应混合物充分混合并放置在温度低于-180C下24小时。该溶液是在4下在微量离心12,000 rpm离心处理30分钟。小心除去上

11、清液，将沉淀漂洗两次，用冷的70乙醇洗涤并简要地干燥，并在进一步使用前贮存于41C。2.3 合成DNA2-FC 二茂铁标记的DNA2（DNA2-Fc的）的合成：根据文献（Takenaka等，1994）进行小的修改。合成路线示于图 S2。 0.5000克的混合物二茂铁甲酸和0.2900克的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解在20毫升二氧杂环乙烷，0.5000克DCC是溶解在5毫升二氧杂环乙烷中。然后，后者是加入到前者并磁力搅拌24 h，以便在室温下反应。反应产物是在硅胶柱中用氯仿作为洗脱剂纯化。大约获得0.5645克二茂铁甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（Fc-NHS），产率为80。Fc-NHS（0.33

12、毫克）在DMF（100mL）中的悬浮液加入到150mL DNA2（1 OD）溶液（0.5M NaHCO3/Na2CO3缓冲溶液，pH 9.0）中。在室温下将混合物搅拌过夜。化合物在Sephadex柱10mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.4）作为洗脱剂进一步纯化，并在进一步使用前贮存于41C。2.4 ECL-DNA传感器的准备过程Au电极（2毫米直径）的表面用氧化铝浆料（0.3和0.05毫米）进行抛光的，然后，分别用重蒸水和无水乙醇中在超声波浴中冲洗5分钟。 Au电极在0.5 M H2SO4电解化学进一步处理，通过从-0.2到1.7 V下进行扫描速率为0.1 VS扫描，直到观察到一个理想的伏安

13、图。进一步用重蒸水漂洗电极并在氮气流中干燥。在Au电极上电沉积的纳米金是通过把电极浸入到3毫米的氯金酸溶液，其中包含0.1 M KNO3电解质作为电解液，-0.2 V恒电位下一定的应用时间。用重蒸水漂洗后，在氮气中干燥流，再次被处理的纳米金电极再次经过电化学在0.5 M H2SO4的处理，扫描从-0.21.7 V且扫描速率为0.1 VS-1，直到一个理想的伏安图被观察到。最后，用重蒸水漂洗并干燥氮气流。p-DNA溶解在适当体积的10mM PBS溶液（0.1 M氯化钠，5mM的氯化镁，1mM的TCEP，pH 7.4）中至最终浓度为1mM。清洗后的纳米金电极迅速被浸渍在500毫升该溶液中, 在室温

14、下浸渍12小时.p-DNA-Ru通过化学吸附在纳米金电极表面。洗涤电极用10mM的PBS（pH 7.4），随后在2mM的ME溶液（10mM PBS，1 M氯化钠，pH 7.4）中浸渍1小时，进而取代非特异性结合的寡核苷酸。制备的电极再次用10mM的PBS（pH7.4）洗涤，并用作ECL-DNA传感器，其特点是采用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）。2.5 靶向DNA的ECL信号检测 ECL-DNA传感器加入在互补的靶向DNA2-Fc或DNA1，通过被浸渍在500毫升DNA2-Fc或DNA1浸渍在不同浓度的10mM的PBS溶液（0.1M NaCl，5mM的氯化镁，pH为7.4）为60分钟

15、，在370C。进行检测目标DNA的ECL测量范围一个潜在的循环伏安曲线从0.0 V到0.75 V，采用传统的三电极系统，在含有0.10M的TPA的2.0毫升的0.10 M的PBS（pH7.4）中溶液，以100毫伏/秒的扫描速率。 ECL-DNA传感器，铂丝和Ag / AgCl电极（饱和KCl）的电极为工作电极，分别为反电极和参比电极。 COM的商用椭圆柱形的玻璃单元用作一个ECL细胞，这是直接放置在前面的倾向于-900 V的光电倍增管（PMT）。3、结果与讨论3.1 p-DNA-Ru和DNA2-FC的描述方法 ECL探针pDNA-Ru用特征的紫外 - 可见分光测光标记。图，S3的补充材料显示了

16、紫外 - 可见吸收光谱（曲线a），Ru（bpy）2（CBPY）NHS（曲线b）和pDNA-Ru（曲线c），在10mM的PBS（pH 7.4）中，用一个嵌从500nm到380nm的范围内的曲线c示出了倍率。pDNA-Ru的吸收峰在455 nm处和255nm，分别表示，Ru（bpy）2（CBPY）NHS相对应的金属 - 配体电荷转移和pDNA的特性吸收带，显示出Ru(bpy)2(cbpy)NHS用来标记pDNA。pDNA-Ru溶液的浓度根据的吸收值包埋Ru（bpy）2（dcbpy）的NHS在450 nm处（Miao and Bard，2003年）计算为1mM的。Fc-NHS的其特征在于由1H-NM

