植物组织培养第四章

1、第四章 植物组培的理论基础教学目的、要求：理解愈伤组织、胚状体、细胞全能性、分化与脱分化等概念，掌握影响分化与脱分化的关 键因素。重点：愈伤组织、胚状体、细胞全能性、分化与脱分化等概念。难点：影响分化与脱分化的关键因素。1引言动物细胞的分化一般是不可逆的。植物则不同，只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分 化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。1 9 5 8年以来实验已反复证实，无论是体细胞，还是性细胞，离体之后在一定的培养条 件下都有可能像受精卵一样发育成一个完整的植株。一个细胞所具有的产生一个完整植株 的固有能力称做细胞的 全能性” t o ti po te

2、n cy）。细胞在植物体内即使已进行了最终的分化后仍有可能保持着这种全能性。一个已分化细胞 若要表现其全能性首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。再分化有两种方式，一种是器官发生，一种是胚胎发生。2愈伤组织形成的条件在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周 围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋矛它的一定的功能，而不 具备施展其全能性的外部条件。一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培 养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。 3愈伤组织形成的过程王凯基等（

3、19 8 1）以离体培养的油橄榄茎段为材料，对其愈伤组织形成过程中各时期 的细胞形态和代谢状况的变化做了详细研究，现将他们的结果概述如下：3.1诱导期诱导期是外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期外植体细胞大小虽然没有多大变化, 但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。诱导期的长短由一系列内 外因素决定，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要2 2 h，但菊芋块经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到4 0 h以上。3.2 分裂期外植体外层细胞开始迅速分裂，不过外植体中间部分的细胞不分裂，形成了一个静止的芯。 在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细

4、胞体积迅速变小，逐渐回复到 分生状态。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分 裂进入了高峰期。外植体细胞由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰，回 复为分生状态，这整个过程即为脱分化脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织。愈伤组织在培养基上生长一段时间以后, 由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过 程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。然而，如果让 愈伤组织留存原来培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化。3.3形成期形成期是指外植体细胞经过诱导期和

5、分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的 平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的分生组织(meristemoid)，称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或 者进一步分化为维管组织结节一一由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细 胞，包围着内部已分化的管胞形成。4愈伤组织增殖的方式为了研究愈伤组织在培养期间的形态变化，Caplin ( 1 9 7 4 )把已建成的烟草愈伤组织 切成的小方块，置于琼脂培养基上培养。结果发现，愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培 养基接触的

6、表面。由于小方块组织迅速增殖，加之在其表面或近表面瘤状物的生长，数周 之后小方块变成了一个表面不规则的菜花状组织。5愈伤组织状态的调控优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的23个特性：1、高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。2、容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生 质体。3、旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。4、经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。为了达到以上目的，诱导愈伤组织时通常采取的策略是：（1）选择适当的基因型和适当的外植体；（2）选择正确的培 养基；（3）采

7、用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。6细胞分化植物细胞分化是植物发育过程中的一个十分重要的基本事件。无论是在离体还是在活体条 件下，植物细胞分化的研究重点是维管组织的分化，特别是木质部成分的分化。6.1影响维管组织分化过程的因子生长素和蔗糖是对维管组织分化过程有显著影响的两种物质。它们能从质和量两个方面影 响维管组织的分化。某些证据还指出，细胞分裂素和赤霉素也可能与木质部发生过程有关。6.1.1 生长素法国植物学家Camus （ 1 9 4 9 ）曾把小的营养芽嫁接在一种菊芋属植物根的组织培养 物的上表面，几天之后，在芽下的薄壁组织中分化出了维管束。含有蔗糖和生长素的琼脂能有

