薄层色谱之薄层板的制备技术和薄层分析的点样技术训练

1、色谱知识理论之薄层色谱理论基础、操作及薄层扫描法简介药检文摘日期:2011-8-11碑层色谱基础理论、操作及碑层扫描法简介一、基木概念及机理1基本概念：层析法（色谱法）足利用混合物屮各组分（或成分）的现化性质的差别，使各组 分以不m程度分布在两个不相混溶的相中，由丁各组分的不m速度移动，因而达到分离的过程及方 法。层析法分为:纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱、液相色谱法等，我们主要讨论薄 层色谱法。薄层色谱法（层析法）根裾层析原理分为二大类：吸附®析：利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力不mj，用洗脱液使组分分离，如硅胶g”氧化 铝薄层层析。分配层析：利川被分离物质在两相十分配

2、系数不同使飢分分离。如微晶纤维素层析、纸层析等。2层析机理:从层析法概念屮我们了解任何层析都关系到被分离物质溶质在两相之叫的分配，即 关系到分配系数（k溶质在同定相中浓度/浴质在流动中浓度的大小”只是在不同层析法中”k冇不同 的意义。在吸附层析法中k称为吸附系数。kxa/xs”表示在一定溫度卜达到平衡时”在单位时间内被吸附剂表而吸附的溶质的浓度xa与从吸附 剂表面解吸附到溶剂展开剂屮溶质浓度xs之比。分配层析法：k为分配系数，即在一定温度下达到平衡吋，溶质在固定相中的浓度cs与其在 流动中的浓度cm之比。即 kcs/cm二、薄层材料及薄层板的制备1材料： 背材：支持薄层吸附剂的物质耍求：有一定

3、的机械强度；能耐受展开剂和兄色剂的化学作用及腐蚀；能耐受反应的温度；表 面光骨，平整，冇一定的厚度，保证吸附剂厚度均匀，以免引起误差。仪器扫描用板要求一定的板 厚以便薄层斑点在仪器光束的焦距上（如cs930”要求厚度在15mm左右。常见背材足玻璃板，一般使用的是镜而玻璃；在涂铺薄层板前，将玻璃划裁成长宽为 10xl0n10xl5,20xl0h20x20cm的玻璃板11磨边之后”用洗液或洗涤剂浸泡、洗净、晾干，表谢不应冇 指纹、汕迹、水迹，否则影响吸附剂的牢固度及定性定景的准确性。 吸附剂：利用薄层层析解决一个分析任务，主要在于选择好合适吸附剂与展开剂。常用吸附剂简介：按文献统计，在円常工作中硅

4、胶g使用率在50、硅胶10、纤維素9、氣化 铝3、聚酰胺25。下面对使用率高的儿个吸附剂进行讨论。硅胶：缩小硅胶"整个结构中含有许多硅醇基-si-oh”硅胶的吸附性主要在干此基w，基上羟® 与极性化合物或不饱合化合物形成氯键，产生吸附力。氧化铝由于制备方法和处理方法不同，氧化铝可分为屮性、碱性和酸性氧化铝。氧化铝的吸附力主要依靠其氧原子与被测物屮活泼氢结合成羟基而产生的。另外其暴露的a13 与芳香环上ji电子作用形成a杂的络合物”也是产生吸附的因素。聚酰胺：常用柯四种，聚酰胺6、66、11、乙酰化聚酰胺、吸附力由w内部存在的酰胺键与被分离组分中的酚、酸、醌及硝基化合物形成氢

5、键而产生的。纤维素：常用有天然纤维素、微晶纤维素等。其结构是含人置p-1、4葡萄糖甙键合的纤维二糖"分子屮人量的羟基使w具亲水性，在铺板屮 带入水分被纤维素吸附变成为分配薄层中的固定相。2薄s板的制备：耍求薄层板各部位的厚度均匀一致，表面平整，无划痕，少气泡，牢固性好。制板：将吸附剂涂铺在一定背材上，使成厚度均匀一致的溥层的过程。方法：分干法、湿法。一般常川湿法。湿法铺板程序：将吸附剂用一定比例的水溶液成者是含粘合剂的水溶液调匀成糊状，r;用手工 或机器将吸附剂均匀涂布薄层背材上（厚度一般在025-055mm之间置水平台上，自然阴干，吸附 层析板在使用前置1o5'c活化1小时

