EPC-10膜片钳放大器的使用

1、EPC 10膜片钳放大器的使用EPC 10膜片钳放大器的使用- 17 -一、概述德国HEKA公司生产的EPC（Extracellular patch clamp）系列放大器的早期型号为EPC 5，这是世界上最早的膜片钳放大器。此后陆续升级为EPC 7、EPC 8、EPC 9和EPC 10，EPC 9和EPC 10为全电脑控制的膜片钳放大器。目前EPC放大器的最高版本为EPC 10膜片钳放大器（截至到2011年7月），有EPC 10 USB和EPC 10 Plus两大类机型。本文讲解EPC 10 USB的使用。EPC 10 USB膜片钳放大器主要有如下应用：l 单通道记录：可记录亚pA级的单离子

2、通道电流。l 低噪声全细胞膜片钳记录、电压钳/电流钳/低频电压钳（LFVC）记录：可记录全细胞膜各种离子通道电流、细胞动作电位等。l 传统细胞内记录：可记录动作电位、细胞放电等。l 使用金属电极的场电位记录：如整体动物与脑片的诱发场电位记录。l 突触长时程增强(LTP)/长时程抑制(LTD)记录：整体动物与脑片的LTP/LTD记录。l 松散封接记录、人工脂膜离子通道、纳米孔等的记录：放大器探头有足够的大电流测量能力，最大可测量2 A的电流。l 离子选择性测量：采用离子选择性电极检测溶液中某一离子浓度。l 电化学检测（伏安法/安培测量法）：如采用碳纤电极的细胞或膜片安培测量法，检测细胞某些物质的

3、释放。l 细胞胞吞/胞吐或突触递质释放的研究：采用膜电容测定法，可测量因细胞胞吞、胞吐或突触递质释放所引起的全细胞膜电容的微小变化。EPC 10膜片钳放大器具有如下显著特点：l 仪器面板的各个功能钮/键均为计算机控制，所有操作均在程序面板中通过鼠标与键盘进行。l 面板程序可在PC机（Windows 2000XPVista操作系统）和苹果机（Mac OS 10.4 及以上版本操作系统）上运行。l 放大器本底噪声小于90 fA。l 探头有三种反馈电阻，可测量的最大电流分别为200 pA (50 G)、20 nA (500 M)、2 A (5 M)，测量范围满足绝大多数电生理实验信号的要求。l 电极

4、电容（快电容）和膜电容（慢电容）补偿可自动进行。l 液接电位实现了自动校正，无需其他常见膜片钳放大器的手工计算与校正。l 具有Lock-in放大器功能，可对膜电容微小变化进行精确检测，用于与膜面积有关的细胞分泌等的研究。l 通过软件扩展功能，可进行离子浓度荧光检测，实现光电联合检测。EPC 10 USB主要具有如下四种机型：1) EPC 10 USB：含有一个探头，为一台膜片钳放大器。2) EPC 10 USB Double：含有两个探头，为两台组合在一起的EPC 10放大器。3) EPC 10 USB Triple：含有三个探头，为三台组合在一起的EPC 10放大器。4) EPC 10 US

5、B Quadro：含有四个探头，为四台组合在一起的EPC 10放大器。上述任何一种机型在机箱内都包含一个LIH 8+8 AD/DA转换器，提供4个DA输出通路，满足每个放大器同时输出刺激的需要；同时提供8个独立的AD通路，满足独立的放大器对电流、电压信号的输入。对于含有多个放大器的EPC 10 USB机型，可通过放大器软件面板选择某一放大器，使其激活。被激活的放大器可接受软件设置的命令，并在放大器面板上通过Digital Bus绿灯显示，当有软件命令输出给放大器时，Digital Bus灯会闪烁。未被激活的放大器不能接受命令信号，但只要选择上，仍然可随时被激活。以下介绍的是EPC 10 USB

6、。二、探头（一）探头特点（1）EPC 10的探头呈狭窄长条形，体积较小，这样设计的目的是为了在有限的显微镜工作距离下，便于记录电极的操作。（2）探头表面有探头的序列号，如果是Double机及以上机型，探头表面还有“Probe 2”等字样。（3）底部有能固定在微操纵器上的塑料底座适配器，可与绝大多数类型的微操纵器直接进行匹配。在购置某些微操纵器时，要注意选择与探头匹配的适配器。（4）探头内部有一个电流-电压转换器（Current-to-voltage converter），即摄入电流，输出电压。这与一般的微电极放大器探头不同，后者摄入和输出的均为电压。（5）探头具有5 M、500 M和50 G三

7、种反馈电阻，分别用于记录双分子层膜、松散封接模式、大细胞等的大电流（2 A），一般的全细胞电流（20 nA）和单通道电流（200 pA）。（二）探头连线（1） 信号输入端口：用聚四氟乙烯（Teflon，白色）绝缘的BNC插口，与电极夹持器（Holder）直接连接。（2）地线连接口（GND）：为黑色插孔，承载高质量接地信号，用于将浴池（参比）电极接地，也可用于将探头附近的物体（如显微镜）、屏蔽设施等接地。该接地口通过探头电缆线与放大器前面板上的信号地（Signal GND）相连通。（三）探头使用注意事项l 在放大器开启的情况下，应尽量避免用手直接触碰信号输入端口，否则可能由于手上带有静电而损伤探

