芦荟的组织培养快速繁殖技术.doc

1、辽宁林业职业技术学院园林专业毕业论文芦荟的组织培养快速繁殖技术学生姓名： 聂瑛磊 学号: 05050819 指导教师： 刘姗姗 专业: 园 林 年级: 058 班 2008年 3 月 19 日目 录摘要1关键词11引言12方法12.1材料与培养基12。1。1材料的选择12。1。2培养基的选择与配制22。1.3植物生长调节剂的使用22。2愈伤组织培养22.3继代培养32。4分化培养32。5生根培养及苗床假植32。6炼苗32.7移栽32。8脱水32.9栽植33影响芦荟组织培养效果的因素43.1不同外植体的接种效果43.2培养条件的影响43。3不同浓度细胞分裂素对芦荟分化的影响43。4温度对芦荟分化

2、的影响53。5光照对芦荟分化的影响53。6无机盐对芦荟苗生根的影响53。7活性炭对芦荟生根的影响53.8不同栽培基质对芦荟组培秒生长的影响63.9不同栽培气候条件对芦荟组培苗生长的影响64芦荟组织培养中褐化与玻璃化的控制64。1褐化对芦荟组培的影响及控制64.2玻璃化对芦荟组培的影响和控制65结果与分析75。1芦荟外殖体的诱导的两种途径75。2快速增殖75。3细胞分裂素对分化的影响76结论7致谢8参考文献9芦荟组织培养与快速繁殖技术研究摘要：芦荟（Aloe）是百合科芦荟属多年生常绿多肉质草本植物。原产于非洲干燥地区,集药用、观赏、美容、保健于一身，全植株均可入药，具有清热、消炎、通便作用，可治

3、疗冲叮、溃疡、支气管哮喘、热结便秘等,有极高的开发应用价值，有着“绿色黄金”之称。在我国，随着人们生活水平不断提高和保健们意识的不断增强，芦荟作为保健食品逐渐受到人们的喜爱，生产上对芦荟种苗的需求也日益增加，芦荟产业发展开始走向规模化。本文利用植物组织培养的原理和方法，主要就芦荟组织培养与快繁技术从培养基选择、接种增殖试验、繁殖的具体方法、各因素对了芦荟组织培养的影响和常见的问题等方面进行了系统的研究和阐述,对芦荟的生产化具有一定的参考应用价值和意义.关键词:芦荟,组织培养，快速繁殖1。引言近年来，由于芦荟化学及药理学研究的深入，现已形成了一股世界性的芦荟保健热,从而就带动了我国芦荟栽培产业的

4、发展.现在,芦荟的栽培产业也已开始在我国兴起，但由于芦荟不能自花授粉结实（虽然能开花，但大多数栽培种的芦荟花粉是不孕的，不易产生种子)。因此，用种子繁殖非常困难。目前的繁殖方法主要是分株和分蘖，但难以快速、大量地繁殖种苗，难以满足当今芦荟种植业对种苗的需求。这也是当前芦荟种苗昂贵的重要原因之一。用植物组织培养方法可在短期内繁殖大量规格划一、种性稳定的种苗，具有成本低、效益高的特点.2。方法2.1材料与培养基材料为l0l5cm高的芦荟幼苗愈伤组织诱导培养基为MS+（16mg/ L)BA+（0。10.5mg/L)NAA分化培养基为MS+(24mg/L)BA+ (0.10.5mg/L)NAA生根培养

5、基为MS+(0.10。5mg/L）IBA+（25mg/L)PP332。1.1材料的选择用芦荟的叶片、茎秆等作为外植体进行组织培养，很难获得成功,因为其分泌的黏液含有较高的多酚氧化酶，其活性使试验材料很快会褐化,甚至变黑；应从健壮生长的芦荟成年植株上摘取侧生嫩芽,取芽时最好用手将芽从母株上掰下，不用剪刀等工具切割，因为掰下的芽在培养时分泌产生相对较少的酚类化合物，对以后培养过程中防止褐化有所帮助，而切割的芽容易产生过多的酚类化合物，在以后的培养过程中易发生褐化。2.1。2培养基的选择与配制培养基是活体植物组织体外保存、生长发育的营养来源.不同的植物都有自己最适合的组培培养基。多数学者认为，MS培

