川续断皂苷VI和其活性代谢物在大鼠体内药代动力学探究

1、川续断皂昔vi和其活性代谢物在大鼠体内药代动力学探究摘要研究川续断皂昔vi (asperosaponin vi, a-vi)及其活性代谢产物常春藤皂昔元(hederagenin, ml) 在大鼠体内的药代动力学、排泄特征和a-vi的大鼠血浆蛋 白结合率。釆用已建立的lc-ms/ms法测定大鼠血浆、胆汁、 尿液和粪便中a-vi和ml浓度，计算药代动力学参数，并 用平衡透析法测定大鼠血浆中a-vi的血浆蛋白结合率。大鼠以低、中、高(0. 03, 0. 09, 0. 27 g - kg-1) 3个剂量分别单次灌胃给予a-vi后，a-vi的血药浓度-时间曲线出现双峰现象，cmaxl和cmax2分别为(

2、28. 88±49. 78)(4. 480± 1.872 )35. 19±23. 53 )(22. 11±16. 15 )73. 37±37. 28 )auco-t 分别(43. 21±37. 32 ),p g h l1 ； tl/2(132. 2±160. 7 )(133. 9±102. 5 ), ( 779. 6±876. 9 )分别为(3.3±08), (3. 2±2. 3),(4. 5± 1. 2 ) h o代谢产物ml相应的cmax分别为(16. 03 + 9. 3

3、36 ), ( 26.41 土 11.95 ) , ( 28. 71 ±5. 874 ) ug l-l； auco-t 分别为(105. 6±73. 60), (260. 0± 153. 9), (323. l±107.9) ug h l-l； tl/2 分别为(4. 1±3.4), (4.4±23), (3. 9±0. 9) ho a-vi和ml在大鼠体内药动 学特征不存在性别差异，按0.09 gkg-1剂量多次灌胃a-vi 后a-vi和ml在体内均无蓄积。灌胃a-vi后，a-vi的胆汁 和尿液排泄速率-时间曲线也出现双峰

4、现象，灌胃a-vi 6 h 以后可以在大鼠粪便中检测到ml。a-vi在大鼠血浆中的平 均血浆蛋白结合率为92. 9%o关键词川续断皂昔vi；常春藤皂昔元；药代动力学； 蛋白结合率；胆汁排泄；尿液排泄；平衡透析法川续断皂昔vi （a-vi）是续断药材主要活性成分，具有 抗氧化、镇痛、心肌保护和抗老年痴呆的药理作用1-2 o 常春藤皂昔元（ml）为a-vi的主要活性代谢产物，具有抗 抑郁、抗炎症等作用3-4 o本课题组前期报道了大鼠粪便 中a-vi的5个代谢产物3,其中ml为主要代谢产物；报 道了 lc-ms/ms同时测定大鼠血浆中a-vi和ml的方法及其 在药动学预试验研究中的运用5, lc-m

5、s/ms测定比格犬血 浆中a-vi的方法及其在药动学预试验研究中的运用6。目 前除了作者前期的初步研究，有关a-vi在体内的过程及血 浆蛋白结合率未见报道。本实验对大鼠灌胃a-vi后原形及 其活性代谢产物ml的药代动力学及胆汁、尿液和粪便排泄 进行研究，采用平衡透析法7-8考察了 a-vi与大鼠血浆蛋 白的结合情况，为a-vi的进一步研发和临床应用提供参考。1材料对照品川续断皂昔vi （批号200412009,纯度98. 6%）和常春藤皂昔元（批号111733-200904,纯度98.0%）.地 西泮（批号 171225-200903 ）和甘草次酸（批号 110723-200612）购自中国食

6、品药品检定研究院；川续断皂 昔vi原料药（批号20091101,纯度91.5%）为神华药业有 限公司中试放大产品；甲醇和乙晴（色谱纯，merk company ）； 乙酸（色谱纯，江苏汉邦科技股份有限公司）；其他试剂均 为市售分析纯。agilent 1200液相色谱-agilent 6410b三重四极杆串 联质谱联用仪，配有电喷雾离子源；ph计（型号phs-25型, 上海精密科学仪器有限公司）；高速离心机（型号1612-1型, 上海医疗器械集团有限公司）；数显恒温水浴锅（型号hh-2 型，国化电器有限公司）;sartorius电子天平（型号bp211d）； 透析袋（mwc0： 8 000-1万