8、头内部电路！在更换玻璃电极时，若一定要触碰信号输入端口，请一定先除去手上的静电（通过触摸其他金属物体，如屏蔽网等），再触碰信号输入端口。l 若由于探头损坏而更换探头，则需要在连接新探头后对放大器进行校正，方法为：开启EPC 10，预热30 min后，放大器与探头均处于正常工作的温度。打开Patchmaster软件的EPC 10_USB菜单，选择Test and Calibrate条目，即可对EPC 10放大器进行全方位校正。校正的内容包括放大器软件面板上所有的数码开关和控制按钮，这些结果仅是针对正在被校正的放大器的，不适用于其他EPC 10放大器。校正的结果可存储为Scale.epc文件。该校

9、正应该每隔半年进行一次，如果发现放大器的频响不准确或者偏移比较明显时，应随时进行校正。校正过程耗时5-10 min，依计算机的速度而异。放大器校正后，再用Re-Initialize EPC10_USB功能对放大器进行初始化。三、电极夹持器为了获得低噪声记录，电极夹持器必须直接插入探头中。不推荐将电极夹持器屏蔽的做法，因这样可引入更多的随机噪声（背景噪声可增加1-2倍），这些随机噪声来自夹持器塑料材质（聚碳酸酯）的非理想化绝缘特性和液体水膜上的热电压波动。金属的屏蔽物质可使更多的噪声通过电容耦合方式进入放大器探头，尤其是单通道记录更不能屏蔽夹持器。聚碳酸酯具有低介电损失性，若自己制作电极夹持器，

10、要考虑采用低介电损失的材料，表面要具有疏水性，以防液膜的形成。聚碳酸酯是目前发现的符合上述特点的最佳材料。使用电极夹持器时，将银丝（长度一般在4.5 cm）焊接在铜针上，后者插入探头BNC插口内。银丝表面需要镀上AgCl，可用含Cl离子的溶液（如100 mM KCl溶液或生理盐溶液）电镀（与铜针焊接处部位的银丝不要电镀）。电极夹持器的噪声测定：将含有银丝电极的夹持器插入探头，探头用锡箔纸包裹，采用放大器的Noise Test功能测量噪声。良好的夹持器应该只增加噪声10%左右，例如从95到105 fA。四、模型细胞一般的膜片钳放大器均配备模型细胞，它的用途有如下两个：（1）用于模拟真实细胞的膜反

11、应，帮助初始者演练放大器各项功能的使用；（2）用于检测放大器的功能是否正常，如果用模型细胞检测放大器时没有问题，则表明放大器功能是正常的。与EPC 10放大器配备的是MC 10模型细胞，它通过BNC适配器与探头信号输入接口连接，通过另一根细线与探头GND接地口连接。其上有三个位置，通过扳手来选择：l 10 M位置：模拟电极入浴液，电极电阻为10 M。可模拟进行施加测试脉冲和补偿失调电位（如液接电位等）。l 中间的位置：模拟电极与细胞膜形成高阻封接，电极电容（及其他漂浮电容）为6 pF。可模拟进行电极电容（C-fast）的补偿功能。l 0.5G 位置：模拟形成了全细胞记录模式，串联电阻为5.1

12、M，膜阻抗为500 M（0.5 G），膜电容为22 pF。可模拟进行膜电容（C-slow）的补偿功能和电流钳模式，还可用于检测软件Patchmaster编辑输出的刺激脉冲。五、仪器面板（一）前面板1. Power Switch电源开关。为让放大器能正确地初始化，一般是要先开启放大器电源开关，再打开采样软件（Patchmaster或TIDA）。当然，在忘记先开启放大器时，也可通过采样软件重新对放大器进行初始化。注意，在开始实验前，放大器需要预热至少15分钟。2. Probe用于连接探头。3. Chassis Gnd (CHAS)EPC 10 放大器的机壳地。与大多数仪器一样，该机壳地与电源地相连

13、通。为避免形成地线环路，在放大器设计上，信号地与机壳地之间不直接连通，而是中间连接了一个10 的电阻。4. External Stim. Input CC外部来源的电压刺激信号从这里输入，放大器会根据需要设定的比例转化为刺激电流，可与放大器内部的电流刺激信号叠加，用于电流钳模式。5. External Stim. Input VC外部来源的电压刺激信号从这里输入，它们可与放大器内部的电压刺激信号叠加，用于电压钳模式。叠加的刺激信号通过2极滤波器滤波，以去除电压变化初始与结束时产生的跃迁，这避免了刺激命令处理电路出现非线性特性，同时也降低了电极电容快速充电时产生的电流瞬变值幅度。软件提供两个滤波