6、养基适宜芦荟芽的分化和增殖培养。潘学峰等筛选古巴芦荟(A.cubana) 侧芽分化的最佳培养基时发现,MS培养基诱导出的侧芽数最多,是芦荟外植体侧芽分化最理想的培养基；其次是H培养基，较差的是KC培养基。以MS培养基为例，其组成是在配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1。65克、硝酸钾1。9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0。37克、磷酸二氢钾0。17克、碘化钾0。83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22。3毫克、硫酸锌3。6毫克、钼酸钠0。25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖30克和琼脂7克。其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定.大量元素浓

7、度高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根,MS培养基中大量元素浓度过高，为此常采用1/2、1/4大量元素浓度作培养用，仅用很低的细胞分裂素，并加入适量的生长素，用的最普遍的是NAA，这样生长效果较好。2。1。3植物生长调节剂的使用在芦荟组织培养中，使用的生长素类有IBA和NAA，细胞分裂素较多是是6-BA，ZT和KT使用较少。生长素类物质与细胞分裂素类物质搭配使用对芽的分化和增殖效果较好，而生根培养多数单独使用IBA或NAA.在促进侧芽产生时往往使用较高浓度的细胞分裂素，在一定浓度范围内,如使用较高浓度是6BA可明显促进侧芽产生,随着6-BA浓度的声高，分化的芽也随之增加。但是，6-BA在培养

8、过程中存在一定程度的累积效应,过高浓度的细胞分裂素会抑制新芽的发生和生长,且导致培养材料变异的机率增大。适宜浓度的IBA比NAA更有利于芽的分化和增殖，有实验表明：在相同的6-BA浓度下，IBA作用比NAA更有效，增殖率较高，苗生长粗壮，黄叶，畸形叶很少出现。若培养基中不加IBA或其浓度过低，则芽变纤细，不利于移栽成活；但高浓度的IBA明显抑制了芽的分化。2。2愈伤组织培养将准备好的芦荟幼苗在清水中冲洗数次，剪去叶片和大部分茎段，取茎尖部分，再冲洗12次,淋干.在超净工作台上，先用75的乙醇将茎尖浸泡3060s，再用升汞浸泡5-l0min，最后用无菌水冲洗数次.用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织

9、切块,接种到愈伤组织诱导培养基MS+6-BA4。0mg/L+NAA0.2mg/L上.茎尖和茎段各接种10瓶，每瓶接2块.培养条件为：每天光照 1012h,光照度为 10002000Lx，温度(25±2)。大约1525d后，试管中接种的外植体就可以膨大，形成愈伤组织.愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。愈伤组织形成1周后，就可将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养.2。3继代培养将愈伤组织在无菌条件下,从试管中取出，用镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并用无菌水反复清洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数个小块,再接

10、种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后,三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大,这一过程称作继代培养，可反复操作。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1个芦荟茎尖组织可繁殖出大量的新接种材料来,用于分化培养。2.4分化培养 将愈伤组织在无菌条件下，从试管或三角瓶中取出，用无菌水洗净，切成小接种块，接种到装有分化培养基的三角瓶中，分化培养的条件同愈伤组织培养。大约3050d后，愈伤组织就可分化出芽，并继续长出小叶片。当分化出的幼苗长到一定高度或分化出一定数量后,将这些小幼苗在无菌条件下取出，进行生根培养或重新诱导分化。2.5生根培养及苗床假植当三角瓶中的幼苗