17、R和FT-IR，并将结果示于图S4 1H-NMR（CDCL 3）中， ppm时，2.89（4H，），4.39（5H，），4.57（2H，），4.95（2H，米）。 IR（KBr）1770年，1732年，1215年，1076厘米-1。DNA2-FC通过紫外 - 可见分光光度法标记。图.S5的补充材料是DNA2的紫外 - 可见光谱（曲线a），Fc-NHS的紫外 - 可见光谱（曲线b），DNA2-Fc的紫外 - 可见光谱（曲线c），在10mM PBS（pH7.4）中插图示出在从500nm到400nm的范围内放大的的曲线c。DNA2-Fc的吸收峰在450nm和256nm，Fc-NHS对应于金属 - 配

18、体电荷转移带和DNA2的特征吸收，分别表示该FC-NHS标记的DNA2（Miao and Bard，2003年）。3.2、ECL-DNA传感器的表征 循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）的Fe（CN）64-/3-被用来监测电极的修饰过程与探针DNA与靶DNA的杂交过程。图.1A显示了Fe（CN）64-/3-在纳米金电极在不同的阶段的CVs。当纳米金电极电极被1mM pDNA-Ru溶液（10mM的PBS中，0.1M的NaCl，5mM的氯化镁，1mM的TCEP，pH 7.4）中，在室温18小时温度修饰，Fe（CN）64-/3-的峰值电流下降和相比与那些的纳米金电极上不加修改的峰 - 峰电位分

19、离（E）的明显增加。这种现象可能解释说明了带负电荷的pDNA-Ru和阴离子性的氧化还原探头（图1A，曲线a和b）之间的静电斥力。修饰电极后在2mM的ME溶液（10mM的PBS，pH7.4）中钝化，Fe（CN）64-/3-峰值电流增加和潜在的分离（E）降低（图1A，曲线c）。这是由于非特殊性吸收的寡核苷酸被取代ME取代导致电极表面的负电荷的减少。Fe（CN）64-/3-峰的减少去趋势，通过在DNA2-Fc的溶液浸泡固定在纳米金电极的pDNA-Ru（图1A中，曲线的纳米金电极D）pDNA-Ru和 DNA2-FC杂交，E进一步提高。这种变化的原因，可能是由于在电极表面上的负电荷增加，如作为pDNA-

20、Ru与DNA-Fc的杂交，阻断了阴离子氧化还原探头电化学反应的。图1.循环伏安法（A）和含有在2.5毫米的Fe（CN）63-铁（CN）64-和0.1 M氯化钾10mM的PBS（pH7.4）的溶液中在不同阶段的修饰电极的阻抗谱（ZIM与ZRE，奈奎斯特地块）的（B）。 （a）纳米金电极;（b）pDNA-Ru修饰的纳米金电极;（c）在ME溶液中钝化处理的pDNA-Ru修饰的纳米金（d）在370C下，用0.1纳米DNA2-Fc溶液杂交处理60分钟的pDNA-Ru修饰的纳米金电极（的10mM PBS，0.1M NaCl的杂交，pH 7.4）。改变从0.05赫兹至100千赫的频率和振幅为5毫伏。电化学阻

21、抗谱对检测修饰电极表面是一个功能最强大和敏感技术。阻抗谱由一个半圆在高频率对应于电子转移限制处理，和从电化学过程扩散限制步骤在低频率的方向得到的。由于半圆的直径对应的电荷转移电阻（Rct），较小的直径的半圆是，较小的随机对照试验（Bard和福克纳，2001年）。图. 1B所示的在每个步骤电极的阻抗谱的变化步骤。当pDNA修饰的纳米金电极后，Rct大大增加（图1B中，曲线a和b）。当修饰电极在ME溶液钝化，Rct的降低（图1B中，曲线c）。由于pDNA-Ru与DNA-Fc的杂交，Rct进一步增加（图1B，曲线d）。 在不同的变化和这些变化的随机对照试验的原因步骤和在CV看到的那些E是相同的，成功

