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文档简介

1、抗生素药物的安全性抗生素(An tibiotics) 类药物是临床上常用的一类重要药物,临床 使用的抗生素主要由生物合成,经过发酵和提纯两步制得;也有少数 是利用化学合成或半合成方法制得。ChP2010共收载抗生素类原料药 及其各种制剂近300个品种。第一节 概述一、抗生素类药物的定义和特点青霉素于1929年被弗莱明发现,至1943年链霉素的发现者赛 尔曼?瓦克斯曼才给出了抗生素的定义,即微生物代谢产生的能抑制它 种微生物生长活动甚至杀灭它种微生物的化学物质。抗生素的来源不 仅限于细菌、放线菌和霉菌等微生物,植物和动物也能产生抗生素。 抗生素的应用也远远超出了抗菌范围。一般认为,比较确切的抗生

2、素 的定义应为:抗生素是生物(包括微生物、植物、动物)在其生命活动 中产生的(或并用化学、生物或生化方法衍生的),能在低微浓度下有 选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。抗生素主要由微 生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰等过程,最后制成适当制剂。 与化学合成药物相比,其结构、组成更复杂,表现为:1.化学纯度较低 有三多:即同系物多,如庆大霉素、新霉素 等含有多个组分;异构体多,半合成-内酰胺抗生素、氨基糖苷类抗 生素具有旋光性,均存在光学异构体,如药用巴龙霉素为两个立体异 构体巴龙霉素I和巴龙霉素U的混合物;降解物多,如四环素类存在 脱水、差向异构体。2 .活性组分易发生变异 微生物

3、菌株的变化、发酵条件改变等 均可导致产品质量发生变化,如组分的组成或比例的改变。3 .稳定性差 抗生素分子结构中通常含有活泼基团,而这些基 团往往是抗生素的活性中心,如青霉素、头抱菌素类结构中的-内酰 胺环,链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点。二、抗生素类药物的分类抗生素的种类繁多,性质复杂,用途又各异,对其系统分类有一 定困难。根据不同的研究目,抗生素一般有以下几种分类法:1 .根据产生抗生素的生物来源分类 细菌产生的抗生素、真菌 产生的抗生素、放线菌产生的抗生素、高等植物产生的抗生素、动物 产生的抗生素。2 .根据抗生素的作用对象分类 抗革兰阳性菌的抗生素、抗革 兰阴性菌的抗生素、广

4、谱抗生素、抗真菌的抗生素、抗肿瘤的抗生素、 抗病毒及抗原虫系昆虫的抗生素、抗结核分枝杆菌的抗生素。3.根据抗生素的作用机制分类 抑制细胞壁合成的抗生素、影 响细胞膜功能的抗生素、抑制和干扰细胞蛋白质合成的抗生素、抑制 细胞核酸合成的抗生素、抑制细菌生物能作用的抗生素。4 .根据抗生素的化学结构分类其中以作用对象、化学结构不 同进行分类是较常用的,前者对于临床选用抗生素带来一定方便,后 者有利于抗生素工业生产和质量分析研究。按照化学结构分类共分为 以下九大类。(1) 3内酰胺类抗生素: 这类抗生素的化学结构中都含有一个四元的内酰胺环,属于这类抗生素的有青霉素、头抱菌素以及它们的 衍生物。临床常用

5、的青霉素类药物有:青霉素钾、青霉素钠、青霉素 V钠、阿莫西林、阿莫西林钠、哌拉西林、哌拉西林钠、美罗培南、 阿洛西林钠、氨苄西林、氨苄西林钠、普鲁卡因青霉素、磺卞西林钠、 托西酸舒他西林、氯唑西林钠等。临床常用的头抱类药物有:头抱丙 烯、头抱尼钠、头抱他啶、头抱地尼、头抱地嗪钠、头抱西丁钠、头 抱曲松钠、头抱克肟、头抱克洛、头抱呋辛钠、头抱呋辛酯、头抱孟 多酯钠、头抱拉定(先锋霉素切)、头抱泊肟酯、头抱哌酮、头抱哌酮 钠、头抱唑肟钠、头抱唑林钠(先锋霉素V )、羟氨苄头抱氨苄(先锋霉 素W )、头抱羟氨苄、头抱替唑钠、头抱硫脒、头抱噻吩钠、头抱噻肟 钠、头抱拉氧头抱钠、盐酸头抱他美酯、盐酸头抱

6、吡肟等。(2)四环类抗生素:这类抗生素的化学结构中都含有一个四并 苯的母核,属于这类抗生素的有盐酸四环素、盐酸土霉素、盐酸多烯 环素、盐酸米诺环素、盐酸金霉素、盐酸美他环素等。(3)氨基糖苷类抗生素: 这类抗生素的化学结构中都有氨基糖 苷和氨基环醇,属于这类抗生素的药物数目很多,常用的有:硫酸链 霉素、硫酸庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、盐酸大观霉素、硫酸小 诺米星、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索米星、硫酸阿米卡 星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等。大环内酯类抗生素:这类抗生素的化学结构中都有一个大 环内酯作为配糖体,红霉素为本类抗生素的代表。本类抗生素临床效 果显著,如琥乙红霉

7、素、乙酰螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素、麦白 霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、依托红霉素、乳糖酸红霉素、 硬脂酸红霉素等。(5)多烯大环类抗生素:这类抗生素的化学结构中不仅有大环 内酯,而且在内酯结构中还存有共轭双键,属于这类抗生素的有制霉 菌素、两性霉素B、曲古霉素、戊霉素、菲里平(菲律宾菌素)、球红 霉素等。多肽类抗生素:这类抗生素是由多种氨基酸,经肽键缩合成 线状、环状或带侧链的环状多肽类化合物,属于这类抗生素的有盐酸 万古霉素、盐酸去甲万古霉素、硫酸多黏菌素B等。(7) 酰胺醇类抗生素:于这类抗生素的有氯霉素、甲砜霉素、琥珀 氯霉素、棕榈氯霉素等。(8) 抗肿瘤类抗生素:属于这类抗生