11、叶片长到3cm左右时,将幼苗在无菌条件下取出，放入装有生根培养基MS+NAA0.5mg/L+IBA0。2mg/L的三角瓶中培养，培养条件同分化培养。大约半个月后，幼苗即可生根.2。6炼苗当幼苗的根长到一定长度，幼苗形体已显健壮时，移至大棚内，以60%的黑纱遮光炼苗.将幼苗取出,在清水中洗除附着在根上的培养基（注意：一定要严格洗净，否则会烂根）。将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，在1525、湿度60%80%的条件下炼苗24h，也可视情况缩短为l2h。2.7移栽将锻炼后的芦荟试管苗从接种袋里取出，在清水中洗掉培养基，并在0。1%高锰酸钾溶液中浸泡消毒约1分钟，然后置于遮光透风的大棚内晾干水分，再假植于

12、沙质苗床中，淋足定根水并以75的黑纱遮光，待苗床表面的细纱干白后再淋水,20天后调查小苗的成活率，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。2。8脱水将消毒后的芦荟苗取出，摆放在干燥的室内地板上，使其自然脱水，以叶片稍有收缩为度。2。9栽植基质以河沙或疏松肥沃的沙质壤土为好，切忌土质粘重、渍水，不可栽植过深，栽稳即可。成活关键:1、温度适宜；2、提高周围的空气湿度(90100%)，使叶面的蒸腾较少，尽量接近培养瓶中的条件，可通过加覆塑料薄膜或在温室内种植来调节。3、种植介质要保水透气，先经灭菌处理，不可过湿过干.4、注意光、温条件，光照不能太弱，以强度较高的漫射光为好。要有足够保证小苗进行光合作用.5、喷

13、药宜710天喷一次,水中可加入0。1%的肥料，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。3影响芦荟组织培养效果的因素3.1不同外植体的影响据对茎、叶分别进行诱导、分化实验观察，在同一培养基上，茎的平均诱导分化率在 90%以上,而叶片基本保持不分化状态.因此，以茎段作为试验材料效果较好。芦荟外植体接种于MS+6BA4。0mg/L+NAA0。2mg/L诱导培养基中,培养7天后开始转绿，20天后从叶腋处诱导出分化芽，诱导率达95%,但茎段容易因消毒时间过长而变褐死亡.3.2培养条件的影响 培养基酸碱度对芦荟组织培养分化效果的影响非常显著，经证实,在无菌苗建立和增殖阶段,培养基调为酸

14、性（pH6。2）较合适；在增殖末端和生根阶段，培养基宜调为中性（pH7。0）。3。3不同浓度细胞分裂素对芦荟分化的影响以MS培养基中添加0.1mg/LNAA为基本培养基，选取生长状况相近芦荟分化芽，在超净工作台上切割成大小均匀的芽块（约23个芽）,接种添加到1。0、2。0、3.0、4.0mg/L6BA的分化培养基中,在温度为2530ºC光照强度为500lx条件下培养2025天后观察、纪录分化结果.每处理设5次重复，每个重复5瓶，每瓶接种5块。从表5.1可以看出，芦荟分化苗在分别添加细胞分裂素（6-BA）1.0、2.0、3.0、4.0mg/L培养基中生长表现良好,但是在分化率上有所差别

15、。在添加3.0mg/L6-BA的培养基上的增殖率最高，为3。3倍；其次为添加4.0mg/L6BA的培养基上，分化倍数为3.0倍;在添加1.0 mg/和2。0 mg/L6BA的培养基上其增殖率最低，为2。5倍。表5。1细胞分裂素(6BA）浓度对芦荟分化的影响配方处理6BA浓度（mg/L）接种芽数（块）增殖后芽数(块)分化倍数I1.0631592。5II2。0581432.5III3.0702303.3IV4.0651953.03。4 温度对芦荟分化的影响以MS+6BA3。0mg/L为试验培养基,将接种后的瓶苗置于温度分别为（17.5±2。5)ºC、(27.5±2。5