14、等级（用10-90%瞬变值幅度上升时间表示）：2 s（是防止放大器内部电路出现非线性化所需的最小上升时间）和20 s（最适合于那些除了最快速测量以外的所有测量，用于降低电容瞬变值幅度）。6. Voltage Monitor将电极上的电压输出给监视系统（如示波器），该电压是将输出给电极的电压放大了10倍。该输出的阻抗为50 。在Patchmaster的示波窗口中可显示原始的未被放大的信号。7. Current Monitor输出电极电流，该信号经过了在放大器软件面板中所设置的滤波器滤波。正电压与从电极输出的电流相对应。通常，左手边的输出（Filter 1）是经过放大器软件面板中Filter 1滤

15、波后的输出，可输出给数据记录装置（如磁带记录仪等），用于记录宽频信号，如可记录单通道活动。右手边的输出（Filter 2）是经过放大器软件面板中Filter 2额外滤波后的输出，用于输出给示波器，监视整个实验过程（如封接、破膜等）。上述任何一种输出都可在软件Patchmaster的示波窗口中显示。8. Signal GND为香蕉插口，是高质量的信号地，可用做膜片钳系统中其他仪器的公共地。9. Clipping这是一个二极管指示灯，当放大器输入电流饱和时该指示灯亮。在电压钳实验中，电容充放电伪迹将被电脑去除，而去除过程只有在不出现饱和的情况下完成，该指示灯起到这样一个监督的作用。特别地，虽然通过

16、滤波后输出的电压没有达到饱和，但如果滤波前输出的电压是饱和的，则该指示灯也会指示饱和！10. Digital Bus该指示灯显示计算机正发送数码信息到EPC 10放大器。11. A/D Inputs放大器内设的转换器（EPC 10采用LIH 1600，EPC 10 USB采用LIH 8+8）提供8个模拟/数码（A/D）输入通道，其中3个在仪器内部与EPC 10连接（若使用EPC 10 Double或EPC 10 Triple，则分别有5或7个与放大器在内部连接）。剩余的输入通道可提供给其他应用程序软件，如Patchmaster可利用这些通道监测从温度传感器、压力传感器或其他传感器的输出。12.

17、 Trigger In外部触发信号输入口。当在采样软件Patchmaster中的Pulse Generator选择Trigger Series或Trigger Sweeps时，外部触发信号通过该输入口触发放大器进行数据采集。13. Trigger OutputTTL触发输出。有3个输出，用于使其他设备与膜片钳实验同步化.14. D/A Outputs提供3个数码/模拟（D/A）信号输出通道（0-2），它们携带如下信号： DA-0 - Free (C-slow during Cap. Track)DA-1 - Free (G-series during Cap. Track)DA-2 Free在

18、Patchmaster采样软件的Capacitance-Tracking模式，DA-0和DA-1接口可作为特殊用途的输出口，这可在软件中设定。如果在EPC 10放大器软件面板中执行Cap Track功能，则DA-0将输出C-slow数值，DA-1将输出G-series（=1/R-series）的数值。上述数值是以电压形式输出的，G-series的转换因子为100 nS/V，C-slow的分别是0.5、5或50 pF/V（对应于30、100和1000 pF范围的电容值）。DA-2通常用于触发示波器或隔离器。注意：（1）当在软件面板中使用Reset时，上述输出的数值将都变为0。（2）当需要使用软件

19、面板Cap Track功能时，不能将DA-0和DA-1用做触发信号的输出。（3）这3个接口是输出口，千万不要将刺激信号从这里输入。（二）后面板EPC 10 USB后面板上有2个25针的连接口、1个40针的连接口和4个通信输入器口，用于放大器与其他设备的连接。1. USB接计算机USB 2.0口，连接放大器软件与EPC 10 USB主机。在连接有多个EPC 10 USB放大器时，为使采集时钟同步化，需要将一个放大器的MASTER SYNC和另一个放大器的SLAVE SYNC用标准CAT5网线连接，而且该线要求越短越好。2. DIGTAL IN从外部设备来的TTL逻辑电路的触发信号输入口，为25针

20、的输入口。3. DIGTAL OUTTTL逻辑电路的数字信号输出口，为25针的输入口。用于输出触发信号给其他设备，如给药灌流系统。第21-23针输出的触发信号也可通过前面板的TRIGGER INPUT/OUTPUT中的OUT 0至OUT 2输出。4. Digital IN/OUT只用于和HEKA公司的其他设备连接，如连接EPC 8或TIB 14到EPC 10 USB放大器。为40针的输入/输出口。5. TELEGRAPH INPUTS4个通信输入器插口，用于将EPC10 USB放大器的滤波频率（Frequency）、所测膜电容（Cm）、增益（Gain）大小等信息输出给软件。6. AUX DAC

21、辅助数模通路。7. SOUND声音输出口。8. Power电源线插口，输入电压有90-210 V和220-250 V两个交流电范围段，可自动调节。保险丝的规格是1mA。六、软件面板（一）主要功能1. 单机与多机无论单机还是多机，都共用一个LIH 8+8型AD/DA转换器。该转换器提供4个DA通道（可允许同时输出4个刺激信号）、8个AD通道（可同时摄取不同放大器的8个电压或电流信号）。当前正在激活的放大器可通过仪器前面板上的Digital Bus绿灯在闪亮判断出来。当使用EPC 10 Double、Triple或Quadro放大器时，软件面板会显示“1. Amplifier、2. Amplifi

