细胞工程重点2

1、名词解释生物工程：利用生物生产产品和新物种（新性状）。细胞工程：在细胞水平生产产品和创造新物种、新性状。动物细胞与组织培养：动物体内细胞与组织在体外培养、存活、增殖的技术。原代培养：增值十代内的细胞培养。传代培养：原代培养细胞转接到新培养基上培养。细胞系：无限传代培养的细胞群。贴壁型细胞：必须贴附在某固相表面才能生存、生长的细胞。非贴壁型细胞：不须贴壁，可悬浮培养的细胞。组织工程：人体组织细胞种植在生物支架上培养增殖，再移植到人体上，达到器官修复的技术。干细胞：一类具有自我更新和分化潜能的细胞。成体干细胞：成体组织内具有进一步分化潜能的细胞，是多能或单能干细胞。胚胎干细胞：来源于早期胚胎或原始

2、生殖细胞的可以分化成任意一种组织类型的全能性细胞。细胞融合（体细胞杂交）：用人工方法使两个或以上细胞合并成一个细胞的技术。多克隆抗体:针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物。单克隆抗体：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。胞质杂种：将两种来源不同的核外遗传物质（细胞器）与一个特定的核组合在一起的到的细胞。细胞重组：从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。胞质体：去除细胞核后由质膜包裹的无核细胞。核体：与细胞质分离后得到的带有少量细胞质并包

3、有质膜的细胞核。克隆：指一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式。克隆技术：将细胞核植入去核的未受精卵细胞中发育成胚胎后移植受体子宫，妊娠产出克隆动物的技术。核移植技术：将细胞核移入同体或异体动物去核的成熟卵细胞内的技术。单倍体：含配子染色体数目的个体多倍体：体细胞含有大于等于3个相同染色体组的个体染色体工程：增减、替换染色体来改变遗传性状雌核发育：精子核进入卵细胞后消失，卵细胞核发育为胚胎雄核发育：失活卵子与正常精子受精，用冷热休克法使精子核加倍，发育为父本形状二倍体。微细胞介导转移：染色体介导转移：人工诱导雌核发育：人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或射线等处理后的失活精子来

4、“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排除，使卵子发育为正常的二倍体动物人工种子的培养流程：选取目标植物从合适的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移到无激素培养基培养形成体细胞胚加培养液，包裹人工种皮人工种子植物细胞培养一、培养基：1、无机盐类：硝酸盐、铵盐、K、P、Mg、Ca、S等；2、碳源：蔗糖、葡萄糖3、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素4、氮源 有机：蛋白胨、酵母膏 无机5、有机酸：柠檬酸、丙酮酸、苹果酸等6：复合物质：酵母、麦芽抽提物、椰汁、果汁二、植物细胞单细胞培养方法（小规模）：单细胞制备：1、机械法

5、：切、磨；2、酶解法：去壁为原生质体；3、愈伤组织法：愈伤组织（果胶酶）1、平板培养法2、看护培养与饲养层培养法看护培养：用愈伤组织看护培养单细胞，使其增值生长。饲养层培养：用X射线等处理得到不分裂的活细胞（饲养细胞）来饲养所需要的单细胞。3、液体浅层静置培养4、细胞悬浮培养三、植物细胞大规模培养（反应器悬浮培养）：悬浮细胞的同步化（重要）方法：1、物理法：体积筛 冷处理4 2、化学法：饥饿法 抑制法（尿苷） 秋水仙素1、分批培养：一次性加培养液，一次性获得产物。2、流加式培养：分批培养是，间隙加营养。3、半连续式培养：隔一定时间换一部分培养液。4、连续培养：连续的以一定的速度添加营养液，同时

6、以一定的速度排出营养液。5、灌流式培养：连续的以一定的速度添加营养液，同时以一定的速度排出营养液（无细胞）动物细胞培养：一、 培养条件1、 温度：37（哺乳） 40几小时死亡2、 PH：7.27.4 6或7.6死亡3、 气体：O2/CO24、 培养基（营养）：要求高、糖类、氨基酸、维生素、激素、生长因子、矿质、血清（1） 天然培养基：动物体液（提取液）如血清、水解乳蛋白、胶原、鸡胚汁等（2） 合成培养基：MEM+少量小牛血清（3） 半合成培养基：MEM+生长因子5、 必需的培养液 平衡盐水（BSS）：生理盐水+葡萄糖 PH调整液：如3、7%NaHCO3(缓冲液) 细胞消化液：分散细胞(胰蛋白酶