8、素的有丝裂霉素、盐酸平 阳霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素等。(9) 其他抗生素:凡不属于上述八类的抗生素一般均归于其他抗生 素。如丙酸交沙霉素、美洛西林钠、盐酸克林霉素、盐酸林可霉素、 替考拉宁、磷霉素钙、磷霉素钠、磷霉素氨丁三醇等。由于抗生素的结构和性质各异,上列的分类远远不能包括所有的 抗生素,且某一种抗生素可以同时划分为几个类型,所以此种分类法 仅是将常用的重要的抗生素列入几大类。本章主要讨论 俟内酰胺类、 氨基糖苷类、四环素类抗生素的物理化学性质、鉴别反应、杂质检查、 含量测定方法与原理。三、抗生素类药物的细菌耐药性在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的

9、微 生物,统称耐药菌。所谓细菌耐药性(bacterial resista nee) 又称抗药 性,是指细菌产生的对抗菌药不敏感的现象,是细菌自身生存过程的 一种特殊表现形式。天然抗生素是细菌产生的次级代谢产物,用于抵 御其他微生物、保护自身安全的化学物质。人类将细菌产生的这种物 质制成抗菌药物,用于杀灭感染的微生物。微生物接触到抗菌药,也 会通过改变代谢途径或制造出相应的灭活物质,使其避免被抗菌药物 抑制或杀灭,形成耐药性。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难 度,并迫使人类寻找新的对抗微生物感染的方法。1 .耐药性的种类 耐药性可分为固有耐药性(intrinsicresista nee) 和

10、获得性耐药性(acquired resista nee)。固有耐药性又称天然耐药性,是由细菌染色体基因决定代代相传,不会改变的,如链 球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药;肠道革兰阴性杆菌对青霉素G天 然耐药;铜绿假单胞菌对多数抗生素均不敏感。获得性耐药性是由于 细菌与抗生素接触后,由质粒介导,通过改变自身的代谢途径,使其 不被抗生素杀灭。如金黄色葡萄球菌产生B-内酰胺酶类抗生素耐药。 细菌的获得性耐药可因不再接触抗生素而消失,也可由质粒将耐药基 因转移给染色体而代代相传,成为固有耐药。2.耐药的机制(1)产生灭活酶,使抗菌药失活:细菌产生灭活的抗菌药物酶使抗 菌药物失活是耐药性产生的最重要机制之一

11、,使抗菌药物作用于细菌 之前即被酶破坏而失去抗菌作用。这些灭活酶可由质粒和染色体基因 表达。B-内酰胺酶:B-内酰胺酶由染色体或质粒介导。对B-内酰胺类抗 生素耐药的主要原因是细菌产生的B-内酰胺酶使B-内酰胺环裂解, 从而使该抗生素丧失抗菌作用。氨基糖苷类抗生素钝化酶:细菌在接触到氨基糖苷类抗生素后产 生钝化酶使后者失去抗菌作用,常见的氨基糖苷类钝化酶有乙酰化酶、 腺苷化酶和磷酸化酶,这些酶的基因经质粒介导合成,可以将乙酰基、 腺苷酰基和磷酰基连接到氨基糖苷类的氨基或羟基上,使氨基糖苷类 抗生素的结构改变从而失去抗菌活性。其他酶类:细菌可产生氯霉素乙酰转移酶灭活氯霉素、产生酯酶 灭活大环内酯

12、类抗生素;金黄色葡萄球菌产生核苷转移酶灭活林可霉 素。 抗菌药物作用靶位改变:由于改变了细胞内膜上与抗生素结合 部位的靶蛋白,降低与抗生素的亲和力,使抗生素不能与其结合,导 致抗菌的失败。细菌与抗生素接触之后产生一种新的靶蛋白,使抗生 素不能与新的靶蛋白结合,从而高度耐药。靶蛋白数量会不断增加, 即使药物存在时该细菌仍有足够量的靶蛋白维持其正常功能和形态, 导致细菌继续生长、繁殖,从而对抗菌药物产生耐药。(3)降低细菌外膜通透性:很多广谱抗菌药都对铜绿假单胞菌无效 或作用很弱,主要是因为抗菌药物不能进入铜绿假单胞菌菌体内,故 产生天然耐药。细菌接触抗生素后,可以通过改变通道蛋白的性质和 数量来

13、降低细菌的膜通透性,阻止抗菌药物进入细菌体内而产生获得 性耐药性。 影响主动流出系统:某些细菌能将进入菌体的药物泵出体外,这种泵因需能量,故称主动流出系统(active efflux system) 。由于这 种主动流出系统的存在及它对抗菌药物具有选择性的特点,使大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌 等对四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素、B-内酰胺类产生 多重耐药。四、抗生素药物的质量分析抗生素类药物的质量控制方法与一般化学药品一样,通过鉴别、 检查、含量(效价)测定三个主要方面来判断其质量的优劣。由于抗生 素类药物的特点,其分析方法可分为理化方法和生物