7、da, 2. 7 cm,上海蓝季科技发 展有限公司）。spf 级 sprague dawley （sd）系大鼠，体重 180210 g, 雌雄各半，由浙江省实验动物中心提供，合格证号scxk （浙）2008-0033o2方法2. 1生物样品检测方法见参考文献4。2.2大鼠单、多次灌胃a-vi的药动学研究取大鼠48只，体重180210 g,随机分成4组，每组12只，雄雌各半。单次灌胃a-vi组：实验前禁食12 h (不禁水)，按低、中、高(0. 03,0. 09,0.27 g - kg-1)剂量分别灌胃给予a-vi的0. 5%cmc-na混悬液，于灌胃a-vi前及灌胃 a-vi 10，20，30

8、 min, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18, 24, 30 h后，眼眶静脉丛取血100 ul于肝素化离 心管中，4 000 r min-1离心10 min,分取血浆30 u l置 于-80 °c冰箱中保存，待测；给药后2 h给予食物。多次灌 胃a-vi组:按每次0. 09 g kg-1剂量灌胃给予a-vi的0. 5% cmc-na混悬液，连续给药7 d,每天1次。大鼠分别在第4,5, 6天灌胃a-vi前采血，第7天灌胃a-vi前禁食12 h,于第7天灌胃a-vi前及灌胃a-vi后按单次灌胃a-vi方法 采集血样并处理。血浆样品按文献方法5进行lc-ms/ms

9、分析。采用das 2. 0软件计算主要药代动力学参数。2. 3a-vi和ml的排泄研究2. 3. 1胆汁排泄研究取大鼠6只，体重190210 g,雄雌各半，禁食12 h后用20 %乌拉坦潜麻醉做胆管插管手 术，待动物清醒后按0.09 g - kg-1剂量灌胃给予a-vi的0. 5%cmc-na混悬液，分别收集给药后02, 24, 48, 8 12, 1216, 1620, 2024, 2428 h时间段的胆汁，记 录每个时间段大鼠胆汁排泄量，并以lc-ms/ms测定各时间 段胆汁中分析物浓度，计算累积排泄量、排泄率和排泄速率。2. 3.2尿液和粪便排泄研究取大鼠6只，体重190210g,雄雌各

10、半，禁食12 h后按0. 09 g kg-1剂量灌胃给予a-vi的0. 5%cmc-na混悬液，将大鼠置于代谢笼中，分别收 集给药灌胃a-vi后03, 36, 69, 912, 1216, 1624, 2436, 3648, 4872, 7296, 96120 h 粪便和03, 36, 69，912, 1216，1624, 2436, 36 48, 4872 h尿液。记录每个时间段大鼠的尿液量排泄体积。 粪便于室温下阴干后，称量每个时间段的粪便，记录重量。将阴干的粪便研磨成粉状，称取0. lg粪便粉末（不足0. 1 g 的全部称取）制备粪便匀浆。尿液和粪便样品经预处理后， 以lc-ms/ms测

11、定分析物浓度，计算累积排泄量、排泄率和 排泄速率9-14 o2.4平衡透析法研究a-vi的血浆蛋白结合率将处理后的透析袋一端折叠用线结扎，除去袋内外水分，取空白血浆0. 5 ml加入透析袋，将透析袋另一端扎紧, 使其悬浮于盛有20 ml含药透析外液的带盖广口瓶中，透析 外液（ph为7. 4,含0. 15 moll-1氯化钠的0. 02 moll-1 磷酸盐缓冲液）中a-vi的质量浓度分别为5, 20, 100 ugl-l,调整透析袋高度，使其内外液面保持同一水平， 并避免透析袋贴壁，密封瓶口，置于37 °c恒温水浴中放置 48 h至药物扩散平衡。透析结束后，用10%高氯酸溶液检查 透

12、析外液是否有蛋白漏出，有漏出者该样品作废6。分别 取透析袋内外样品，经预处理测定透析袋内药物质量浓度a(总质量浓度)和透析外液药物质量浓度b (游离药物质量 浓度)，根据公式2 (a-b) /a计算血浆蛋白结合率。3结果3. 1药代动力学研究3. 1. 1单次灌胃a-vi药动学研究3组大鼠分别单次灌 胃给予低(0.03 g kg-1)、中(0.09 g kg-1).高(0.27 gkg-1) 3个剂量a-vi后，血浆中a-vi和ml的平均血药 浓度-时间曲线见图13,不同剂量的a-vi和ml的药动学 参数见表1,由于3个剂量组大鼠a-vi的血药浓度-时间曲 线出现双峰现象，故分别给出了与双峰相

