分子生物学教案内容-实验

1、讲 次1日 期2013-11-11节 次1-2,3-4节授课内容实验一 实验基础仪器设备及基本技能授 课 学 时2教学目的通过板书、实物演示、操作等教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用仪器设备、耗材。教学重点分子生物学实验的基本技术和技能，分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。教学难点分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、操作演示法教学过程课程介绍5分钟新课讲授90分钟1. 分子生物学实验规程2. 分子生物学实验设备1) 温度控制系统：冰箱：4 、-20、-7

2、0 -样品、试剂和材料等的保存2) 恒温培养箱：细菌平板的培养3) 恒温空气摇床；菌体的培养4) 灭菌器: 培养基、试剂、耗材等的灭菌5) PCR仪：PCR 扩增、保温实验等6) 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定7) 电泳仪：电泳时提供电压和电流8) 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架9) 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析10) 紫外分析仪：电泳结果的定性分析11) 台式高速冷冻离心机：样品的分离12) 分光光度计：样品的定量测定13) 超净工作台：提供洁净工作环境14) pH 计：精确的pH值测定15) 移液器；液体试剂的精确取量16) 制冰机：保证操作过程中温度的

3、恒定总结5分钟思考题1、完成一篇分子生物学实验安全预案。讲 次2日 期2013-11-13节 次1-2,3-4节授课内容实验二 实验准备及实验规范训练授 课 学 时2教学目的学会分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法，配制实验三所需的药品教学重点分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法教学难点配制实验三所需的药品教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟新课学习90分钟1. 分子生物学实验仪器训练学生以小组为单位，操作分子生物学主要实验仪器。2. 分子生物学基本技术2.1实验规范训练仪器的操作要求： 仪器在未经培训前，不得擅自使用 严格按操

4、作规程使用仪器， 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担2.2实验规范训练量程的选择 天平 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶不同规格 量程的选择移液器2.3 实验规范实验操作 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么 仔细操作和观察 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉3. 配制试剂：蛋白酶K购自美国Promega公司； Tris、EDTA、SDS、Tris 饱和酚、三氯甲烷、无水乙醇、硼酸、冰乙酸等均购自北京及其他国内外化学试剂公司。提取DNA所用相关溶液的配制（试剂的配制若无特别要求，均以

5、蒸馏水为溶剂，高压灭菌条件为121（1.034×105 Pa）、25 min）： 1 M Tris.CL （pH 8.0）：称Tris 121.1 g, 溶于800 ml蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌，用浓 HCl 调pH至8.0，定容至1 000 ml，分装后高压灭菌。 0.5 M EDTA（pH 8.0）：称186.1 g EDTA 溶于800 ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0，加水定容至1 000 ml，高压灭菌。 0.5 M NaCL：5.844 g NaCL溶于双蒸水中，定容至200 ml, 高压灭菌。 SDS（10）：在900 ml水中溶解100 g电泳级SDS，加热至

6、68助溶，用盐酸调pH至7.2, 加水定容至1 000 ml，过滤膜过滤，室温保存，无需灭菌。 组织DNA提取液配方：1M Tris.CL (pH 8.0) 5 ml，0.5 M EDTA (pH 8.0）20 ml，0.5 M NaCL 20 ml，10% SDS 10 ml，双蒸水45 ml。 蛋白酶 K（20 mg/ml）：200 mg蛋白酶K溶于10 ml双蒸水，以1ml分装，-20冻存。总结5分钟思考题1、完成训练过程，记录仪器使用心得。2、配制试剂中出现何问题？如何处理？讲次3日 期2013-11-182013-11-20节 次1-4节授课内容实验三 组织基因组DNA的提取授 课

7、学 时4教学目的掌握动物总DNA的抽提方法和基本原理。教学重点动物总DNA的抽提技术和基本原理。教学难点动物总DNA抽提的基本原理。教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟新课学习190分钟一、实验目的：二、实验原理：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀D

8、NA溶于TE溶液中，即得动物物总DNA溶液。三、实验材料：猪皮肤组织四、主要仪器低温冰箱，冷冻高速离心机（美国），移液器，制冰机五、步骤：用眼科手术剪将约0.3 g组织块剪碎，置于1.5 ml离心管里，干燥20 min¯加入500 ml组织DNA提取液¯加入蛋白酶K至终浓度为150 mg/ml，充分混匀，55消化12-24 h(以组织样消化完全，呈透明状为宜) ¯加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两相充分混匀，4 12 000 rpm，离心10 min¯转移上清至另一离心管中，重复上一步骤12次。教学过程 ¯转移上清