14、学法两大类。(一)鉴别试验抗生素类药物的鉴别试验主要为理化方法,常用 方法有:1官能团的显色反应 如-内酰胺环的羟肟酸铁反应;链霉素 的麦芽酚反应、坂口反应。对于抗生素盐类,通常鉴别酸根或金属离 子或有机碱。2光谱法 包括红外光谱与紫外吸收光谱的鉴别。抗生素的红 外光谱分析时需注意,由于抗生素存在多晶现象,有时对照品与供试 品图谱或对照图谱不一致,最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照 品,使处于相同晶型情况下再进行测定,若多晶效应是由于研磨和压 片过程中的晶相转变所致,则应采用溶液法试验。3 色谱法 包括TLC和HPLC法,采用对照品或标准品对照法。4 生物学法 是检查抗生素灭活前后的抑菌能力

15、,并与已知含 量的对照品对照后进行鉴别,此法已很少应用。(二)检查抗生素类药物的检查项目包括:影响产品稳定性的检查项目 结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等。控制有机和无机杂质的检查项 目 溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属 等。与临床安全性密切相关的检查项目 异常毒性、热源或细菌内毒 素、降压物质、无菌等。其他检查项目 对于多组分抗生素还要进行组分分析等(如硫 酸庆大霉素的“庆大霉素C组分的测定”)。此外,有些抗生素还规 定 “悬浮时间与抽针试验”(如注射用普鲁卡因青霉素)、 “聚合 物”(如-内酰胺类抗生素)、“杂质吸光度”(如四环素类抗生素)等。(三)含量或效价测定微生

16、物检定法 本法系在适宜条件下,根据量反应平行线原理 设计,通过检测抗生素对微生物的抑制作用,计算抗生素活性(效价) 的方法。测定方法可分为管碟法和浊度法:管碟法是利用抗生素在琼 脂培养基内的扩散作用,比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产 生抑菌圈的大小,以测定供试品效价的一种方法。浊度法是利用抗生 素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用,通过测定培养后细菌浊 度值的大小,比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度,以测定 供试品效价的一种方法。微生物检定法的优点是灵敏度高、需用量小,测定结果较直观; 测定原理与临床应用的要求一致,更能确定抗生素的医疗价值;而且 适用范围广,较纯的精制品、纯度较

17、差的制品、已知的或新发现的抗 生素均能应用;对同一类型的抗生素不需分离,可一次测定其总效价, 是抗生素药物效价测定的最基本的方法。但其存在着操作步骤多、测 定时间长、误差大等缺点。随着抗生素类药物的发展和分析方法的进 步,理化方法逐渐取代了生物学法,但对于分子结构复杂、多组分的 抗生素,生物学法仍然是首选的效价测定方法。理化方法是根据抗生素的分子结构特点,利用其特有的化学 或物理化学性质及反应而进行的。对于提纯的产品以及化学结构已确 定的抗生素,能较迅速、准确地测定其效价,并具有较高的专属性。 但本法也存在不足:如化学法通常是利用抗生素化学结构上官能团的 特殊化学反应,对含有具同样官能团杂质的

18、供试品就不适用,或需采 取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构 部分的反应时,所测得的结果,往往只能代表药物的总含量,并不一 定能代表抗生素的生物效价。因此,通常在以理化方法测定抗生素含 量时,不但要求方法正确可靠、具有专属性、操作简单、省时、试剂 易得、样品用量少,而且要求测定结果必须与生物效价吻合。目前世 界各国药典所收载的抗生素的理化方法主要是HPLC法,如-内酰胺 类、四环素类、大环内酯类等抗生素大多采用HPLC法测定含量。抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效价单位表示,即指每 毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。效价是以抗菌效 能(活性部分)作为衡量的

19、标准,因此,效价的高低是衡量抗生素质量 的相对标准。效价用单位(U)或微克(g)表示。各种抗生素的效价基准 是人们为了生产科研方便而规定的,如1mg青霉素钠定为1670 U ; 1mg 庆大霉素定为590 U ; 1mg 硫酸卡那霉素定为670 U。一种抗 生素有一个效价基准,同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子 量与标准盐类进行换算。例1mg 青霉素钾的单位 (U)=1670 X 356.4/372.5=1598 U/mg。 以上为抗生素的理论效价, 实际样品往往低于该理论效价。第二节B-内酰胺类抗生素本类抗生素包括青霉素类和头抱菌素类,它们的分子结构中均含 有B-内酰胺环,因此统称为B

20、-内酰胺类抗生素。一、化学结构与性质1.化学结构青霉素和头抱菌素分子中都有一个游离羧基和酰 胺侧链。氢化噻唑环或氢化噻嗪环与B-内酰胺并合的杂环,分别构成 二者的母核。青霉素类分子中的母核称为6-氨基青霉烷酸;头抱菌素 类分子中的母核称为7-氨基头抱菌烷酸。通常青霉素类分子中含有三 个手性碳原子(C2、C5、C6),头抱菌素类分子中含有两个手性碳原子 (C6、C7)。由于酰胺基上R以及R1的不同,构成各种不同的青霉素 和头抱菌素。2 性质(1) B-内酰胺环的不稳定性:B-内酰胺环是该类抗生素的结构活 性中心,其性质活泼,是分子结构中最不稳定部分,其稳定性与含水 量和纯度有很大关系。干燥条件下

21、青霉素和头抱菌素类药物均较稳定, 室温条件下密封保存可贮存3年以上,但他们的水溶液很不稳定,随 pH和温度而有很大变化。青霉素水溶液在pH 66.8时较稳定。本 类药物在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子(铜、铅、汞和银) 或氧化剂等作用下,易发生水解和分子重排,导致B-内酰胺环的破坏 而失去抗菌活性。(2) 旋光性:青霉素类分子中含有三个手性碳原子,头抱菌素类 含有两个手性碳原子,故都具有旋光性。根据此性质,可用于定性和 定量分析。(3) 酸性与溶解度:青霉素类和头抱菌素类分子中的游离羧基具 有相当强的酸性,大多数青霉素类化合物的pKa在2.52.8之间, 能与无机碱或某些有机碱形成盐。其