8、效地取代芽的作用，同样能够诱导维管组织的分化。一般来说，低浓度的生长素能刺激木质部的发生，在生长素浓度和木质部分化程度之间存 在着一种反比关系。蔗糖（洋丁香）1%蔗糖，在愈伤组织中只能形成数量很少的木质部分子。2 %蔗糖，则有利于木质部的形成，但韧皮部却很少形成甚至不形成。2 .5% 3.5%蔗糖，木质部和韧皮部都能分化，为4 %时，所形成的维管组织只是韧皮部, 很少或没有木质部。与洋丁香不同，在爬山虎悬浮培养中，当蔗糖浓度一直增加到8 %时，木质部分子也随之 增加。细胞分裂素和赤霉素Bergma nm （1 964）证明，若在含有5 %椰子汁的培养基中每升加入1 07 g激动素， 在烟草中能

9、使导管的分化提高3 0 %.Fosket和Torrey（ 1 969）以大豆子叶愈伤组织所做的研究，也证明了细胞分裂素对木质部发生的刺激作用。Bornman(1 974)还报道，对于烟草愈伤组织木质部发生来说，在I AA和激动素之间存 在着一种协同作用。6.1 .4 物理因子在向日葵中，温度若低于17 0C,导管分子不能分化，在1 73 1 0C的范围内，木质部 的形成随温度的增加而增加。另外，光对洋紫苏创伤导管的分化有刺激作用。6.2 细胞分裂对木质部分化的必要性一般来说，能够刺激木质部分化的化学因子，如生长素、细胞分裂素和糖等，同样也是能 调控细胞分裂因子。由此产生的一个问题是，对于影响导

10、管分子的形成来说，这些激素是 作用于分化过程本身呢，还是作用于分化前的细胞分裂？ Dodds( 1 979)也提出了一个与此 有关的问题：细胞分裂对于木质部细胞分化是否必需呢？ ”7器官分化本章将讨论在离体条件下茎芽分化中的某些问题。通过体细胞胚胎发生途径再生植株的问 题将在第6章中讨论。7.1影响茎芽分化的因素7.1 .1 化学因素1 9 4 8年，Skoog 和崔徵最先报道了在烟草的组织培养物中器官形成受化学控制的事 实。浓度低到5 ymol/L的I A A即足以完全抑制茎芽的自发分化。当与激动素或腺嘌呤结合使 用时，生长素可以抵消它们促进茎芽形成的作用。据Skoog(1971)估计，要抵

11、消1个分子 I A A对茎芽分化的抑制作用，需要有1 5 0 0 0个分子的腺嘌呤或2个分子的激动素。在结合使用时，若I AA的相对浓度较高，则有利于细胞的增殖和根的分化，若腺嘌呤或激动素的相对浓度较高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时，则仍产生无结构的愈伤组织。7.1 .2物理因素培养烟草组织薄层时，随着培养基中琼脂浓度的变化，形态发生的方式出现了令人惊异的 改变。当琼脂为1 %时，只能形成花；随着琼脂浓度的下降，花的形成频率减少，营养芽 的分化出现。在液体培养基中，这种组织则只能愈伤化和分化营养芽。7 . 2茎芽分化的解剖学和细胞学附录愈伤组织鲜重的测定方法1. 物材料（如萬苣

12、髓、胡萝卜或大豆子叶等）诱导愈伤组织。须注意，测定鲜重可用同一 批外植体，即在测定了每个外植体的鲜重之后，可再把同一个外植体置于烘箱中烘干，测 定干重。若在培养7d，14d和21d后各取样10个外植体，则先后共需测定30个外植体。2. 在离休培养开始之前或之后，再额外制备至少1 01 5个与进行培养的外植体一模一样的 外植体。对这些外植体不进行培养，因此制备时不要求无菌条件。3. 在蒸馏水中稍许漂洗之后，将这些非培养用的外植体置于培养皿中双层滤纸之上。将培 养皿盖上，以防止这些外植体过度失水。4. 待这些外植体的表面水分被滤纸吸净之后，将它们置于铝箔称量皿中，用精密分析天平 逐个称重。5. 在用于诱导愈伤组织的外植体中，每经过一定时间（例如7d，14d和21d）培养之后， 取出1 0个已愈伤化的外植体逐个称重。注意，在把它们置入称量皿之前，应先把愈伤组织 样本由培养基转到铺有滤纸的培养