9、至另一离心管中，再分别用等体积的苯酚:氯仿（1:1），氯仿，4 12 000 rpm，离心10 min¯转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的3M NaAc (pH 5.2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，温柔的上下颠倒几次¯将DNA沉淀挑出，置于1.5 ml离心管。¯将DNA自然晾干（注意不能太干，否则不易溶解）后溶入适量1×TE或超纯水中备用。（TE较超纯水要更好，可以使DNA更稳定）总结、分析 5分钟思考题作 业1、完成实验报告，基因组DNA提取过程中各组分的作用是什么？2、本实验操作的关键点是什么？讲 次4日 期2013-11-21节 次

10、1-2，3-4节授课内容实验四 琼脂糖凝胶电泳授 课 学 时2教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。教学重点琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。教学难点琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟讲授 25分钟一、 实验目的二、 实验原理琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构

11、型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。但是EB有致畸和致癌性，本实验中用与EB相似功能但未发现致畸和致癌性的GoldView作为核酸染料。三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，琼脂糖，50X TAE，上样缓冲液四、主要实验仪器： 电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外分析仪。五、实

12、验步骤（1）制胶（以30 mL为例）a. 称取0.24 g 琼脂糖，加入30 ml 的1X TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀。b. 微波炉上加热，至琼脂糖完全溶解；教学过程c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50），加入适量核酸染料，倒入制胶板中，在室温下冷却凝固(约30 45 min)；d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样（3）电泳 打开电源开关，调节电压至130 V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20分钟后即可观察。（4）观察将电泳好的胶置于紫外分析仪，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该基因组DNA的

13、浓度。实验操作55分钟总结、分析10分钟思考题作 业完成实验报告，对本组实验操作关键点及结果进行分析？讲 次5日 期2013-11-252013-11-27节 次1-4节授课内容实验五 PCR扩增及检测授 课 学 时4教学目的通过本实验掌握PCR反应的基本原理，PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。教学重点学习PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。教学难点PCR的基本操作技术教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课25分钟一、 实验目的二、 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向

14、DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、

15、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。教学过程三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验仪器 PCR仪，电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪、电炉五、实验步骤1模板DNA：实验二所得基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)： （1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 µL, 在无菌的0.2 mL离

16、心管中按下列操作程序加样： 反应物体积/µLddH2O18.210 x Buffer 2.52.5 mmol/L dNTP210 pM上游引物110 pM下游引物1DNA Taq聚合酶0.3 （2）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94 4 min (预变性) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 30 sec 72 8 min 30个循环3. PCR产物检测实验操作170分钟总结、分析 5分钟思考题作 业1 PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？讲 次6日 期2013-

17、12-22013-12-4节 次1-3,7节授课内容实验六SSCP技术分析基因多态性授 课 学 时4教学目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。教学重点聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析基因多态性的原理及操作技术，基因分型教学难点聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，基因分型教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课40分钟一、实验目的 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。二、实验原理 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis o

18、f Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。其基本原理为：将PCR扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙

19、烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。三、试剂准备1. PCR相关试剂2. 30聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 保存。3. 10过硫酸胺配制方法：1g 过硫酸胺，溶于10ml ddH2O中，

20、4 保存（可用数周）。4. TEMED（N，N，N，N，N-四甲基乙二胺）5. 5×TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。6. 变性上样液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)教学过程四、操作步骤 1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，晾干，使用时安装电泳板（注：安装时把胶条在蒸馏水中润湿可以起到封闭玻璃板和胶条间缝隙的作用）在100 ml小烧杯内加入适量（表4-1）的40的丙烯酰胺、5×TBE、10%的过

21、硫酸铵、TEMED和水，混匀后迅速灌胶当胶灌至离玻璃板上沿1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30 min左右，多余的丙烯酰胺4 保存，随时观察凝胶聚合情况再补加丙烯酰胺凝胶聚合好后，拔掉梳子，立即用1×TBE冲洗点样孔向电泳槽中加入1×TBE，200 V预电泳20 min，同时准备点样2 ml PCR产物置于PCR 管中，加8 ml SSCP变性缓冲液，98 变性10 min迅速冰浴10 min，上样接通电源，电压 160 V180 V，16下电泳1215 h（S1S18在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的最佳条件见表4-3）2. 银染观察电泳结果：电泳结束后关上电泳仪，小心取出凝胶

22、，用去离子水快速洗胶1遍置于20%乙醇中固定15 min用去离子水快速洗胶1遍用1硝酸氧化3 min用去离子水快速洗胶1遍用0.1硝酸银染色30 min用去离子水快速洗胶1遍用去离子水快速洗胶1遍用500 ml显色液（加入针尖大的一粒硫代硫酸钠，400 ml甲醛）显色待条带清晰后，倒去显色液，用去离子水快速洗胶1遍用4醋酸停显保鲜膜封好保存或拍照五、注意事项1、 核酸片段的大小：用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70的变异；对于300bp左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片段，则仅能检出1030的变异，因此，<

23、;300 bp，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bp的DNA片段，再进行SSCP分析。2、 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。3、电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变

