动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定

1、动物组织基因组dna的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽捉分离纯化猪肝基因组dna,并利用紫外吸收和二苯胺显色 法进行核酸定量和纯度测定。制备的样品a260/a280值在1.8附近，纯度较高。但由紫外吸收 法数据计算出样品dna浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨 论。abstract： the genomic dna of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method in ord

2、er to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the uv to find its o.d value the a260/ a280 value of the sample is about 1.& which indicates itself highly purified. however, the data of th

3、e two different methods are so different that it confuses us. this essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组dna紫外吸收法二苯胺key words: poker liver salting-in method extract genomic dna uvpcx diphenylamine引言：制备组织基因组dna在基因结构和功能的研究屮扮演着重要角色，是分了生物学研究 屮最重要的实

4、验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作川；而不 同种类生物的基因组dna提収方法各界，同一生物的不同组织或器官也因莫细胞结构及成 分差异，而需采用不同的提取方法。通常要求所得到的dna片段长度应不小于100kb,在提 取过程中要尽可能排除可使dna断裂和降解的各种物理、化学或生物因索，以保证样品以 结构的完整。盐溶法是制备基因纽dna的常规操作技术，在溶解细胞，核蛋白释放后，根据dna 不溶于0.14mol/lnacl溶液而rna可溶的特性将dna核蛋口与rna核蛋白分离，得到粗 品。粗品中主要成分为dna和蛋白质，用酚/氯仿併戊醇进行抽提，可除去其中的蛋白质。 再加入一

5、定量的界丙醇或乙醇，较长的基因组dna分子将形成纤维状絮团漂浮其中，而质 粒或细胞器屮的小分了 dna则只能形成颗粒状沉淀物附着在容器壁或底部，用玻棒挑出纤 维状絮团即可达到比鮫满意的分离效果，得到纯度较高的基因组dnac核酸中喋吟环和唏呢环的共轨双键系统在260nm处冇最大吸收峰，故可采川紫外光吸 收法对样品进行定最和纯度测定。本文还利用二苯胺与核酸的颜色反应对样品进行了定最测 定。1实验部分1.1仪器与试剂722s型对见光光度计、紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、烧杯、量简、玻璃棒、三 角瓶、离心管、ep管等。sc缓冲液,5%sds溶液,95%乙醇、氯仿、异戊醇,固体氯化钠等。1.2材料

6、新鲜猪肝1.3猪肝基因组dna的分离纯化取新鲜猪肝4.0g,用sc缓冲液洗血，低温剪碎后，加入s.omlsc溶液捣碎，将匀浆 装入离心管，平衡后于4000r/min离心lomin,弃上层rna提取液；将下层加入sc溶液 5.0ml混匀、平衡后，再次于4000r/min离心lomin,弃上层；下层沉淀转入三角瓶，加入 sc溶液20.0ml, 3mlsds溶液混匀，15ml氯仿/异戊醇混匀；再加入固体氯化钠1.2g,边 加边混匀，充分震荡30min；于4000r/min离心20min；取出离心管后可观察到内容物分为 三层，取上层水相（dna溶于水相中），加入等体积氯仿/：片戊醇振荡lomin,于4

7、000r/min 离心20min；取上清，加等体积95%冷乙醇，边加边向一个方向缓缓搅拌，町观察到纤维状 絮团逐渐缠绕在玻棒上。用玻棒挑出dna絮团，用少最95%乙醉淋洗一次麻，轻轻挤压排 尽吸附的乙醇，将絮团装入ep管，加lnilsc溶液封存。1.4紫外吸收法取1.3中样品,加入lomlnaoh, 8000r/min离心5min,取上清进行稀释,当稀释比为 1： 10 和 1： 15 时，以 ddhzo 调零，测 a260>a280.1.5二苯胺显色法按tab-1.5配制各号试管:试剂012345样品1（1： 15）样品2（1： 10）dna标准溶液（200u g/ml）/ml00.4