22、er，”等。点击其中任何一个放大器，则将激活该放大器，显示为红色。各放大器的设置是互不影响、相互独立的。2.Gain电流输出的增益。数值范围为0.005- 2000 mV/pA，分为三档：0.005-0.002、0.5-20和50-2000 mV/pA，分别对应于探头5M、500M和50G的反馈电阻，用于记录不同范围大小的电流（见下表）。当选择不同Gain数值（通过键盘上的上下箭头或拖动鼠标来选择）时，软件会自动选择相对应的探头反馈电阻的大小来通过电流。低范围的Gain用于双层膜、松散封接膜片和大细胞的实验，在这类实验中，记录的电流比较大（可高达2 A左右），电容补偿可达1 nF，可补偿小至1

23、0 的串联电阻。中范围的Gain主要用于一般大小的细胞的全细胞记录，记录的电流范围可达20 nA，电容补偿可达1000 pF，可进行串联电阻补偿和电流钳记录模式，背景噪声比高范围Gain的噪声大，但提供100 kHz的频带宽。高范围Gain用于单通道记录，其噪声极低，但记录的最大电流大约在200 pA以内，最大频带宽约为60 kHz，但是一些在中范围Gain情况下的功能不能使用（如电容补偿最大为100pF、电流钳模式不能使用等）。表. EPC 10 增益Gain的三个范围低范围中范围高范围Gain（mV/pA）0.005-0.0020.5-2050-2000对应的反馈电阻大小5 M500 M5

24、0 G电压钳模式能够测量的最大电流±2 A±20 nA±200 pA电流钳模式能够输出的最大电流±100 nA±10 nA-摄取信号的频带宽（kHz）10010060C-slow慢电容补偿范围（pF）30/100/100030/100/100030/100是否具有电流钳模式是是否能否进行串联电阻补偿能能能适用的记录模式大电流记录（双分子层膜、松散封接或大细胞）全细胞记录单通道记录3.Clipping Indicator当放大器的输入发生饱和时，在Gain的标框处出现一个闪烁的“Clip”，警示电流超载。这个Clip与放大器前面板上的Clippi

25、ng灯的功能相同，但它给人的感觉好像比后者更敏感，其实不然，它只是将处于超载的时间显示得长些而已。4.V-membrane电压钳模式下，用于设定（双击鼠标左键或单击右键输入）钳制电位（范围为±1,000 mV）。电流钳模式下（显示为I-membrane），用于设定（双击鼠标左键或单击右键输入）钳制电流（范围为±1,000 pA）。如果零电位（该电位下通过电极的电流为零）已经被正确设置，则软件会将液接电位和其他失调电位进行校正，以保证钳制电位的准确性。5. I-mon显示实际测量的通过电极的直流电流（基线位置的电流）。在对液接电位等失调电位进行补偿后，该电流应接近0。6. V

26、-mon显示对液接电位等失调电位校正后实际测量的通过电极的电压。在施加钳制电位（V-membrane）后，则显示钳制电位。但注意的是，在某些情况下（如在长刺激脉冲期间），V-mon可能会暂时与所设定的钳制电位有些不一致，因为它显示的是钳制电位V-membrane与所设定的刺激脉冲电压之和的平均值。7. R-memb在电极进入浴液到形成封接前，R-memb（R-membrane）显示串联电阻Rs（主要为电极电阻）的大小，封接形成后显示封接电阻Rseal的大小，形成全细胞记录模式后则显示细胞膜电阻Rm的大小。其数值是通过测量基线与测试脉冲后半部分的电流幅度来获得的。可通过本软件面板下部的“Soun

27、d”功能（见后）对R-memb大小进行声音监控。8. Input ADC在这里选择Patchmaster采样软件示波窗口中可显示的输入信号，包括如下几种：l F2-EXT：外部刺激命令，从放大器前面板上的“External Stim Input VC”输入，经过滤波器（Filter2）滤波，显示在示波窗口。l Imon-1：电流输出1l Imon-2：电流输出2l Vmon：电压输出l AD0-4：任何其他的AD通道9. Recording Mode用于选择记录模式，包括In Out（内面向外记录模式）、On Cell（细胞贴附记录模式）、Out Out（外面向外记录模式）、Whole Cel

28、l（全细胞记录模式）和C-Clamp （电流钳模式）10. Test Pulse可产生一定幅度（在Amplitude中设定）与频率（在Length中设定脉冲宽度，间接决定了脉冲频率）的测试刺激脉冲施加给细胞，记录电流反应，仅适用于电压钳模式，用于监测封接过程或其他需要给予刺激脉冲来监测一些实验设置参数的情形。要关闭测试脉冲，可选择其左侧的off；要选择单向脉冲，可选择其左侧的Single。可通过Test Pulse右侧的框选择显示输出脉冲电压还是电流反应或都显示。11. Amplitude/Length设定测试脉冲的幅度与持续时间。测试脉冲幅度的范围为±100 mV，持续时间范围为0