16、）ºC、(32.5±2。5）ºC和光照强度为500lx的条件下培养，2025天后观察、纪录分化结果.每处理设5次重复，每个重复5瓶,每瓶接种5块.从表5。2可以看出芦荟分化苗在培养温度（27。5±2.5)下生长和分化情况最好，分化倍数达到3.3倍,且大小芽均多，叶色青绿；在培养温度（32。5±2.5）下分化倍数也达到3。0倍，但是生长较差，分化芽易老话，而在培养温度在（17。5±2。5）下分化苗长势较弱，分化倍数也低至1。8倍.表5.2 温度对芦荟分化生长的影响处理培养温度(）接种芽数(块）增殖后芽数(块）分化倍数（1）17。 5&#

17、177;2。553941.8（2）27。5±2。5622073.3（3）32。5±2。5581763。03。5光照对芦荟分化生长的影响以MS+6-BA3。0mg/L为试验培养基,将接种后的瓶秒置于光照强度分别为10、500、3600lx和温度为27。5 ºC的条件下培养,20-25天后观察、纪录分化结果。每处理设5次重复，每个重复5瓶，每瓶接种5块。光照对芦荟增殖阶段的不定芽生长和分化有明显的影响.在10lx光照条件下（几乎黑暗），芦荟不定芽分化率最低，为2.0倍，且长势弱,芽小呈黄绿色，易出现白化现象；在500lx光照条件下，不定芽分化倍数最高,为3。3，且长势

18、良好，大芽较多,叶色青绿偏黄有光泽;在1500lx和3600lx光照条件下，不定芽的分化倍数均较高,为2。5倍,长势也较好，叶色浓绿,但不定芽明显矮化、无光泽。如果光照过强,加上温度过高（35），分化苗容易出现毫无生气的僵化状态，这不利于芦荟苗快速繁殖。3.6无机盐对芦荟苗生根的影响实验结果表明,以低浓度的无机盐对促进生根效果较好，其生根率明显比高浓度的无机盐高，平均生根条数也较高，但根平均长和根最长等性状却较差，可见1/2MS对促进生根有效，但却缺少营养供根生长。从实验中还可看出，无机盐浓度为MS时，苗木出现徒长现象,这样就会降低对外界环境的适应能力，不利于组培苗移栽的成活。因此，在生根培养

19、时,较低浓度的无机盐对生根诱导培养效果较好。3.7活性炭对芦荟生根的影响活性炭具有强大的吸附能力，它主要吸附非极性物质和色素等大分子，可以减少一些有害物质的影响。研究认为加入活性炭对诱导芽生根成苗作用较大,还能促进芽生长粗壮。在生根成苗培养阶段加入0. 3 g/l的活性炭，非常必要。本次生根实验，在各处理中都加入了0。 3 g/l的活性炭，从实验结果可看出，活性炭的确对生根培养起到一定的促进作用。3.8不同栽培机质对芦荟组培苗生长的影响 将组织培养获得的芦荟生根苗每50棵分别移栽于珍珠岩、锯末为移栽介质的育苗盘中,保证移栽初期80%以上的湿度，25左右的室温.结果表明:以锯末作为移栽介质缓苗较

20、快，新根数量较多，恢复长势快，移栽成活率明显高于珍珠岩，可达90%以上。且锯末成本低,从工厂化育苗的角度来看,锯末是一种较好的移栽介质。3。9不同栽培气候条件对芦荟组培苗生长的影响 不同的栽培时间,组陪苗的成活率有着较大的差异,春季成活率最高,其次为冬季栽培，夏季栽培成活率最低,三者时间有着显著的差异。在株高，单株重两个指标上，春季栽植也都最高，与夏季、冬季栽培呈显著差异.冬季、夏季栽培成活率低与高温、低温条件下组培苗烂根、烂苗有一定的关系，为此，需在瓶苗炼苗时采取一些相应的措施。4芦荟组织培养中褐化与玻璃化控制4。1褐化对芦荟组培的影响及控制 在芦荟的组织培养过程中,常出现褐化现象,影响培养