22、碱金属盐易溶于水,而有机碱盐 难溶于水,易溶于甲醇等有机溶剂。青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则 析出游离基的白色沉淀。(4) 紫外吸收特性:青霉素类分子中的母核部分无共轭系统,但 其侧链酰胺基上R取代基若有苯环等共轭系统,则有紫外吸收特征。 如青霉素钾(钠)的R为苄基,因而其水溶液在264nm 波长处具有较 强的紫外吸收。而头抱菌素类母核部分具有0 = C N C = C结构, R取代基具有苯环等共轭系统,有紫外吸收。本类药物在不同条件下的降解反应见图16-1和图16-2 。二、鉴别试验本类药物的鉴别试验,现版ChP、USP、BP采用的方法主要为HPLC、IR 和 TLC 法。(一) 色谱法利用比

23、较供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间(tR)是否 一致或比较供试品溶液与对照品溶液所显主斑点的位置和颜色是否相 同进行鉴别。HPLC法一般都规定在含量测定项下记录的色谱图中, 供试品溶液主峰应与对照品溶液主峰的保留时间一致。中国药典对鉴 别试验中有HPLC法又有TLC法的,规定可在两种鉴别方法中选做一一 种。(二)光谱法1.红外吸收光谱(IR) 红外吸收光谱反映了分子的结构特征,各国药典对收载的价内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该 类抗生素的B-内酰胺环羰基的伸缩振动(17501800cm-1),仲酰胺 的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1、1525 cm-1 、1680 c

24、m-1)、羧酸离子的伸缩振动(1600cm-1、1410cm-1) 是该类抗生素共有的特征峰。2 .紫外吸收光谱(UV) 本类药物的紫外光谱鉴别法通常利用最 大吸收波长鉴定法:将供试品配成适当浓度的溶液,直接测定紫外吸 收光谱,根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸光度进行鉴定。 如头抱唑林钠的紫外鉴别法:取本品适量,加水溶解并稀释制成每1ml 中约含16 g的溶液,在272nm 的波长处有最大吸收。(三)呈色反应1 .羟肟酸铁反应 青霉素及头抱菌素在碱性中与羟胺作用,B- 内酰胺环破裂生成羟肟酸;在稀酸中与高铁离子呈色。哌拉西林(钠)、 头抱哌酮、拉氧头抱钠采用此法鉴别。2 .类似肽键的反应

25、 本类药物具有-CONH-结构,一些取代基 有-氨基酸结构,可显双缩脲和茚三酮反应。3 .其他呈色反应 侧链含有-C6H5-OH 基团时,能与重氮苯磺 酸试液产生偶合反应而呈色。此外,本类药物还可与变色酸-硫酸、硫 酸-甲醛等试剂反应而呈色。(四)各种盐的反应钾、钠离子的火焰反应: 青霉素类、头抱菌素类药品中,许多 制成钾盐或钠盐供临床使用,因而可利用钾、钠离子的火焰反应进行 鉴别。如阿莫西林钠、头抱尼西钠、头抱西丁钠、头抱曲松钠等钠离 子的鉴别;青霉素V钾、青霉素钾等钾离子的鉴别。检查本类抗生素的杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等, 一般采用HPLC法控制其限量,也有采用测定杂质的吸

26、光度来控制杂 质量的。此外,有的还进行结晶性、抽针与悬浮时间等有效性试验, 部分抗生素还检查有机溶剂残留量。(一)聚合物中国药典规定需检查聚合物,聚合物的检查采用分子排阻色谱法。 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱 技术,其分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、 凝胶或经修饰凝胶,如葡聚糖凝胶(Sephadex) 和聚丙烯酰胺凝胶 (Sepharose) 等为填充剂,这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径, 药物分子进入色谱柱后,它们中的不同组分按其分子大小进入相应的 孔径内,大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部,在色谱过程 中不被保留,最早被流动相洗

27、脱至柱外,表现为保留时间较短;小于 所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在色谱柱中滞留 时间较长,表现为保留时间较长;其余分子则按分子大小依次被洗脱。 分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法,液相色谱 泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中,尤其是分子量或分子量 分布测定中,通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试 品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓 冲液,其pH不宜超出填充剂的耐受力,一般pH在28之间。流动 相中可加入适量的有机溶剂,但不宜过浓,一般不应超过30%,流速 不宜过快,一般为0.51.0ml/min 。高效分子排阻色

28、谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、 分离度、重复性、拖尾因子的测定方法,在一般情况下,同高效液相 色谱法项下方法,但在高分子杂质检查时,某些药物分子的单体与其 二聚体不能达到基线分离时,其分离度的计算公式为:R=二聚体的 峰高/单体与二聚体之间的谷高。除另有规定外,分离度应大于2.0。 定量方法: 主成分自身对照法。 一般用于高分子杂质含量较低 的品种。面积归一化法。限量法。 规定不得检出保留时间小于 对照品保留时间的组分,一般用于混合物中高分子物质的控制。自 身对照外标法。一般用于Sephadex G-10凝胶色谱系统中 价内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中,除部分寡

29、聚物外, B-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分 子杂质表现为单一的色谱峰,以供试品自身为对照品,按外标法计算 供试品中高分子杂质的相对百分含量。(二) 有关物质和异构体B-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体通常采用色谱法检查。 本类药物多数规定有关物质检查,部分还检查异构体杂质。头抱呋辛酯中有关物质和异构体的检查:色谱条件与系统适用性 试验:以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂;以0.2mol/L 磷酸二氢铵 溶液-甲醇(62 : 38)为流动相;检测波长为278 nm 。取头抱呋辛酯对 照品适量,加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.2 mg 的溶液, 取此液在60 C