29、.1-1000 ms。当脉冲持续时间为1 ms时，每个测试脉冲含有100个采样点，即采样间隔时间为10 m。12. Noise该功能用于检测放大器的内部噪声和环境噪声，当将探头屏蔽时，检测的是放大器的内部噪声，当将探头裸露时，检测的是环境噪声。执行该功能时，rms噪声电流被持续检测与更新，此时将没有测试脉冲输出。rms噪声电流通过当前激活的AD数模通道采集，通常经过Imon 2输出，频带宽由Filter 2决定。电流的采样间隔为100 s，获得一个噪声数值需要持时256 ms，噪声数值显示在Noise仪表中。噪声的详细测量方法见“七、功能检测”。13. LJ（Liquid junction）液

30、接电位（mV），该框内需要手工输入液接电位的数值，放大器会根据这个数值对液接电位自动进行校正。在线校正需要在封接前操作Auto-Vo、输入LJ合适的数值。如果LJ输入0 mV，则放大器将不执行校正功能。双击鼠标左键输入LJ数值（范围±200 mV），可以拖动鼠标改变LJ数值。LJ数值的计算方法见文献（Neher, E. (1992) Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. In: Methods in Enzymology 207, 123-131, Academic Press, N

31、ew York.），用于计算LJ的常见离子迁移率见文献（Barry, P. H. & Lynch, J. W. (1991) Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. J. Memb. Biol. 121,101-117）。下表列出了常见溶液与生理盐溶液（140 mM NaCl）之间的LJ值。LJ的极性是生理盐溶液相对于表中溶液的。注意：LJ不受Reset按钮功能的影响，也不能用宏命令（macros）设定， 这一限定是为了避免LJ的意外变化引起错误的LJ校正。如果我们用的电极内液

32、和细胞浴液是同一种溶液（且浓度也相同），则LJ应该为0 mV。对于标准的液接电位校正，LJ中输入数值的正负极性应该是浴液相对于电极内液的电位，例如，如果电极内液含有谷氨酸或天门冬氨酸，浴液中含有Cl离子，LJ的极性应该为正（如+10 mV）。点击Auto-Vo，V-membrane将变为-10 mV（Whole Cell和Out Out模式时）或+10 mV (On Cell和In Out模式时），此时LJ得到了准确校正。在膜片钳实验中，需要考虑的偏移电位主要有放大器偏移电位（范围±30 mV）、电极电位（范围±200 mV），依赖于玻璃电极内与参比电极附近的Cl离子浓度）

33、、液接电位以及与要研究的细胞膜串联的其他细胞膜的电位（如在细胞贴附式时）。实验中一些偏移电位是固定不变的，如放大器偏移电位和电极电位，而液接电位却是变化的。实验开始时，首先要做的就是将那些固定不变的偏移电位去除，使通过玻璃电极的电流为0，这样放大器的命令电压V-membrane就是施加给细胞膜的电压。液接电位在实验中是变化的。例如在全细胞记录模式，当记录电极进入浴液时，因电极内液与浴液的成分不同，液接电位得以产生。而当形成全细胞记录模式后，因电极内液与细胞内液接近，液接电位此时基本消失了。在电极刚入浴液时，为了去除液接电位，我们需要将其去掉（这个过程叫补偿），而当形成全细胞记录模式时，又需要将

34、已经补偿掉的液接电位恢复回来（这个过程叫校正）。14. Vo（Pipette offset）Vo显示总的失调电位（施加到电极上的实际电压是V-membrane与Vo之和），可通过点击Auto-Vo来自动显示，也可拖动鼠标手工调节。当改动LJ时，Vo会随之自动变化。注意：不推荐手工调节Vo，因为这会干扰放大器对液接电位的校正。15. Auto-VoAuto-Vo按钮用于自动消除失调电位，使电极电流为0。失调电位的大小显示在Vo，其范围为±200 mV。. Auto-Vo用于电极入浴液后至开始封接前的时间段，其与LJ的合用可对液接电位进行在线校正。点击Auto-Vo 后，V-membra

35、ne将变为LJ的数值（On Cell和In Out模式时与LJ的极性相同，Whole Cell和Out Out模式时与LJ的极性相反）。注意：Vo的数值不受Reset钮的影响。16. Track它实质上是在钳制电位为0 mV时，Auto-Vo功能的反复多次的执行，执行的频率取决于EPC 10菜单中Search Mode Delay的设定。17. C-fast用于补偿电极电容和其他漂浮电容（范围为0-15 pF）。如果探头输入端不接任何东西，放大器仍会有残存的1-1.5 pF的输入电容，可被C-fast补偿。补偿功能有两个框，上面的框显示电容值，下面的框显示电容充放电的时间常数（8 s）。补偿可

36、通过拖动鼠标手工进行，也可输入电容数值和值，还可点击右面的Auto进行自动补偿。如果将鼠标放在“<>”上，则上下拖动鼠标可改变补偿的电容值，左右拖动鼠标可改变时间常数值。Auto自动补偿的原理是： 施加给电极一些5 mV的脉冲，对产生的电容电流进行平均，然后用指数方程拟合出电容补偿数值。如果Auto不能拟合出一个理想的补偿数值，Auto右侧标有E的小框将变灰暗。在采用细胞贴附式记录模式时，若对玻璃电极涂抹Sylgard树脂（电极电容变小）并且将C-slow关闭，此时Auto补偿功能的效果最好。放大器软件提供了两种补偿方法，快速补偿方法采用查表法（look-up table），即将放