6、后置干燥器中备用。乎工制板时使用刮板器将调匀的吸附剂通过03mm或05mm狭缝刮铺在背材上、刮铺力度耍均 匀，-般制出薄层板较佳。机器铺板的原理同手工制板，只足刮铺的速度较均匀（由机器控制）故 制备的薄层板质量较稳定。另外还冇倾注铺板法、浸渍法、喷雾法等。薄层板制备中注意m题。 含煅石膏作粘合剂的吸附剂在加水或含cmc的水溶液调匀后，在2分钟内铺板"以免粘合剂 固化而使铺板固难。 補板时防止板而有气泡的方法是调匀吸附剂时玻棒顺一个方m搅动，再者在调匀时滴加少许 乙醇。 铺板时不吸附剂一般情况下，与溶液之比例为1:3"活化110°c30分钟。 关于活化i'k

7、l题，活化就是将吸附剂水分加热去棹的过程，其目的就是增加吸附剂的吸附能力， 增加活度。 关于活度问题：薄层活化是将吸附剂屮水解吸附的过程，但吸附剂与水的结合（氢键）是可 逆的。判定吸附能力人小的标志足活度，活度一般分五级，测定过程足将儿种染料的配成混合液， 在一定条件下展开，检查其分离度大小来判別的。在实呩工作屮一般不测定活度，但在上述规定活 化的条件制备薄层板的活度一般在n m级，注意的是活化好与薄层板应在硅胶干燥剂环境下保存 备川。三、点样：1点样器简介：a层析用微景吸管10w、毛细管；以上是毛细管类，前者是厂家生产的成品，者在实验室制备或 利川其它实验用毛细管，但其内径应在01mm以内，

8、作定性用。b定量用毛细管、微量注射器：两者均用于定景的薄层层析，前者奋规格05、1、2-lopl主要 是进口产品 usdiummondscientificco,微m：注射器规格有 5j.il> 10gk 15pl、25gk 50gk 100pl， 一般5-1 opl作定s薄层用，用前要将针尖稍磨平以免点样时刺伤薄层使之损失造成定s不准。2点样：位置距底边10-15cm”斑点直径3mm最大不过5mm点间距两边点距溥层边缘15-20cm" 且薄层板两边去棹2mm左右的吸附剂，露出玻璃板，以防止边缘效应。方式分为：手工点样，自动点样。手工点样操作注意点：手工点样一般用毛细管。接触吸附

9、剂表ifii角度要正确，要迅速，以免点 样斑点过大。点样吋用电吹风吹干溶剂量（特別是用热风吋）要用间歇式。点样量不易过大。自动点样简介：linomat点样仪:用氮气将点样头上点样液喷到溥层上，即喷上技术，可点不同 形状样品，lgl-500gl均可点。nanomnt点样液：用磁性点样尖控制毛细管与薄层表而接触，借毛细管作用点样，称毛细管式微fi 点样器。全自动点样tlcsamplerll利用调节点样速度控制原点人小一样。网、展开：所谓展开就是层析过程，一般/十:特定的层析槽中进行，层析槽通常为一有盖密闭的玻璃体，能 防止溶剂挥发和形成一个合适的层析环境。1预饱和闷题：在层析之前，使层析槽的空间被

10、展开剂蒸汽完全饱和的过程称之预饱和，一般 认为预饱和对分离结果有好处，但我们认为要根据实际悄况具体分析，从下面几方面来进行讨论。a出现边缘效应时：易出现边缘效应的嵌开系统，预饱和30分钟能有效地克服，特别对含有极 性差异人的溶剂系统吋较好。b展丌剂分层：在浞合展丌剂屮如吸附力较强的溶剂占的比例较小的（10）就有发生展丌剂分 层的可能，预饱和能使吸附剂_i:事先结合饱和蒸汽中溶剂系统，这样就可避免展开剂分层。c展开剂蒸汽对薄层影响：展开剂中沸点低的溶剂不断接触薄层板上，t1.越犇上部的部位置越 多，这样对rf值大的斑点移动距离影响大。2展开方式：上行、卜'行、乎行、同心法，一般常规检验中

11、，使川上行法，该法操作简便，速 度适巾。展开注意点：环境温度及湿度，温度一般不高于3（rci（rc-3o°c”湿度对展开剂中含水的系 统尤其注意"过干过湿都会影响已达成的含水量平衡。五、检测方式：冇色化合物的位置易于检出，这里主耍讨论无色化合物的检测方式：1物现方法：主要紫外灯下检测，利用物质在254、365nm这两个肀色光下产生.不m颜色不m强度災光来检测” 或利用在该光下不产生荧光而在荧光板上成为暗斑的方式检测。2化学方法：主要指妞色剂妞色法：妞色剂分通用型和专属型。通用型能广泛的与不m类型化合物反应。专属 型对某类化合物，共冇某种功能基化合物起反应。常见通用型並色剂冇