21、物的生长发育，导致培养物部分组织死亡，甚至整个培养物死亡。褐化一般是外植体向外分泌的酚类与蒽醌类等化合物被氧化所致。克服或减轻褐化的方法很多，如选择生长发育旺盛的培养物，其褐化程度明显小于生长发育弱的；在培养基中加抗氧化剂，如聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 、抗坏血酸和活性炭、复合氨基酸、水解酶蛋白等；适时切除培养物的褐化部分；适时转接,提高转接次数,随继代次数增多，使褐化逐渐减轻以至不影响组织生长和芽分化 。还有人认为，可以通过降低培养温度和光照强度加以解决。4。2玻璃化对芦荟组培的影响及控制 玻璃化现象是组织培养中一种常见的生理病变,它在植物快速繁殖中可造成极大损失，是试管苗生产中亟待解决的一个

22、难题.芦荟组织培养中玻璃化现象也较为严重，尤其是在初代培养及 继代次数较高时。导致芦荟组织培养玻璃化的因素很多,包括升汞消毒时间、BA浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度、活性炭浓度、光照、培养时间和继代次数等。升汞消毒时间延长会增加玻璃化苗比率，原因可能与升汞在细胞体内残留，影响细胞分化有关，抑制甚至会杀死丛芽。高浓度BA(5mg/L），玻璃化苗之所以增加，可能与高BA刺激细胞快速分裂，导致新生小芽过多,营养供应跟不上有关，因为BA浓度高时，愈伤组织疏松极大，极显玻璃化；而BA浓度低，愈伤组织疏密或出现芽点状突起，可直接分化成芽。很多学者从不同的角度探索了控制玻璃化的方法,如适当降低培养基中细胞分裂素(

23、BA)浓度、增加培养基中的糖含量和琼脂含量、向培养基中加入0。3活性炭等 .除此之外，高浓度的琼脂 (11g/L）、50mg/L根皮苷、强光照（3000 lx） 都有利于降低玻璃化率 ；还有学者认为可以降低细胞分裂素浓度来控制玻璃化现象。5结果与分析5。1芦荟外殖体的诱导的两种途径一是通过茎尖或茎段诱导腋芽产生不定芽而获得无菌苗增殖；二是通过茎尖或茎段诱导愈伤组织,再从愈伤组织诱导分化出不定芽，然后用不定芽增殖。从快速繁殖种苗的角度来看,以第一种诱导途径效果较好,因为芦荟通过茎尖诱导很容易诱导出不定芽,省去了诱导愈伤组织的步骤，缩短了诱导时间,而且可以减少种苗变异率。5.2快速增殖芦荟通过茎尖

24、诱导腋芽的方法能快速地诱导出不定芽，再将诱导出的不定芽转至分化培养基，可快速获得增殖效果.在前4代的继代培养基中，以MS培养基中添加6BA3。0mg/L及NAA0。1mg/L的培养基分化效果最好，以后需要根据实际情况降低6-BA的浓度.培养条件以温度（27。5±2.5）、平均自然光照500lx为最佳。5.3细胞分裂素对分化的影响 芦荟组织培养时较容易分化。在开始启动分化及随后的12代培养中，只用较高浓度的细胞分裂素6-BA(3。44.0mg/L）,有利于快速繁殖，但是在第四代之后,需要逐渐减少用量，并视生长情况增减6BA浓度。因为长期高浓度的6-BA容易使分化芽肿胀，愈伤组织增加,甚至出现白化苗现象。6。结论芦荟的组织培养是解决芦荟种苗来源的一个重要途径，是实现芦荟产业化生产的基础。虽然目前有少数芦荟品种的组织培养获得成功，但对这些品种的外植体选择、培养基的设计、植物生长调节物质和培养条件的控制等方面，还有待进一步研究，以提高芦荟的繁殖率和存活率；同时要对其它品种进行研究,摸索合适的组培方法。另一方面,芦荟的组培还仅限于试验研究和小规模生产,需要探索组培条件的控制，实现芦荟种苗生产工厂化、自动化,才能满足产业化需求。最后，还应把芦荟的组