30、水浴中加热至少1小时,冷却,得含头抱呋辛酯A3-异 构体的溶液;另取本品适量,加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含 0.2 mg的溶液,经紫外光照射24小时,得含头抱呋辛酯E异构体的 溶液。取上述两种溶液各20 l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。 头抱呋辛酯A、B异构体、A3-异构体及E异构体峰的相对保留时间分 别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。头抱呋辛酯A、B异构体之间, 头抱呋辛酯A异构体与A3-异构体之间的分离度应符合要求。测定法:取本品适量,精密称定(约相当于头抱呋辛酯25mg), 置100ml量瓶中,加甲醇5ml溶解,再用流动相稀释至刻度,摇匀, 立即精密量取20 l注

31、入液相色谱仪,记录色谱图;另取头抱呋辛酯 对照品适量,同法操作并测定。按外标法以头抱呋辛酯主峰峰面积计 算供试品的含量。异构体:在含量测定项下记录的供试品溶液色谱图中,头抱呋 辛酯A异构体峰面积与头抱呋辛酯A、B异构体峰面积和之比应为0.48 0.55 。有关物质:取本品适量,精密称定(约相当于头抱呋辛酯50mg), 置100ml量瓶中,加甲醇10ml ,强力振摇溶解,再用流动相稀释至 刻度,摇匀,作为供试品溶液;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用 流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。取对照溶液20 l注入液 相色谱仪,调节检测灵敏度,使两主成分中任一主成分色谱峰的峰高 约为满量程的20

32、%,立即精密量取供试品溶液与对照溶液各20 l, 分别注入液相色谱仪,记录色谱图至头抱呋辛酯A异构体峰保留时间 的3.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,两个E异构体峰面积之 和不得大于对照溶液两个主峰面积之和(1.0%) ,-异构体峰面积不 得大于对照溶液两个主峰面积之和的1.5倍(1.5%),其他单个杂质峰 面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和的0.5倍(0.5%),各杂质峰 面积的和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的3倍(3.0%),供试品 溶液色谱图中任何小于对照溶液两个主峰面积之和0.05倍的峰可忽 略不计。此外,一些药物如氨苄西林需检查N,N-二甲基苯胺,采用 GC法测定,限量为“

33、不得过百万分之二十”;头抱拉啶需检查头抱 氨苄等有关物质。(三)吸光度药典也常采用测定杂质吸光度方法来控制本类抗生素的杂质含 量。青霉素钠(钾)的吸光度检查:取本品,精密称定,加水溶解并定 量稀释制成每1ml中约含1.80mg 的溶液,在280nm 的波长处测定 吸光度,吸光度均不得大于0.10 ;在264nm 的波长处有最大吸收, 吸光度应为0.800.88。此法中264nm处吸收值用来控制青霉素钠(钾)的含量,280nm 处吸收值用来控制杂质的量。(四)结晶性固态物质分为结晶质和非结晶质两大类。可用下列方法检查物质 的结晶性。第一法(偏光显微镜法):许多晶体具有光学各向异性,当光线 通过这

34、些透明晶体时会发生双折射现象。取供试品颗粒少许,置载玻 片上,加液状石蜡适量使晶粒浸没其中,在偏光显微镜下检视,当转 动载物台时,应呈现双折射和消光位等各品种项下规定的晶体光学性 质。第二法(X射线粉末衍射法):结晶质呈现特征的衍射图(尖锐的 衍射峰),而非晶质的衍射图则呈弥散状。中国药典对青霉素V钾、 青霉素钠、头抱丙烯、头抱地尼、头抱曲松钠、头抱呋辛酯、头抱硫 脒等规定了结晶性检查。四、含量测定各国药典收载的青霉素类和头抱菌素类的含量测定除少数几个样 品采用抗生素微生物检定法测定外,大多采用HPLC测定方法。(一)高效液相色谱法高效液相色谱法是近年来发展最快的方法,它能有效地分离供试 品中

35、可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质,并能准确 定量,适用于本类药物的原料、各种制剂及生物样本的分析测定。中 国药典收载的本类抗生素中除磺苄西林钠采用微生物检定法测定含量 外,其余均采用HPLC法测定含量。此外,利用本类药物B-内酰胺环的不稳定性,药典曾采用降解后 剩余碘量法、电位配位滴定法、硫醇汞盐法测定本类药物的含量。第三节氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素的化学结构都是以碱性环己多元醇为苷元,与氨基糖缩合而成的苷,故称为氨基糖苷类抗生素(Ami no glycosidesAntibiotics)。主要有硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、盐酸大观霉素、硫酸小诺米星、硫酸

36、巴龙霉素、硫酸卡那霉素、 硫酸西索米星、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸 新霉素等,它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。一、化学结构与性质(一) 化学结构以硫酸链霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星为 例,说明此类抗生素的结构特征与理化性质。链霉素(Streptomycin , 即链霉素A)的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的 碱性苷。其中链霉双糖胺是由链霉糖与N-甲基L-葡萄糖胺所组成。 链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱,链霉糖与N-甲基-L-葡萄糖 胺间的苷键结合较牢。nh3*NHNNH6 CH 2OHOHoI; OHIT CHO NH” OHOHCH

37、 3CH 3链霉胍streptidine链霉糖streptoseN-甲基-L-葡萄糖胺N -methyl-L-glucosamine链霉双糖胺stroptobiosamine庆 大霉素(Gentamycin)是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷。它是庆大霉素C复合物,尚有少量次要成分(如庆大霉素 A1、A2、A3、A4、B、B1、X)。主要组分C1、C2、C1a及OR2R1HN* *绛红糖胺2- 脱氧链霉胺purpurosamine deoxystreptosamine garosamineC2a的结构如下:OH *OH NHCH 3OH加洛糖胺J庆大霉素C1、C2、C1a三者结构相