12、碳化试剂（含不m浓度的酸）、磷钔酸、三 氯化锑、还冇水。专属型並色剂，较多、复杂、具体物质可照药典操作及杏阅冇关文献资料。具体检测方法分述如 下。a蒸汽妞色法：利用一些姑色剂蒸汽与样品组分妞色，如碘、溴、氨气等。 b浸渍敁色法：配制的敁色剂倒入界器屮，将展好的溥层板放入屮，一般浸入儿秒钟即可。 c加热妞色：为了加速反应，常在105-110°c下烘至斑点淸晰。d喷雾敁色：敁常见、敁色剂用s少，常与加热法配合使用。3生物方式：将浆些特定细苘的凝胶混悬液倒在展开后的傅层板上，用适当溫度培养一段吋间，以此检测架些 兵冇抑茼或杀茼的活性物质。六、定量:1斑点刮取定s:刮取随行对照品同位置供试品

13、的斑点，用适当溶媒提取后，用紫外分光法、气相法、原子吸收分光光度等色谱 手段测定。2许接定s:a比斑点而积：用毎格lmm2透明格纸盖在溥层板上测s斑点所占而积mm2与对照品相互比较，定最误差在 10-20之间。b辨层妇描法：原理：同比色法，似由于溥层板而粗糙不平，薄层斑点的吸光度与含:®之间的关系，只冇在含:®很低的时才符 合比尔定律，而此时的标准曲线是芎曲的，造成巧曲的原因是光在混浊和表而粗糙的宁透明固体上产虫了敗射，解 释这个原因的knbelka和timk在1931年创立了 kn-mu现论，推异丫 k-m微分方程，通过该现论可求得散参数sx 不同性质吸附剂的sx不同这样

14、就可将吸光度与含制成的标准曲线近似直线”符介测定要求。实际工作原则是：用一束长宽可以调节的一定波长一定强度的光，照射在薄层板斑点上，进行扫描，用仪器测 量通过斑点的光束强度的变化，从而达到定的e1的。测定方式分类：反射法：测最反射光的强度。透射法：测最透射光的强度。扫描方式分类：单波长法、单光束法；单波长、双光束法；双波长法。薄层拍描仪的组成：光源、单色器、薄层板台架及驱动装置、检测器、数据处理仪。操作方法步骤有供试品前处理、点样、肢开、上机扫描、数据处理。外标法主要测定技术桁标精密称取对照品配制成高、低两种浓度，供试品溶液制备至少两份，甸份对照品溶 液和供试品溶液在同一薄层板k点样不少于2个

15、斑点，交叉点样，各份溶液所点斑点测定结果对应平均值的偏 差均不得人于3,供试品测定结果对平均值的偏差不得人于3。注意事项:供试品的响应值应在高低标准w,响应值之问则应予以调粮:色谱斑点分离度应在15以上"至少不能 少于10,且背景千扰尽s:小；斑点应呈一致性，供试品斑点与对照品斑点颜色应一致（日光、荧光、紫外光下检视）， 斑点的光谱阌应s木一致；测定记录内容应包括色谱阌、积分记录、工作曲线及i叫归a程和相关系数，测定结果的 计算应用两点法或1"1归a程（多水平校正法）计算。结果h算：工作曲线经过原点可用外标一点法定量计算；工作曲线不过原点必须用外标二点法计算。计算公式 如下

16、：点法： mi样品ai样品xmi标准/ai标准 二点法:mi样品bxai样品aa 1 /2mi lmi2-1 /2bai 1 ai2bmi2-mil/ai2-ai1mi点样s:ai斑点峰而税mi 1、mi2对照品点样最ail、ai2对照品斑点峰而积»返回上-页程序维护:湖北省药检所网站实训七薄层板的制备技术和薄层分析的点样技术训练一、课前预习内容一供测定黄曲霉毒素用的硅胶g薄层板的制备取适量硅胶g粉于研钵中，加相当于硅胶g量的2-3倍左右的水，用力研 磨1-2分钟，至成糊状后立即倒在5*20cm的薄层板中心线上，快速左心倾斜， 使糊状物均匀地分布在整个板面上，厚度约为0.25mm，然后平放于平的桌面上干 燥15分钟，再放入100°c的烘箱内活化2小时，取出放入干燥器内保存备用。另一方法是：称取约3g硅胶g,加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟， 至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5x20cm、厚度为0.25 mm的薄层板三块。 于空气中干燥约15分钟后，在100°c下活化2小吋，取出放入干燥器中保存。二供测定苯甲酸、山梨酸用的聚酰胺薄层板的制备称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约15ml水，研磨3分钟，在10x20cm玻璃板上使其均匀即涂成0.25-0.30mm厚的薄层，