24、的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。4、凝胶浓度及厚度：凝胶浓度很重要，一般使用58的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。5、假阴性：一般认为，如没有污染，PCRSSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是

25、点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。6、结果分析：单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带因此，PCRSSCP分析结果至少显示三条带。实验操作150分钟 总结、分析 10分钟思考题作 业简述聚丙烯酰胺凝胶电泳分析基因

26、多态性的原理？讲 次7日 期2013-12-5/9节 次1-4节授课内容实验七 目的DNA片段的纯化授 课 学 时4教学目的掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA。 教学重点从琼脂糖凝胶中回收DNA的技术。教学难点提高琼脂糖凝胶中回收DNA纯度和回收率的关键步骤。教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课 25分钟一、实验目的 掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA。二、实验原理 琼脂糖凝胶具有分子筛作用，通过琼脂糖凝胶电泳把PCR产物进行分离，然后在紫外灯下切取目的片段，用胶回收试剂盒进行纯化。三、实验材料 PCR产物，eppendorf管，离心管架，1000ul、200ul枪头，一次

27、性滤膜（0.22um），大量碎冰，胶回收试剂盒。四、实验仪器设备 微量移液器(20l,200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，离心机，恒温水浴锅，冰箱等。五、操作步骤向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50水浴10 min （依据凝胶溶解情况可以适当延长或缩短时间），并不断温和的翻转离心管以充分混匀胶块；胶块完全溶解后，待胶溶解液降至室温（以提高吸附柱对DNA的吸附能力）转入吸附柱中（加入后室温静置1min左右，以提高吸附柱的吸附能力），12 000 rpm离心1 min，弃去收集管中的废液；加入700 ml漂洗液，12 000 rpm离心30 s，弃去收集管中的废液；加入500 ml漂洗

28、液，12 000 rpm离心30 s，弃去废液；将吸附柱放回收集管中，12 000 rpm离心2 min，尽量除去残留的漂洗液；将吸附柱置于室温或50干燥箱数分钟，彻底晾干（以防止残留的漂洗液影响回收效率和DNA质量）；将吸附柱放入一新的离心管，加入35 ml洗脱液，（洗脱液在6570中预热，以提高洗脱效率），室温放置2 min，12 000 rpm离心1min。如果需回收更多DNA，可将上一步离心得到的溶液重新步骤。琼脂糖凝胶电泳检测回收的DNA片段。实验操作170分钟总结、分析 5分钟思考题作 业从琼脂糖凝胶中回收DNA注意事项有哪些？如何提高回收效率？讲 次8日 期2013-12-11/

29、122013-12-18/19节 次1-4节,1-2节授课内容实验八DNA重组 授 课 学 时6教学目的把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出重组子。教学重点掌握重组DNA技术及重组子鉴定的方法和原理教学难点重组子鉴定的原理教 具 和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课 40分钟一、实验目的 把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出重组子。二、实验原理 外源DNA与载体的连接就是DNA重组，由DNA连接酶完成的。pGMD-19T的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和

30、X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pMD-19T质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。三、材料 pGMD-19T质粒，已纯化的PCR产物，大肠杆菌感受态，eppendorf管，离心管架，1000ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰四、设备 微量移液器(20l,200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，培养箱，离心机，恒温水浴锅，恒温摇床，超净工作台，双蒸水器，冰箱，培养箱等。五、试剂准备1. LB固体培养基2. LB液体培养基3. 氨苄青霉素4. 二甲基甲酰胺5. Xgal：5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷：将Xgal溶于二甲基甲酰胺

31、，配置为20mg/ml，不用过滤灭菌，分装，黑暗保存在-20。教学过程6. IPTG：异丙基硫代-D-半乳糖苷，2g IPTG溶于8ml双蒸水，再补水到10ml，用一次性滤膜（0.22um）过虑灭菌，每份1ml，保存在-20。7. pMD-19T连接试剂盒8. 无水乙醇9. 70乙醇10. 灭菌双蒸水ddH2O六、实验操作1）连接反应体系（10 ml）： 纯化的PCR产物 4 mlpGMD-19T Vector 1 mlSolution 5 ml混合均匀，16 12 h（一般16 30 min，但为保证较高的连接效率，尤其是对于2 kb以上片段最好延长连接时间）。2）转化取50 ml感受态细胞，置于冰浴中，待溶化后用预冷的吸头加入5 ml连接产物，轻轻旋转以混匀（不要用移液器吹打），在冰中放置30 min；将管在42水浴中放置45 s，不要摇动；快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 min；每管加500 ml LB培养基，置于37摇床振摇（振摇速度大于150转/分，但最好不要超过170转/分）培养，60 min使细胞复苏；准备含100 mg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基平板，加40 ml X-gal（20 mg/ml）、8 ml IPTG（10