22、地证实了固定在金电极表面pDNA-Ru和pDNA-Ru与DNA-FC之间的杂交。3.3 不同的纳米金电沉积时间对于ECL-DNA传感器的影响 金纳米粒子已被广泛用于在生物传感器中，由于他们的大的比表面积，优异的生物相容性和易于通过一个硫醇基的自组装。纳米金电极的用法可能已加入的自组装的量探针DNA，因此，增强的ECL信号灵敏度增加。不同的纳米金电的沉积时间对ECL-DNA传感器影响进行了研究，结果是示于表1。 在表1中，I0和I分别表示在与目标DNA杂交前和后的传感器的电致化学发光强度。 I是不同于I0和I ，I/I0描述减少的敏感性的百分比强度。很明显，I0逐渐增加电沉积时间的增加，这表明增

23、加自组装探针DNA的量。不过，I也随电沉积时间的增加而增加。因此，I值被用来评估性能的ECL-DNA的传感器。它表明，I值首先增加和后减少。 I的最大值时，得到电沉积时间为60 s。此外，I/I0值逐渐随着电镀时间的增加。其结果是，多余的电沉积时间没有受益ECL-DNA传感器的能力。比表面积也随电极的放置时间的增加逐渐增加，如表2所示位置（(Bard and Faulkner，2001）这导致在自组装量增加和ECL信号的增强。如图2所示，纳米金簇的平均直径为约70nm，120nm，170nm和220 nm时，电沉积时间为分别30秒，60秒，90秒和120秒。而且，纳米金簇层的密度和厚度渐渐地增

24、加。这就是I值先增加后随着I/I0值的减少而减少这种现象的原因可以被解释如下。在与目标DNA杂交之前，将DNA探针作为茎环结构存在控制ECL标记靠近电极表面，造成了高ECL信号。与靶DNA杂交后，干环形的DNA探针成为一个刚性的，线性的双螺旋DNA。在此情况下，电致化学发光标记物从纳米金表面分离使ECL信号产生明显的减少。但是，金纳米颗粒的大小增加，并随后形成高密度的纳米金团簇，DNA探针自组装在纳米金层的空心凹点。当DNA探针与靶DNA杂交后，更多的标记ECL可能从自组装体的位置分离和靠近相邻的纳米金簇的位置。 ECL信号的强度因此保留下。从图2中可以看出，当电沉积时间为30秒，金纳米颗粒的

25、形状是更均匀，I和I/I0均高于其他电沉积时间。因此，在以下的实验中，电沉积时间被选择了30秒。3.4 二茂铁对ECL-DNA传感器的影响 如表1所示，在相同的电沉积时间下，pDNA-Ru和DNA2-FC杂交的I和I/I0值高于如pDNA-Ru与 DNA1杂交的I和I/I0值。这结果说明，二茂铁淬灭DNA2-FC的 ECL信号，与文献报道基本一致（曹等人，2006年）。pDNA-Ru与目标DNA杂交后，会有更高的I和I/I0值的，是更好的ECL-DNA传感器。pDNA-Ru的茎环结构转换到刚性的后，当线性的双螺旋DNA 与DNA2-Fc杂交后，ECL标记从纳米金表面分离，导致ECL信号的减少。

26、同时，将在DNA2-FC组的二茂铁接近ECL标记和淬火的ECL信号，进一步使ECL强度下降。可以得出结论，纳米金的增强和二茂铁的淬火协同作用可以增加ECL-DNA传感器能力。3.5 潜在的电化学腐蚀、自组装时间的影响、ECL-DNA传感器的杂交时间 潜力进行的ECL-DNA传感器是一个重要参数，因为它决定了ECL-DNA传感器的灵敏度和生产性。我们已经调查了的ECL-DNA传感器在潜在应用中的发光强度。结果示于图. S6。图2.SEM具有不同的电沉积时间的纳米金电极的图像。 （A）30秒，（B）60秒，（C）90秒，（D）120秒。ECL-DNA传感器的ECL强度随着循环伏安的高电压+0.70

27、到+0.75高电位的增加而增加，由于更激发产生的态分子最大达到最佳的约+0.75V。但ECL-DNA传感器的可重复性是减少以及电压高比+0.80V时ECL强度下降，这是由于氧化解吸巯基的ECL探针在金电极(Bertolino et al., 2005; Zu and Bard, 2001)。因此，在下面的实验中电势范围是从0到+0.75V选择的。自组装时间对ECL强度的影响于图 S7可以看出，自组装体的时间达到12小时时得到最大发光强度，但时间超过14小时时ECL强度开始下降。随着进一步的自组装时间的增加，在ECL强度降低，这可以归因于增加电阻的电极表面的距离，空间位阻和从大量吸收非特异性探针DNA的出现的静电阻。类似的现象也被报道用于固定金表面上的DNA（杜等人，2005年，张等人，2008）