38、似,仅在绛红糖胺C-6位及 氨基上甲基化程度不同。C2a是C2的异构体。奈替米星(Netilmicin) 的分子结构与庆大霉素C1a基本相同,主要差异在于绛红糖胺环的 4,5位是双键。(二)性质氨基糖苷类抗生素的分子结构具有一些共同或相似处。庆大霉素、 巴龙霉素、奈替米星等分子中氨基环醇(脱氧链霉胺)结构与链霉素中 链霉胍相近;D-核糖与链霉糖相似;胺基己糖(D-葡萄糖胺)结构与链 霉素中N-甲基葡萄糖胺相似,因此,他们具有相似的性质。1. 溶解度与碱性该类抗生素的分子中含有多个羟基(故也称多 羟基抗生素)和碱性基团(分子式中有*号处),同属碱性、水溶性抗生 素,能与矿酸或有机酸成盐,临床上应

39、用的主要为硫酸盐。他们的硫 酸盐易溶于水,不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有机溶剂。2. 旋光性 本类抗生素分子结构中含有多个氨基糖,具有旋光性。如ChP2010 二部中硫酸奈替米星的比旋度为+88+96(水溶液);硫酸庆大霉素的比旋度为+107 +121 (水溶液);硫酸巴龙霉 素的比旋度为+50+55(水溶液)。3. 苷的水解与稳定性 含有二糖胺结构的抗生素(如链霉素、巴 龙霉素、新霉素),分子中氨基葡萄糖与链霉糖或D-核糖之间的苷键 较强,而链霉胍与链霉双糖胺(苷元与二糖胺)间的苷键结合较弱。一 般的化学反应只能将他们分解为一分子苷元和一分子双糖。链霉素的 硫酸盐水溶液,一般以pH 5.07

40、.5 最为稳定,过酸或过碱条件下易 水解失效。在酸性条件下,链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺,进一 步水解则得N-甲基-L-葡萄糖胺;碱性也能使链霉素水解为链霉胍及 链霉双糖胺,并使链霉糖部分发生分子重排,生成麦芽酚(maltol), 这一性质为链霉素所特有,可用于鉴别和定量。硫酸庆大霉素、硫酸 奈替米星等对光、热、空气均较稳定,水溶液亦稳定,pH 2.012.0 时,100 C加热30分钟活性无明显变化。4. 紫外吸收光谱链霉素在230nm 处有紫外吸收。庆大霉素、奈替米星等无紫外吸收。二、鉴别试验(一)茚三酮反应本类抗生素为氨基糖苷结构,具有羟基胺类和-氨基酸的性质, 可与茚三酮缩合成蓝紫色

41、化合物。硫酸小诺米星的茚三酮反应鉴别法:取本品约5mg ,加水1ml 溶解后,加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml ,在 水浴中加热5分钟,即呈紫蓝色。(二)Molisch 试验具有五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸水解后,在盐 酸(或硫酸)作用下脱水生成糠醛(五碳糖)或羟甲基糠醛(六碳糖)。这些 产物遇-萘酚或蒽酮呈色。阿米卡星的蒽酮呈色鉴别:取本品约10mg,加水1ml溶解后, 加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml,即显蓝紫色。(三) N-甲基葡萄糖胺反应(Elson-Morgan反应)本类药物经水解,产生葡萄糖胺衍生物,如链霉素中的N-甲基葡 萄糖胺,硫酸新霉素、硫酸

42、巴龙霉素中的D-葡萄糖胺,在碱性溶液中 与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物(I ),与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶 液(Ehrlich 试剂)反应,生成樱桃红色缩合物(n )。硫酸新霉素的N-甲基葡萄糖胺反应鉴别:取本品约10mg,加水 1ml溶解后,加盐酸溶液(9 -100)2 ml ,在水浴中加热10分钟,加 8%氢氧化钠溶液2 ml与2%乙酰丙酮水溶液1 ml,置水浴中加热5 分钟,冷却后,加对二甲氨基苯甲醛试液1 ml,即呈樱桃红色。(四)麦芽酚(Maltol) 反应此为链霉素的特征反应。链霉素在碱性溶液中,链霉糖经分子重 排使环扩大形成六元环,然后消除N-甲基葡萄糖胺,再消除链霉胍生 成麦芽酚

43、(-甲基-羟基-吡喃酮),麦芽酚与高铁离子在微酸性溶液 中形成紫红色配位化合物。硫酸链霉素的麦芽酚反应鉴别:取本品约 20mg ,加水5ml溶解后,加氢氧化钠试液0.3ml,置水浴上加热5 分钟,加硫酸铁铵溶液(取硫酸铁铵0.1g,加0.5mol/L 硫酸溶液5ml 使溶解)0.5ml,即呈紫红色。(五)坂口(Sakaguchi) 反应此为链霉素水解产物链霉胍的特有反应。本品水溶液加氢氧化钠 试液,水解生成链霉胍。链霉胍和8-羟基喹啉(或-萘酚)分别同次溴 酸钠反应,其各自产物再相互作用生成橙红色化合物。硫酸链霉素的 坂口反应鉴别:取本品约0.5mg,加水4ml溶解后,加氢氧化钠试液 2.5m