8、0.81.21.62.02.0ml样液2.0ml样液ddh?o/ml2.01.61.20.80.4000二苯胺溶液/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0tab-1.5.1混匀后,于60°c水浴lh,冷却后，测a595.2实验结果与分析讨论2.1实验结呆紫外吸收法结果见tab-2.1.1项目样液 1 （1： 15）样液 2 （1： 10）o.d.2602.2652.998o.d.2801.2481.63826（/ 人2801.811.83tab-2.1.1二苯胺显色法结果见tab-2.1.2试剂012345样品1（1： 15）样品2（1： 10）o.d.59500.12

9、20.2240.3210.4070.4780.1030.164tab-2.1.2由tab-2.1.2中笫0到5号管o.d.值结果，dna含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制dna标准曲线如fig-2.1.1dna含量标准曲线s6sq00 111110100200300400500fig2.1.1dna 含量 pg山标准曲线作图可知，样液1和样液2的dna含量分別为：65.25116.08 pg,样液浓度分別为：32.63 u g/ml> 58.04 u g/ml.稀释前原液浓度为：534.93 u g/ml, 10inl原液 共含 dna5349.3 p g.按紫外吸收法结果计算，样液1和

10、样液2的dna浓度分别为：113.25 n g/ml、149.9 u g/ml.稀释前原液浓度为：1598.88 u g/ml, 10ml 原液共含 dna15988.8 u g. (10.d=50u g/ml)2. 2结果分析与讨论2.2.1紫外吸收法与二苯胺显色法结果差异分析紫外吸收法所得数据计算出dna原液浓度为1598.88 m g/ml,总量为15988.8 ug,而 二苯胺显色法数据计算结果为，dna原液浓度534.93 u g/ml,总量5349.3 ug；示者仅为 前者的33.46%.原因分析如下：紫外吸收法利用dna溶液在260nm处有最大吸收峰的特性，对其进行定量测定。而

11、rna的最大吸收峰也在260nm处，故当样品中混冇较多rna时，会干扰dna含虽的测定, 实际测定结果应该是dna和rna光吸收值的总和。dna在260nm与280nm处的吸光度比值为1.8, rna在260nm与280nm处的吸光度 比值在2.0以上，当样品中存在rna时，a26(/ a28o会升咼。实验中i从j个稀释度的a260/ a28o 值均大于1.8, r稀释度小的比值升高更多，表明样品中含冇一定量的rnao紫外吸收法测定样品dna含最时，样品屮其他具有紫外吸收特性的物质也会影响测定 结果。蛋口质的紫外吸收峰在280nm处，其在260nm处的吸光度不到核酸的1/10,因此样 晶中少量

12、存在的蛋口质对测定结果影响不大。另外，在采用紫外吸收法测定dna含量时，应固定ph值，否则结果也会受到相应影 响。在二苯胺显色法屮，dna在酸性条件下加热，其嚓吟碱与脱氧核糖间的糖廿键断裂， 主成喋吟碱、2-脱氧核糖和脱氧嚅噪核井酸，其小2-脱氧核糖在酸性环境屮加热脱水住成3 -嶷基酮皋戊糖，进而与二苯胺试剂产生蓝色的颜色反应，rna却不能在此条件下与二 苯胺试剂产生颜色反应，样品中少量的rna并不影响测定。但蛋白质、多种糖类及其衍生 物、醛等可与二苯胺产生颜色反应，从而十扰dna的定量。木实验中，二苯胺显色法各铮 试剂配制时没有特别造成酸性环境，冇可能使得颜色反应不充分，而使相应的实验数据偏低。 2.2.2 dna含量标准曲线不过原点按照理论，dna含量的标准曲线应该是一条过原点的直线，但实验所得标准曲线向y 轴正向偏移0.0247个单位，其原因可能是分光光度计的系统谋差，也可能是操作失谋引起