醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质ppt课件

1、醋酸纤维薄膜电泳分别血醋酸纤维薄膜电泳分别血清蛋白质清蛋白质山西大学生科院生化教研室一、实验目的一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的普学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的普通原理通原理二、实验原理二、实验原理电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极挪动的景象。在一定极挪动的景象。在一定pHpH条件下，不同的质点由于具条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因此在一定的有不同的等电点而带不同性质的电荷，因此在一定的电场中它们的挪动方向和挪动速度也不同，即它们的电场中它们的挪动方向和挪动速度也不同，即

2、它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分别电泳迁移率不同，因此，可使它们分别影响电泳迁移率的外界要素：电场强度、溶液的影响电泳迁移率的外界要素：电场强度、溶液的pHpH值、值、溶液的离子强度和电渗景象溶液的离子强度和电渗景象影响电泳迁移率的内在要素：质点所带净电荷的量、影响电泳迁移率的内在要素：质点所带净电荷的量、质点的大小和外形质点的大小和外形采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附景象

3、等优点和吸附景象等优点醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所构成的纤维素醋酸酯，将它溶于醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所构成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等后，涂抹成均匀的有机溶剂如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等后，涂抹成均匀的薄膜那么成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的构造，厚度约薄膜那么成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的构造，厚度约为为120 m120 m，有很强的通透性，对分子挪动阻力很小，有很强的通透性，对分子挪动阻力很小本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分别各种血清蛋白。血清中含有本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分别各种血清蛋白。血清中含有清

4、蛋白、清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及外形不同，在电场中的迁移速白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及外形不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6pH8.6的缓冲体系的缓冲体系中电泳，染色后可显示中电泳，染色后可显示5 5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其他依条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其他依次为次为1-1-、2-2-、-及及-球蛋白球蛋白实验原理实验原理三、实验器材三、实验器材v1.DYY-21.D

5、YY-2型常型常压电泳仪：北京压电泳仪：北京市六一仪器厂消市六一仪器厂消费，费，1 1套套/2/2组。组。 v操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线衔接。电泳槽有两个成，两者之间有专门的连线衔接。电泳槽有两个相互隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，相互隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可挪红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可挪动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，构成了滤纸桥。两杆之间的间隔调浸入缓冲液中，

6、构成了滤纸桥。两杆之间的间隔调理到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤理到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上，。稳压电源用于调理电压维薄膜就搭在滤纸桥上，。稳压电源用于调理电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源衔接好后，将点和通电时间。当电泳槽和稳压电源衔接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进展电泳。留意电泳槽的电极方电，调整好电压，进展电泳。留意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改良为数显式的目前，该

7、电泳仪已改良为数显式的DYY-6CDYY-6C型。型。 v2.2.醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜2 2 cmcm8cm8cm：2 2片片/ /人。人。 v3.3.培育皿：一排桌子培育皿：一排桌子即即4 4组公用组公用5 5套，包套，包括平衡、染色各用一套，括平衡、染色各用一套，漂洗用漂洗用3 3套。套。 v4.4.点样器：一个点样器：一个/ /组。组。 v5.5.滤纸：公用。滤纸：公用。 v6.6.玻璃板：一块玻璃板：一块/ /组。组。 v7.7.镊子：一个镊子：一个/ /组。组。 v8.8.玻棒：公用。玻棒：公用。 四、实验试剂四、实验试剂v1 1巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液pH8.6pH8.6，离子

8、强度，离子强度0.070.07：巴比：巴比妥妥2.76g2.76g，巴比妥钠，巴比妥钠15.45g15.45g，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000mL1000mL。 v2 2染色液：氨基黑染色液：氨基黑10B 0.25g10B 0.25g，用甲醇，用甲醇50mL50mL、冰醋、冰醋酸酸10mL10mL、水、水40mL40mL溶解可反复运用。溶解可反复运用。 v3 3漂洗液：甲醇或乙醇漂洗液：甲醇或乙醇45mL45mL，冰醋酸，冰醋酸5mL5mL，水，水50mL50mL，混匀。混匀。 v4 4透明液仅在定量分析时运用：无水乙醇透明液仅在定量分析时运用：无水乙醇7 7份，份，冰醋酸冰醋酸3 3

9、份，混匀。份，混匀。 五、实验操作五、实验操作浸泡：将浸泡：将2 28 cm8 cm醋酸纤维薄膜迎着光区醋酸纤维薄膜迎着光区分光泽面和无光泽面。在无光泽面距短分光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端边一端1.5 cm1.5 cm处用铅笔悄然画一条点样处用铅笔悄然画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡泡30 min30 min方可用于点样方可用于点样点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上无光泽面朝上。在另铺在玻璃板上无光泽面朝上。在另一一 载玻片

10、上滴一滴血清，点样器用盖载玻片上滴一滴血清，点样器用盖玻片的一边在血清上蘸一下可来回玻片的一边在血清上蘸一下可来回挪动一次，再将点样器轻印在加样线挪动一次，再将点样器轻印在加样线上，使血清浸透到薄膜内，构成均匀的上，使血清浸透到薄膜内，构成均匀的直线直线电泳槽的预备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸适宜的滤纸条。在电泳槽的预备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸适宜的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支

11、架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒悄然挤压在膜支架上的滤纸以缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒悄然挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上点样面朝电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡下，另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min10 min。通电，调理电压至通电，调理电压至160 V160 V，电流强度为，电流强度为0.40.40.6 mA

12、/cm0.6 mA/cm膜宽度，电泳时间膜宽度，电泳时间约约25 min 25 min 染色：电泳终了后将薄膜取下染色：电泳终了后将薄膜取下, , 放在含氨基黑放在含氨基黑10B10B染色液的培育皿中浸染色液的培育皿中浸泡泡5 min5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带明晰为止，可得到色带明晰的电泳图谱脱尽，条带明晰为止，可得到色带明晰的电泳图谱 卧式程度电泳槽卧式程度电泳槽 六、本卷须知六、本卷须知市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选

13、膜是电泳成败的关键之一。假设飘浮于液面的薄膜膜是电泳成败的关键之一。假设飘浮于液面的薄膜在在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，那内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，那么此膜均匀可用于电泳么此膜均匀可用于电泳醋酸纤维素薄膜电泳常选用醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，那么与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，那么区带泳动速度快区带分散变宽；缓冲液浓度过高，区带泳动速度快区带分散变宽；缓冲液浓度过高，那么区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分那么区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨辨点样时，应将薄膜外表多余的缓冲液用滤纸吸去，点样时，应将薄膜外表多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品分散。但不宜太干，否那么样品不易以免引起样品分散。但不宜太干，否那么样品不易进入膜内，呵斥点样起始点参差不起，影响分别效进入膜内，呵斥点样起始点参差不起，影响分别效果果点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分别效果膜片或印出凹陷影响电泳区带分别效果电泳时应选择适宜的电流强度，普通电流强度为电泳时应选择适宜的