44、l与0.1% 8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml,放冷至约15 C,加次溴 酸钠试液3滴,即显橙红色。(六)硫酸盐反应本类药物多为硫酸盐,因此,各国药典都将硫酸根的鉴定作为鉴 别这类抗生素的一个方法。(七)色谱法1.薄层色谱法 采用TLC法对本类抗生素进行鉴别。多以硅 胶为薄层板,三氯甲烷-甲醇-浓氨水为展开剂,茚三酮或碘蒸气为显 色剂。2 .高效液相色谱法本类药物也可根据组分检查或含量测定项 下HPLC方法,通过比较供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别。 如BP2010利用本法鉴别庆大霉素,根据组分分析测得的色谱图,供 试品溶液色谱图中庆大霉素C1、 C1a、C2、C2a和C2b五组分的 色谱峰

45、保留时间应与对照品溶液的色谱峰保留时间一致。(八)光谱法1.红外吸收光谱 中国药典和英国药典均采用红外光谱法鉴别 本类药物,如硫酸庆大霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿 米卡星、硫酸新霉素、硫酸链霉素等。2 .紫外吸收光谱 本类药物多无紫外吸收,故其鉴别试验中很 少采用紫外法。但BP2010利用这一性质,采用紫外法对庆大霉素进 行鉴别,三、有关物质及组分分析(一)有关物质检查现版各国药典对本类抗生素的有关物质检查主要采用TLC和HPLC 法。硫酸链霉素中有关物质的HPLC检查:取本品适量,加水溶解并 稀释制成每1ml中约含链霉素3.5mg 的溶液,作为供试品溶液; 精密量取适量,用水定量

46、稀释制成每1ml中约含链霉素35 yg、 70 yg和14 yg的溶液,作为对照溶液(1)、(2)和。照高效液相色谱 法测定,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.15mol/L 的三氟醋 酸溶液为流动相,流速为每分钟0.5ml,用蒸发光散射检测器检测(参 考条件:漂移管温度为110 C,载气流速为每分钟2.8L)。取链霉素 对照品适量,加水溶解并稀释制成每1ml中约含链霉素3.5mg 的溶 液,置日光灯(3000IX)下照射24小时,作为分离度试验用溶液。取妥 布霉素对照品适量,用分离度试验用溶液溶解并稀释制成每1ml中 约含妥布霉索0.06mg 的混合溶液,量取10卩I,注入液相色谱仪,

47、记录色谱图。霉素峰保留时间约为1012分钟,链霉素峰与相对保留时间约 为0.9处的杂质峰的分离度和妥布霉素峰的分离度应分别大于1.2和 1.5。连续进样5次,链霉素峰面积的相对标准偏差应不大于2.0。量 取对照溶液(1)10卩I,入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色 谱峰的峰高约为满量程的20%,精密量取对照溶液(1)、和各 10卩I,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。以对照溶液浓度的对数与 相应峰面积的对数计算线性回归方程,相关系数(r)应不小于0.99。另 取供试品溶液,同法测定,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍, 供试品溶液色谱图中如有杂质峰(硫酸峰除外),用线性回归方程计算, 单个

48、杂质不得过2.0%,杂质总量不得过5.0%。链霉素B是指甘露糖链霉素,它是由链霉素分子中N-甲基葡萄 糖胺的C4位上的羟基连接一个D-甘露糖组成的。链霉素B本身是在 发酵中由菌种(球形抱子放线菌)产生的,其生物活性仅为链霉素的 20%25%,能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。因此, 如果提取、精制不彻底,链霉素中很可能残存活性较低的链霉素B。 欧洲药典、日本药典和英国药典规定了该项检查,采用薄层色谱法测(二)组分测定本类抗生素多为同系物组成的混合物,同系物的效价、毒性各不 相同,为保证药品的质量,必须控制各组分的相对含量,如ChP对硫 酸庆大霉素、硫酸小诺米星等规定了组分分析。现以庆

49、大霉素C组分 测定为例,介绍各国药典收载的分析方法。庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异,但其毒副 作用和耐药性有差异,导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效。 因此中、英、美、日等国药典均规定控制各组分的相对百分含量。ChP2010、USP29-NF27 和BP2010 均采用高效液相色谱法测 定庆大 霉素C各组分的含量。庆大霉素无紫外吸收,当采用紫外检测器检测时,需进行衍生化 处理。由于其具有强极性和水溶性,为获得理想的色谱结果,可采用 蒸发光散射检测器或利用庆大霉素C组分结构中的氨基与邻苯二醛 (o-phthaldehyde , OPA)、巯 基醋酸在pH10.4 的硼酸

50、盐缓冲液中反 应,生成1-烷基-2-烷基硫代异吲哚衍生物,在330nm 波长处有强吸 收。反应式如下:HOH-+ HSCH2COOH HO7N ROSCH 2COOHR NH2 + |ChP庆大霉素中庆大霉素C组分的HPLC检测:ChP采用蒸发光 散射检测器检测庆大霉素中庆大霉素C组分。色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂(pH范围0.88.0);以0.2mol/L 三氟醋酸-甲醇(92 : 8)为流动相; 流速为每分钟0.6m l ;用蒸发光散射检测器检测(参考条件:漂移管温 度110 C,载气流速为每分钟2.8L),分别称取庆大霉素和小诺米星 标准品各适量,加流动相溶

51、解并稀释制成每1ml中各约含庆大霉素 1.0mg 与小诺米星0.2mg的混合溶液,取20 l注入液相色谱仪,记 录色谱图,C组分的出峰顺序从第二个主峰计,依次为庆大霉素C1a、 C2、小诺米星、C2a、C1,小诺米星和C2、C2a峰之间的分离度应 符合要求,连续进样数次,小诺米星峰面积的相对标准偏差应不大于 2.0%。测定法: 取庆大霉素标准品适量,精密称定,加流动相溶解并 定量稀释制成每1ml中约含庆大霉素1.0mg、2.5mg 和5.0mg的溶 液作为标准品溶液(1)、(2)、(3)。取上述三种溶液各20 l,分别注入 液相色谱仪,记录色谱图,计算标准品溶液各组分浓度的对数值与相 应的峰面