13、对应的cmax 1, cmax2, tmaxl, tmax2o采用spss 11.5软件对3个剂量组 a-vi和ml的tl/2, vd/f和cl/f进行单因素方差分析，对 tmax采用非参数检验。结果表明3个剂量组间a-vi的tl/2, vd/f, cl/f和tmax均无显著性差异，ml的tl/2和tmax 无显著性差异，vd/f和cl/f有显著性差异(p3. 3血浆蛋白结合率的测定3. 3.1平衡时间及透析袋吸附作用的考察在透析袋内 以空白透析液代替血浆，透析外液中a-vi的质量浓度分别 为5, 20, 100 ugl-1,按照2. 4项下操作，分别于12, 24, 36, 48, 60 h

14、终止透析(每个时间点各浓度水平平行做 3份样品)，经预处理分别测定透析袋内、外a-vi的浓度， 以透析袋内、外浓均吸附率为1.3%,对测试结果没有显著影 响。3. 3.2血浆蛋白结合率测定 按照2.4项下操作，低、 中、高3个质量浓度(5, 20, 100 ug l-1)每个浓度3 样品分析，计算血浆蛋白结合率。结果低、中、高3个质量 浓度(透析平衡后对应的透析袋内a-vi血浆浓度为56. 57, 216.9, 998.5 yl-l)的a-vi与大鼠血浆蛋白结合率分 别为(93. 5±0.2) %, (93. 0±0. 5) %, (92. 3±0. 9) %。4

15、讨论本研究首次评价了灌胃a-vi后原形a-vi及其活性代谢 产物ml在大鼠体内的药代动力学特征，胆汁、尿液和粪便 的排泄特征，以及a-vi的大鼠血浆蛋白结合率。结果表明, 大鼠单次灌胃给予低中高3个剂量的a-vi后，a-vi的血药 浓度-时间曲线出现双峰现象，0. 171 h出现第1个药时曲 线峰(cmaxl), 311 h出现第2个药时曲线峰(cmax2), 低剂量组第2个峰较小，随剂量的增加第2个峰显著增大甚 至高于第1个峰，由本实验结果知a-vi经胆汁的排泄量仅 占总灌胃a-vi量的0. 30%,不足以由a-vi的肝肠循环而达 到第2个血药浓度峰值，故可排除因肝肠循环产生的双峰现 象，推

16、测是由于a-vi的0. 5%cmc-na混悬液中存在溶解和未 溶解2种状态的a-vi,以分子状态溶解的a-vi可直接被快 速吸收而产生第1个峰，未溶解的a-vi需经溶解再被吸收 而产生第2个峰，从而产生双峰现象，且低剂量a-vi的0. 5%cmc-na混悬液中未溶解的a-vi较少，高剂量中未溶解 的a-vi较多，因此第2个峰的cmax2值随剂量的增加而增 大。低、中2个剂量组a-vi在大鼠体内暴露量（auco-1） 与灌胃a-vi剂量呈一定的线性关系，而高剂量组a-vi在体 内暴露量的增加值大于灌胃a-vi剂量的增加值；低、中2个剂量组ml在大鼠体内暴露量（auco-1）与灌胃a-vi剂量呈一

17、定的线性关系,而高剂量组ml在体内暴露量的增加值小于灌胃a-vi剂量的增加值，且ml达峰时间较晚tmax为 （13.6±2.5） h,推测是由于ml主要由肠道菌群代谢a-vi 而产生，高剂量灌胃a-vi后肠道中未被吸收的a-vi较多， 从而导致肠道菌群代谢a-vi的能力达到饱和程度而造成。 另外，灌胃给予a-vi后，胆汁的平均排泄速率-时间曲线与 血药浓度-时间曲线一致，也出现了双峰现象；尿液的排泄 研究结果显示除1只大鼠外，其余各大鼠的尿液排泄速率- 时间曲线均存在双峰现象；灌胃a-vi后胆汁和尿液中未检 出ml,灌胃a-vi 6 h后可在粪便中检测到ml,推测ml在 肠道内由肠道

18、菌群代谢产生。由于血浆中的游离型药物是产生药理效应的部分，也只有游离型药物才能被机体转化和排泄，高蛋白结合的药物, 体内游离药物易受多种因素的影响，临床上常常需要及时调整给药方案，因此有关新药的蛋白结合率研究具有重要意 义。本实验结果表明,a-vi与大鼠血浆蛋白结合率较高，a-vi 在血浆浓度为56. 5799& 5 ugl-1其蛋白结合率不变。 本研究为a-vi的药效和毒理学评价提供了实验参考资料， 为a-vi的进一步研发和临床应用提供了依据。参考文献1 zhou y q, yang z l, xu l, et al. akebia saponind, a saponin compo