37、大器内储存的数值表查找一遍直至找到某个值的过程。该方法首先需要在。中选择Make C-fast，在默认路径中创建出文件CFast.epc。如果程序找不到该文件，则在打开Patchmaster时将出现信息，提示找不到文件，此时，程序将采用慢补偿方法（反复补偿法）。18. C-slow用于膜电容补偿。有3个电容补偿范围，在Range中：30 pF（0.12-30 pF）、100 pF（0.4-100 pF）和1000 pF（4-1000 pF）。该范围还受到程序的限制，即必须保证时间常数= R-series x C-slow大于5 s以防止振荡的出现。C-slow补偿可通过拖动鼠标手工进行，也可输

38、入电容数值，还可点击右面的Auto进行自动补偿（包括C-slow和R-series）。C-slow Range选择膜电容补偿的范围。Off -关闭补偿功能，30 pF用于小细胞，100 pF用于中小尺寸的细胞，1000 pF用于大细胞。注意：（1）当选择1000 pF范围时，Gain只能选择低和中范围，如果Gain选择高于20 mV/pA的数值，程序会自动将补偿范围降到100 pF。（2）若使用Cap Track功能测量电容的微小变化，应该尽可能选择大范围的C-slow，这与直觉恰好相反，选择大范围的C-slow将使补偿更加精确，分辨率更高。R-series显示串联电阻的数值。范围为0.1-1

39、0 G。通过该数值可决定膜充放电反应的时间常数和对串联电阻进行补偿。该数值的调节受限于膜电容数值以及补偿范围Range。该数值可通过拖动鼠标手工进行更改，也可直接输入数值，还可点击右面的Auto自动进行测量。如果将鼠标放在“<>”上，则上下拖动鼠标可改变补偿的电容值C-slow，左右拖动鼠标可改变串联电阻R-series值。Auto C-slow该功能可自动执行C-slow补偿功能和测量串联电阻R-series数值。若C-slow Range处于Off状态，点击Auto时将自动把范围设成1000 pF（低和中范围Gain时）、100 pF（高范围Gain时）。该功能在C-fast执

40、行后进行时效果好，且为了获得更好的补偿效果，反复交互执行Auto C-fast和Auto C-slow效果更佳。如果Auto功能不能给出一个理想的补偿数值，Auto右侧标有E的小框将变灰暗。连续重复执行Auto可采用Cap Track功能（见下）。注意：在执行Auto前，提供合理的C-slow和R-series估计值是必须的，否则Auto的自动补偿功能可能会失败。Cap Track点击该按钮可连续重复执行Auto C-slow补偿功能，跟踪补偿膜电容可能发生的微小变化，测量出电容值与串联电阻R-series值，再次点击可关闭该功能。注意：在Patchmaster采样软件EPC 10菜单中，选择

41、Output Cap.Track选项，则可将测量的电容值和串联电导G-series（1/R-series）值分别输出到DA 0和DA 1。换算系数G-series是100 nS/V，C-slow是0.5、5或50 pF/V（分别对应于电容范围30、100和1000 pF）。点击Reset钮，DA输出的数值将被调为0。如果要激活Output Cap. Track功能，则一定要确保触发DA不能是DA 0或 DA 1通道。Delay该功能设置下一次Cap. Track执行前的等待时间。当Delay特别短时（如1 ms），膜电容测量的更新频率大于10 Hz（还取决于计算机类型）。当关闭采样软件示波窗口

42、时，Cap Track的更新速度可增加约2倍。19. Rs Comp全细胞记录电压钳模式下，细胞膜电位由施加在记录电极上的钳制电位所决定。但是这种钳制电位钳制的效果并不完全，因为它还依赖于来自电极至细胞内部的串联电阻（Rs）和所记录电流幅度的大小。Rs因与电极电阻串联而得名，一部分Rs来自电极电阻本身，但通常大部分Rs来自残留的破裂膜电阻，实验中，通常Rs至多降低到电极电阻的2倍。Rs对电流记录带来两方面的负面影响：（1）首先，当通过电极输出步阶电压给细胞时，Rs延迟了膜电容充电反应。膜充电反应的时间常数=Rs x Cm（Cm是膜电容），例如，若Rs = 5 M，Cm = 20 pF，则时间常

43、数 = 100 s。该时间常数对于研究快速的电压门控性离子通道电流（如Na通道电流）来说是太长了。（2）其次，当膜上有大电流通过时，Rs产生的膜电位误差增大。例如，若Rs = 5 M，则2 nA的通道电流将产生10 mV的膜电位误差，这对于研究电压门控性离子通道电流来说已经相当大了（一般要保持在2 mV以下的误差）。 执行Rs补偿功能时需要选择补偿速度与设定补偿的程度（百分比）。补偿速度有如下选择：Off 关闭补偿功能100 s 慢补偿 10 s 快速补偿 2 s 极快速补偿如何选择补偿速度取决于时间常数值的大小。如果值小于500 s，应选择2 s，提供补偿必需的速度。极快速补偿可加快电压钳制