52、积对数值的线性回归方程,相关系数(r)应不小于0.99 ;另取 本品适量,精密称定,加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含庆 大霉素2.5mg的溶液,同法测定,用庆大霉素各组分的线性回归方程 分别计算供试品中对应各组分的量(Xcx),并根据所得的各组分的量 (Xcx)按下面公式计算出各组分的含量。XcxCx (%)=X 100%Xcia + Xc2 + Xc2a + XC1式中,Cx为庆大霉素各组分的含量;C1应为25%50%,C1a 应为 15% 40%,C2+C2 a 应为 20% 50%。USP庆大霉素中庆大霉素C组分的衍生化紫外检测HPLC测定法 邻苯二醛溶液的制备: 取邻苯二醛1.

53、0g,加1ml甲醇溶解,加 0.4mol/L 的硼酸溶液95ml ,用8mol/L 的氢氧化钾溶液调pH 为 10.4,加巯基醋酸2ml ,再用8mol/L 的氢氧化钾溶液调pH为10.4。流动相的制备: 取1-庚烷磺酸钠5.0g,加甲醇700ml溶解, 并与250ml水和50ml冰醋酸混合均匀,作为流动相。对照品溶液的制备: 取硫酸庆大霉素对照品适量,加水制成每 1ml含0.65 mg 的溶液,精密量取1025ml于量瓶中,加5ml异 丙醇和4ml邻苯二醛溶液,混匀,加异丙醇至刻度。60 °C水浴加热 15分钟,放置室温,作为对照品溶液。供试品溶液的制备:同法制备供试品溶液。色谱系

54、统适用性试验: 检测波长330nm,用十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂(5mm x 10cm ,5卩m)的色谱柱,流动相流速约 1.5ml/min 。供试品溶液的色谱中,任意两峰之间的分离度均不得低 于1.25,庆大霉素C1的容量因子在27之间,庆大霉素C2理论板 数大于1200,重复性相对标准偏差小于2.0%。测定法: 精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 l,分别注入 液相色谱仪,记录色谱图,洗脱的顺序为庆大霉素C1、C1a、C2a和 C2,计算个组分的百分含量。庆大霉素C1应为25%50%,庆大霉 素C1a应为10%35% ,庆大霉素C2+C2a 应为25%55% 。BP庆大霉素中庆大霉素

55、C组分的HPLC柱后衍生化电化学检测 测定法色谱条件与系统适用性试验:以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为固定 相(250mm x 4.6mm,8卩m,孔径100 nm)色谱柱,柱温55 C。用无 二氧化碳的水制备每1L中含无水硫酸钠60g、辛烷磺酸钠1.75g、四 氢呋喃8ml和0.2mol/L 磷酸二氢钾溶液50 ml的混合溶液(用稀磷酸 调pH 3.0)为流动相,用前脱气,流速1.0 ml/min 。预先脱气的氢氧 化钠溶液(1 -25)为柱后添加溶液,流速0.3 ml/min 。脉冲安培检测 器。进样体积20卩I运行时间至庆大霉素C1保留时间的1.2倍。限度: 庆大霉素C1: 20.0% 40.

56、0% ;庆大霉素C1a: 10.0% 30.0% ;庆 大霉素C2、C2a和C2b的总和:40.0% 60.0%。ChP和BP也曾采用USP同样的方法测定庆大霉素C组分,但在 现版药典中分别改用了蒸发光散射检测器和电化学检测器。四、含量测定氨基糖苷类抗生素的效价测定主要有微生物检定法和HPLC法。 氨基糖苷类抗生素的HPLC测定法可分为离子交换(酸性条件下在阳 离子交换柱上分离)、离子对(以烷基磺酸盐为反离子)和反相HPLC法, 由于本类抗生素多数无紫外吸收, 不能直接用紫外或荧光检测器, 需进行柱前或柱后衍生化,或采用电化学检测器、蒸发光检测器检测。 ChP2010 采用HPLC-蒸发光散射

57、法测定硫酸卡那霉素、硫酸依替米 星等药物的含量。HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量:色谱条件与系统适用性试验:精密量取硫酸滴定液适量,用水 定量稀释制成每1ml中约含硫酸盐(S04)0.075mg、0.15mg 和0.30mg 的溶液作为对照溶液、(2)、(3)。用十八烷基硅烷键合硅 胶为填充剂(pH范围0.88.0);以0.2mol/L 三氟醋酸-甲醇(84 : 16) 为流动相;流速为每分钟0.5ml ;用蒸发光散射检测器检测(参考条件: 漂移管温度100 C,载气流速为每分钟2.6L),取依替米星和奈替米 星对照品各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中各0.2mg 的混合溶 液,取

58、20 l注入液相色谱仪,记录色谱图,依替米星峰和奈替米星 峰的分离度应大于1.2,连续5次进样,依替米星峰面积的相对标准 偏差应不大于2.0%。第四节四环素类抗生素四环素类抗生素在化学结构上都具有四个并苯或萘并萘环构成,故统称为四环素类(tetracycli nes) 抗生素。、化学结构与性质(一)化学结构四环素类抗生素,可以看作四并苯或萘并萘的衍生物,基本结构如下:结构中各取代基R、R'、R 及R' 不同构成各种四环素类抗生素个别四环素类抗生素如盐酸多西环素分子结构中含有1/2分子乙醇和1/2分子水。(二)性质1. 酸碱性与溶解度本类抗生素的母核上C4位上的二甲氨基-N(CH3)2 显弱碱性;C10位上的酚羟基(-OH)和两个含有酮基

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