19、nent from dipsacus asper wall, protects pc 12 cells against amyloid-beta induced cytotoxicity j. cell biol int, 2009, 33 (10)：1102.2 yu x, wang ln, du q m, et al. akebia saponind attenuates amyloid beta-induced cognitive deficits and inflammatory response in rats: involvement of akt/nf-kappab pathwa

20、y j. behav brain res, 2012,235(2)： 200.3 li k, yang x l, zhang c f, et al metabolitesof asperosaponin vi in rats' feces by hplc-msn j chin j nat med, 2009,7 (4)：440.4 choi j , jung h j , lee k t , et al. antinociceptive and anti-inflamniatory effects of the saponin and sapogenins obtained from t

21、he stem of akebia quinata j. j med food, 2005,8：78.5 zhu h, ding l, shakya s, et a 1. simultaneous determination of asperosaponin vi and its activemetabolite hederagenin in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with positive/negative ion-switching electrospray ionization and i

22、ts application in pharmacokinetic study j. j chromatogr b, 2011,879 (30)：3407.6 shakya s, zhu h, ding l, et al. determination of asperosaponin vi in dog plasma by highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a pilot pharmacokinetic study j biomed chromatogr,

23、2012,26 (1)：109.7 张弘，张晖芬，常会超，等.齐墩果酸在人血浆蛋白和血清白蛋白中结合率的测定j.药学学报， 2011,46 (2)：243.8 王沈阳，丁黎，郝歆愚，等.替加色罗大鼠血 浆蛋白的结合率测定j.江苏药学与临床研究，2006, 14(1)： 10.9 周颖，丁黎，刘筱雪，等.非布司他在健康受试者体内的尿药排泄特征j.中国药学杂志，2011,46(19)：1513.10 钱文娟，丁黎，文爱东，等.依普利酮在健康受试者体内的尿药排泄特征j.中国新药与临床杂志， 2009,28 (4)：258.11 王晶，丁黎，杜晓琅，等.人尿中磺化脱氢松香酸和钱的测定及尿药排泄特征研究

24、j.中国药学杂志， 2012,47 (10)：825.12 于勇，孙鲁宁，丁黎，等.人尿中对乙酰氨基苯甲酸和n, n-二甲氨基-2-丙醇的液质联用法测定及尿药排 泄特征研究j.药学进展，2011,35 (9)：417.13 刘荷英，储妍，丁黎，等.lc-ms/ms法同时测定人尿液中5-氟尿11 密喘和吉美11密噪浓度及其尿药排泄研 究j.药学与临床研究，2010,18 (3)：256.14 王怡薇，张英丰，李玉洁，等.戊已丸不同配伍对 代表成分胆汁排泄的影响j.中国中药杂志，2011, 36(23)： 3319.15 qian w j, ding l, wen a d, et al. esta

25、blishment of hplc-esi-ms method for the determination of eplerenone in human plasma and its pharmacokinetics j acta pharm sina, s2009, 44 (7)： 771.16 储妍，丁黎，刘荷英，等.奥替拉西钾血药和 尿药浓度的测定及其药代动力学和药物蓄积性评价j中 国药科大学学报，2011,42 (5)：436.study on pharmacokinetics of asperosaponin vi andits active metabolite in ratsli

26、u rui-juanl, zhu hel, ding li 1*, shakyashailendral, yang zhong-lin2, cheng lui(1. department of pharmaceutical analysis, china pharmaceutical university, nanjing 210009, china；2. college of traditional chinese medicine, china pharmaceutical university, nanjing 210009, china) abstract to study the p

27、harmacokinetics , excretion characteristics and plasma protein binding rate of asperosaponin vi ( a-vi ) and its active metabolite hederagenin ( ml ). a-vi and mlconcentrations in plasma, bile, urine and feces were determined by established lc-ms/ms to calculate the pharmacokinetic parameters the pl

28、asma protein binding rate of a-vi was determined by equilibrium dialysis method. the double peaks was observed in the a-vi plasma concentration-time curve , after rats were orally administered with low, medium and high doses of a-vi(0. 03,0. 09,0. 27 g kg-1) . the cmaxl and cmax2 ofavi were(28. 88&#

29、177;49. 78 )and(4. 480± 1.872 )u g lt ,(35. 19±23. 53 )and(22. 11±16. 15 )ug l-l ,(73. 37±37. 28 )and(132. 2±160. 7 )p g l1 ,respectively. the aucotof a-vi were(43.21±37. 32),(133.9±102.5) and (779. 6±876. 9)p g h l1，respectively. the tl/2of a-vi were(3.3±0.8),(32±23)and (4.5