44、速度，但需要苛刻的调节，以防止产生高频振荡。极快速补偿时，Filter 1将自动切换为HQ-30 kHz设置。电流钳模式下，Rs-Comp将成为桥补偿。理论上讲，Rs补偿的百分比越大越好，但实际上补偿超过90%将产生电极振荡。如何设定补偿的程度也取决于时间常数值的大小。如果值大于100 s，可以最大补偿到90%而不产生严重的振荡。对于较小的值，补偿的程度应该为仅低于产生振荡的百分比数值。Auto按钮可以自动调节补偿的设置，使膜电位的跃迁速度达到最大，并使超射最小，防止振荡产生。20. Filter 1和Filter 2Filter 1：设置放大器3极滤波器的滤波频率，有如下4个选项：Besse

45、l 100 kHz、Bessel 30 kHz、Bessel 10 kHz和HQ 30 kHz。一般情况下选择10 kHz就已经足够了，可有效地降低高频噪声的干扰。当进行快速Rs Comp时（如选择2 s），此处会自动选择HQ 30 kHz，其他场合基本不用HQ 30 kHz。Filter 2：设置放大器4极滤波器的滤波频率，只用于I-mon 2电流信号。Filter 2与Filter 1是串联的。滤波频率可通过拖动鼠标手工进行，也可输入数值，范围为0.1-16 kHz，步阶为0.1 kHz，保证精确在0.5-15 kHz范围。有两种滤波器类型供选择，一是Bessel，这是我们最常采用的滤波器

46、，另一个是Butterworth，具有大的衰减斜率，主要用于功率谱分析。 注意：（1）当Filter 1和Filter 2联合使用说，实际上Filter 2的滤波频率是起真正滤波作用的，即为I-mon 2信号的滤波频率。（2）如果不适用Filter 2滤波，而是采用外部滤波器滤波，则可将I-mon 1输出到外部滤波器的输入端，将滤波器的输出返回给放大器的AD通道（AD 0.AD 5），将选择的AD通道作为信号输入通道。（3）当放大器的输出选择I-mon 1时，所用的滤波器为Filter 1，此时Filter 2失效。如要使用Filter 2，则必须先将放大器输出更改为I-mon 2。21. L

47、eak Comp漏电流补偿功能。补偿程度用电导表示，该电导称为漏电导（Leak conductance），补偿范围为2 nS、200 nS和20 S，分别对应于高、中、低范围的增益Gain。漏电流补偿可通过拖动鼠标手工进行，也可输入数值，还可点击右面的Auto进行自动补偿。通过Track钮可连续对漏电流补偿进行更新，跟踪漏电流的变化。22. Stim当对电位变化的速度要求不高时，外部输入放大器的刺激信号可被一个2极Bessel滤波，以降低快速的电容瞬变值幅度。放大器提供了两个滤波等级（用10-90%瞬变值幅度上升时间表示）：2 s（是防止放大器内部电路出现非线性化所需的最小上升时间）和20 s

48、（最适合于那些除了最快速测量以外的所有测量，用于降低电容瞬变值幅度）。通常选择20 s就足够了，除非要研究诸如Na通道电流这种激活非常快的电流。External处可输入外部电压刺激输入的转换系数，范围是±0-10x，便于使用不同的外部刺激器。注意：（1）如果没有外部刺激器输入到放大器前面板EXT STIM. INPUT VC，强烈推荐将External设为Off（即为0），这么做可有效地防止外部噪声的摄入。（2）放大器内部的钳制电位V-membrane is不受该转换系数变化的影响，但是，如果钳制电位是通过外部的刺激器或另外的计算机设置的，则该转换系数将对钳制电位V-membrane

49、产生影响。23. Zap用于打破细胞膜形成全细胞记录模式。点击Zap，放大器将通过电极给予细胞膜一个高电压脉冲（幅度范围为±1V，持续时间为0.005-1000 ms）。在采样软件Patchmaster中，打开Windows下拉菜单，开启Configuration窗口，如果在Hardware中选择Zap OnCell only，则Zap功能只用于形成封接后，而不能用于形成全细胞记录模式后。24. Sound选择此项后，R-membrane数值的变化将有声音的伴随。该功能需要计算机具有声卡。25. Reset该功能可使EPC 10软件面板上的一些设定恢复到最初的默认值。它将使DA通道变

50、为0，取消使用Cap Track时C-slow和R-series的输出。另外，当记录宏命令时，也需要使用Reset功能使EPC 10恢复到初始状态。（二）一些较少使用的隐藏功能一些较为少用的功能隐藏在EPC 10 USB软件面板的右侧，通过点击EPC 10 USB软件最上端的“Show All”，可以显示出来。1. LFVC V-memb用于设置低频电压钳（Low frequency voltage clamp, LFVC）模式的钳制电位。点击右侧的“<-V-memb”或“<-V-mon”，可将V-memb或V-mon的数值拷贝过来。2. Low Freq. VC低频电压钳（LFV

