高中生物选修1_血红蛋白的提取和分离ppt课件

1、血红蛋白的提取和分别血红蛋白的提取和分别2 2答答1 1提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNADNA的难度大。的难度大。这是由于，与这是由于，与DNADNA相比，蛋白质对温度、盐相比，蛋白质对温度、盐浓度、浓度、pHpH等条件要敏感得多，很容易失活；等条件要敏感得多，很容易失活；2 2并且蛋白质的空间构造多种多样，理并且蛋白质的空间构造多种多样，理化性质各不一样，使得蛋白质的提取没有化性质各不一样，使得蛋白质的提取没有一种一致的方法，只能根据特定蛋白质的一种一致的方法，只能根据特定蛋白质的特性探求提取的条件，设计特定的方法。特性探求提取的条件，设计特定的方法。P57练习：练习：复习复习:1、呵

2、斥蛋白质构造多样性的缘由？、呵斥蛋白质构造多样性的缘由？2、举例阐明蛋白质功能的多样性。、举例阐明蛋白质功能的多样性。 根据蛋白质的哪些特性，可以将不根据蛋白质的哪些特性，可以将不同种类的蛋白质别分开来？同种类的蛋白质别分开来？ 分子的外形和大小、所带电荷的分子的外形和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。其他分子的亲和力等。一一 凝胶色谱法分配色谱法凝胶色谱法分配色谱法 1、定义：、定义： 根据相对分子质量的大小分别蛋白根据相对分子质量的大小分别蛋白 质的有效方法。质的有效方法。 2.原理：原理： 相对分子质量较小的蛋白质容易进相

3、对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，挪动较慢；入凝胶内部通道，路程较长，挪动较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部挪动，凝胶内部通道，只能在凝胶外部挪动，路程较短，挪动较快，从而分别。路程较短，挪动较快，从而分别。根底知识根底知识二二 缓冲溶液：缓冲溶液： 1、缓冲作用： 在一定范围内，缓冲溶液可以抵抗外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持溶液pH根本坚持不变。 2、配制原那么： 1缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成的。 2调理缓冲剂的运用比例可以制得在不同范围内运用的缓冲液。弱酸和弱酸盐：弱酸和弱酸盐：H

4、2CO3NaHCO3 H2CO3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COOHCH3COONaCH3COONa弱碱和弱碱盐：弱碱和弱碱盐：NH4OHNH4CINH4OHNH4CI3、缓冲溶液的作意图义 生物体内的进展的各种化学反响都生物体内的进展的各种化学反响都是在一定的是在一定的PH下进展的，为了可以在实下进展的，为了可以在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必需坚持体外的就必需坚持体外的PH与体内的根本一致。与体内的根本一致。因此缓冲溶液的正确配制和因此缓冲溶液的正确配制和PH的准确测的准确测定，在生物化学的研讨任务中有着极其定，在生物化学的研讨任务中有着

5、极其重要的意义。重要的意义。三电泳：三电泳： 1、概念：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2、原理：样品中各种分子带电性质、分子大小、外形的不同，使带电分子产生不同的迁移速度。3、常用的电泳方法：、常用的电泳方法： 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳回答以下问题：回答以下问题：1、测定蛋白质分子量通常运用哪种电泳、测定蛋白质分子量通常运用哪种电泳方法？方法？2、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的？、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的？3、SDS是什么物质？在测定蛋白质分子是什么物质？在测定蛋白质分子量时起什么作用？量时起什么作用？4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分、用聚

6、丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是什么？子量的原理是什么？实验操作实验操作:蛋白质提取和分别普通步骤：蛋白质提取和分别普通步骤：1、样品处置、样品处置2、粗分别、粗分别3、纯化、纯化4、纯度鉴定、纯度鉴定一、样品处置：一、样品处置：一根底知识：一根底知识：1、血液的组成：、血液的组成：2、血红蛋白的构造：、血红蛋白的构造： 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中约最多。在红细胞的组成中约90%是血红蛋白。是血红蛋白。 血红蛋白由四个肽链组成，包括两个血红蛋白由四个肽链组成，包括两个-肽肽链和两个链和两个-肽链。其中每条肽链环绕一

7、个亚铁肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。二样品处置步骤：二样品处置步骤：1.红细胞洗涤：红细胞洗涤：1洗涤红细胞的目的是什么？洗涤红细胞的目的是什么？2如何分别红细胞？如何分别红细胞？3如何洗涤红细胞？如何洗涤红细胞？去除杂蛋白，以利于后续步骤的分别纯化。去除杂蛋白，以利于后续步骤的分别纯化。离心离心取红细胞取红细胞反复洗涤反复洗涤 将红细胞液体倒入烧杯，参与五倍体将红细胞液体倒入烧杯，参与五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌积的生理盐水，缓慢搅拌