7、液、EDTA) 抗生素液：防污染（青霉素、链霉素、卡拉霉素）二、动物细胞培养方法（小规模）1、悬滴培养 2、旋转管培养 3、灌注小室法 4、培养瓶培养（主要方法）5、培养板法1、 大规模：贴壁培养技术、悬浮培养技术、微载体培养技术、多空载体培养技术、微囊化培养技术、中空纤维法、生物反应器培养技术（柱状中空纤维反应器、板框式中空纤维反应器、中心灌流式反应器、灌流式微载体反应器、微载体反应）原生质体培养技术：1、材料准备（叶片、根尖、花粉、愈伤组织）2、原生质体制备：机械法：质壁分离，再破壁；酶解法：果胶酶、纤维素酶、蜗牛酶3、原生质体纯化：过滤、离心（除碎片，收集原生质体）漂浮法 25%蔗糖4、

8、原生质体活力测定：染色法：FDA（发荧光为活）、酚藏花红染料法（红活 白死）、伊文思蓝（白活 蓝死）； 胞质环流；渗透压改变；氧电极（活放氧）5、原生质体培养：液体培养、固体平板法培养、双层培养6、细胞壁再生：再生培养基中培养，多次继代，促再生细胞大量繁殖7、愈伤组织或胚状体诱导形成8、植株再生：愈伤组织（先诱芽、后诱根）；胚状体植株胚胎干细胞的获得、分离与建系：1、 ES细胞分离与获得：早期胚胎细胞：囊胚期内细胞团分离获得原始生殖细胞：从原始生殖细胞分离获得2、 ES细胞分化抑制培养： 饲养层培养 STO：小鼠胎儿成纤维细胞 PMEF：原代胎儿成纤维细胞（常用）目的：抑分化、促分裂（白血病抑

9、制因子（LIF）、成纤维细胞生长因子） 无饲养层培养：条件培养基，加入分化抑制因子LIF、促分裂生长因子3、 ES细胞系培养与保存：一旦建系，增值迅速，应不断冻存，使用时解冻4、 ES细胞体外诱导分化转基因方法：物理法：电穿孔、微注射化学法：DEAE葡聚糖法、磷酸钙与DNA共沉生物法：胞质体、反转录病毒法基因工程的研究方法：细胞融合技术：1、 亲本选择：A、B2、 遗传标记：营养缺陷型、抗药性3、 原生质体制备4、 原生质体融合（PEG、电融合）5、 融合细胞壁再生（再生培养基）6、 融合细胞筛选（筛选培养基）7、 新物种（植株）的获得细胞融合的方法：生物法、化学法、物理法生物法：只能应用于动

10、物细胞上，病毒需提前培养并对其灭火，操作繁琐，而且一旦灭活不充分，还可能感染操作者和亲本细胞化学法，包括NaNO3诱导融合高pH的高Ca离子诱导融合，PEG诱导融合。硝酸钠诱导融合特点是对原生物体无损害，但融合率低，一般小于4%；高pH的高钙离子浓度诱导融合容易，融合率可达10%；PEG融合的特点是成本低，异核率高，融合过程不受物种限制，但融合进程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。物理法：最常用的是电融合法，特点是融合率高，操作简便，易于控制，重复性强，对细胞伤害小。融合细胞的筛选：一般有两大类方法：根据遗传和生理生化特征的互补选择法；另一类是根据可见标记性状的机械选择法，最简单的方法是利用双亲细

11、胞形态和色泽上的差异选择融合细胞。具体筛选方法有：抗药性筛选系统 营养互补筛选系统 温度敏感突变型融合细胞的筛选 物理特性筛选法 荧光标记法人工诱导单倍体的方法：1、远缘杂交 2、延迟授粉 3、核置换 4、射线照射 5、花粉培养（最有效途径）单倍体育种方法：杂交F1代花药（XY）花药培养为单倍体植株秋水仙素纯合二倍体（XXYY可育）人工诱导多倍体的方法：1、 生物学方法：胚乳培养 体细胞杂交2、 物理方法：温度激变：冷休克（05）、热休克（30）水静压法：65kg/cm2高水静压，抑第二极体放出机械创伤、电离辐射、高盐髙碱等3、 化学法：细胞松弛素B（抑制细胞质分裂） 秋水仙素：最有效、最广泛 PEG异源多倍体：加倍染色体组来源于不同物种。育种方法：先远缘杂交杂交染色体加倍新物种(人工创造)小麦（ABD）×黑麦（R）F1(ABDR)不育秋水仙素加倍小黑麦（AABBDDRR）可育试管动物培养：1、 雌体超排卵治疗与卵子获得及成熟培养2、 雄性精子采集与体外优化处理3、 精卵体外人工受精4、 受精卵体外培养至胚胎（囊胚）5、 孕母受体选择与激素治疗处理（生理与胚胎同步）6、 胚胎移植7、 胚胎孕母子宫内发育