51、C）模式实际上是一种改进的电流钳模式。该模式下，可以测量膜电位的快速偏移，如动作电位、突触电位，同时维持平均膜电位在设定的LFVC V-memb水平。因此，该模式的工作方式在记录快速信号时类似电流钳，而在记录低频信号时类似电压钳。其工作原理是，测量的膜电位经过低通滤波，并与设定的LFVC V-memb进行比较，如果两者不同，则向细胞内注射一个电流，使膜电位维持在设定的LFVC V-memb水平。由于细胞不能区分从电极注射到细胞内的电流和跨越细胞膜的电流，LFVC电路可被看做是额外的膜电导。这里选择LFVC的反馈速度，有1, 3, 10, 30, 100等选项。数字越小，反馈速度越快。若选off

52、，则不执行该功能。注意，该功能只被Patchmaster采样软件支持。3. R-memb->R-pip点击该钮可将R-memb的数值拷贝过来到R-pip，用于在封接前将电极电阻值储存在所采集的数据文件中。4. CC-Gain该功能可选择电流钳的转换系数（0.1 pA/mV、1 pA/mV和10 pA/mV），分别对应于最大命令电流1 nA、10 nA和100 nA。当通过放大器前面板External Stim. Input CC输入外部刺激命令时，需要在此选择转换系数。当CC-Gain选择1 pA/mV，External Stim. Input CC输入1 mV的命令时，将产生1 pA的

53、命令电流。注意：gain的选择受该转换系数的限制，如CC-Gain选择1 pA/mV，电流钳模式下gain的范围只能是0.5-20 mV/pA。5. Gentle CC-Switch该功能用在电压钳与电流钳之间进行反复切换时。Gentle CC-Switch选择On：为维持膜电位稳定，在切换为电流钳时，I-hold不为0 pA，而为某一数值，需要向细胞注入电流。为此，电压钳下V-mon应该与初始的V-membrane一致。同样，在返回到电压钳时，V-membrane将会在电流钳时的膜电位附近。Gentle CC-Switch选择Off：在切换为电流钳时，I-hold将设为0 pA。6. V-m

54、on Gain所测量的V-mon可以在输出到模数转换器前，被放大10或100倍。放大*100倍时，电压范围为±100 mV，分辨率为1.5 V，特别适用于电压幅度较小的场电位记录。7. Last V-membrane电流钳模式下，膜电位非常容易改变，当切换到电压钳时，V-membrane常常不同于切换为电流钳模式之前的数值。Last V-membrane用于储存并恢复初始的V-membrane值。8. Bell点击该钮启动系统声音，用于在实施宏命令时提供反馈信息。9. Relative value点击该钮，则在记录宏命令时，任何值的变化都以相对变化值被记录下来，例如，如果使钳制电位从

55、-60 mV超极化到-70 mV，则宏命令中将记录-10 mV。10. Overlay点击该钮，测试脉冲波形线将以叠加的方式显示在采样软件示波窗口中。11. List State点击该钮，将放大器设置状态的一些信息发送到Notebook窗口中，包括放大器类型（Amplifier）、记录模式（Recording Mode）、钳制电位（V-membrane）、增益（Gain）、滤波频率（Filter 2）、快电容补偿（C-fast）和慢电容补偿（C-slow）。12. One Pulse点击该钮一次，就输出一个测试脉冲。当Test Pulse选择off时，若仅仅需要一次测试脉冲，可选此功能。13.

56、 I-Scale and V-Scale用于设定测试脉冲Test Pulse在采样软件示波窗口中的显示比例（左侧框）和偏移（右侧框）。数值1将使Y轴达到AD/DA转换器的最大量程（±10.24 V），此时，如果输入信号饱和了模数转换器，便很容易发现。但是，如果要对信号进行放大，则需要在采样软件Patchmaster的Configuration窗口Misc.中选上Scale Test Pulse。14. Sound编码R-membrane的声音灵敏度（Hz/M）和音量（%）在这里设定。点击Sound钮可执行该功能。15. Wait用于设定在记录宏命令时暂停的时间。点击该输入框，可将Re

57、cord变为Stop，此时宏命令的记录暂停，直到经过所设定的时间或点击Stop，才可继续记录宏命令。七、功能检测（一）施加测试脉冲1. 将模型细胞与探头连接好：将模型细胞与探头的BNC口连接，将探头后端的接地口与模型细胞接地线口连接。2. 将模型细胞电路设置为10 M位置，此时模拟电极入浴液（电极电阻10M）。3. 打开Patchmaster，点击放大器软件面板的Reset（图中所示），设置记录模式为On Cell模式（图中所示），将Test Pulse的幅度（图中所示）设为5 mV，时间长度（图中所示）设为5 ms，此时在波形显示窗口将出现电流方波。如果增益Gain大小合适（即为5 mV/pA）（图中所示），则窗口中将显示一个幅度约为500 pA的电流方波（根据欧姆定律，I = U/R = 5 mV/10 M=500 pA）（图中所示）。4. PULSE或Patchmaster会自动计算出且随时更新电极电阻的大小，并显示在R-memb上（图中所示，10 M左右）。5. 可能存在的失调电位可通过点击Vo右边的Auto（图中