8、10min，低速短，低速短时离心，如此反复洗涤三次，直至上清液时离心，如此反复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，阐明红细胞已洗涤干净。中没有黄色，阐明红细胞已洗涤干净。2.血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：1如何释放血红蛋白？如何释放血红蛋白？2运用蒸馏水、甲苯有何作用？运用蒸馏水、甲苯有何作用？4采集的血样为什么要及时并采用低速短时采集的血样为什么要及时并采用低速短时离心分别红细胞？离心分别红细胞？5为何要用生理盐水反复洗涤三次？为何要用生理盐水反复洗涤三次？ 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用0.9%生生理盐水是为了坚持红细胞内外正常的浸透压，防止理盐水是为了

9、坚持红细胞内外正常的浸透压，防止细胞破裂。细胞破裂。 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分别的效果。达不到分别的效果。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。3.分别血红蛋白溶液：分别血红蛋白溶液：1如何分别血红蛋白？如何分别血红蛋白？离心离心分层分层过滤过滤分液分液2离心后分几层？每层各是什么物质？离心后分几层？每层各是什么物质？分分4层；自上而下，第一层是层；自上而下，第一层是无色透明的甲苯层，第二层无色透明的甲苯层，第二层是白色薄层固体，是脂溶性是白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第三层是红物质的沉淀层，第

10、三层是红色透明液体，是血红蛋白水色透明液体，是血红蛋白水溶液，第四层是其他杂质的溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。暗红色沉淀物。4.透析：透析：1如何透析？如何透析？2透析袋用什么制成？作用是什么？透析袋用什么制成？作用是什么？3透析目的是什么？透析目的是什么？ 透析袋普通是用硝酸纤维素又称玻璃透析袋普通是用硝酸纤维素又称玻璃纸制成的。透析袋能使小分子自在出入，纸制成的。透析袋能使小分子自在出入，而将大分子保管在袋中。而将大分子保管在袋中。 透析可以去除样品中分子量较小的杂质，透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于改换样品中的缓冲液。或用于改换样品中的缓冲液。血红蛋白溶液血红蛋白溶液

11、透析袋透析袋 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 二、凝胶色谱操作：二、凝胶色谱操作：1、凝胶色谱柱的制造：、凝胶色谱柱的制造：2、凝胶色谱柱的填装：、凝胶色谱柱的填装：3、样品的参与和洗脱：、样品的参与和洗脱：1为什么要根据色谱柱内的体积计算所需为什么要根据色谱柱内的体积计算所需求的凝胶量？求的凝胶量？2本实验运用的什么凝胶？称号中本实验运用的什么凝胶？称号中“G和和75各表示什么意思？各表示什么意思？ 用凝胶色谱法进展洗脱的目的是将相对用凝胶色谱法进展洗脱的目的是将相对分子质量大的杂质除去。分子质量大的杂质除去。 三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： 判别纯化的蛋白质能否到达要求，判别

12、纯化的蛋白质能否到达要求，进展蛋白质纯度的鉴定。进展蛋白质纯度的鉴定。思索以下问题：思索以下问题：1.1.蛋白质提取和分别的四个步骤分别表达蛋白质提取和分别的四个步骤分别表达在那些实验操作中？在那些实验操作中？ 首先经过洗涤红细胞、血红蛋白的释首先经过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即样品的处置；再经过透析去除分子量较小样品的处置；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分别；然后经过凝胶的杂质，即样品的粗分别；然后经过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝

13、胶电即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。泳进展纯度鉴定。2. 血红蛋白有何特点？这一特点对进展血红蛋白有何特点？这一特点对进展蛋白质的分别有什么意义？蛋白质的分别有什么意义？3.如何判别血红蛋白分别能否胜利？如何判别血红蛋白分别能否胜利？ 因含有血色素而呈红色，在样品洗脱时，可经过颜色来判别什么时候搜集洗脱液。使操作变得直观、简化了操作步骤。 假设血红蛋白红色区域均匀、狭窄、假设血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平整，那么分别胜利；假设血红蛋白红色平整，那么分别胜利；假设血红蛋白红色区域歪曲、散乱、变宽，那么不胜利。区域歪曲、散乱、变宽，那么不胜利。 假设填装不严密、不均匀，有气泡，假设填装不严密、不均匀，有气泡，会构成无效空隙，使本该进入凝胶内部的会构成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中经过，扰乱洗脱液样品分子从这些空隙中经过，扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分别效果。中蛋白质的洗脱次序，降低分别效果。4.填装凝胶色谱柱为什么要严密不能有气填装凝胶色谱柱为什么要严密不能有气泡？泡？5.用什么方法加速枯燥的凝胶颗粒膨胀？用什么方法加速枯燥的凝胶颗粒膨胀？