特异性DC疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效及治疗后血清ICAM-1、ICAM-3水

1、特异性dc疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效及治疗后血清icam-1、icam-3水【摘要】目的检测特异性dc疫苗治疗慢性乙型肝炎患者前后hbv-dna的变化，及治疗后疗效好与疗效差者血 清icam-1、icam-3的水平的变化，探讨dc疫苗疗效及其影 响因素。方法 选取慢性乙型肝炎患者37例，抽取患者 外周血，分离树突细胞行体外培养、扩增后以表面抗原致敏, 制备成特异性dc疫苗，自体回输，回输2次为1个疗程(间 隔2周)，每位患者均治疗2个疗程。检测治疗前后患者 hbv-dna的变化，检测治疗后疗效好与差者血清icam-1、 icam-3水平的变化。结果 37例慢性乙型肝炎患者经dc 疫苗治疗后，19

2、例hbv-dna载量下降2. 01ogl0,18例 hbv-dna 载量下降 &lt；2. ologlo,有效率 51.4%(x 2=25. 56, p&lt； 0.001)。血清 icam-1、icam-3 水平，在 有效与无效两组间比较差异无显著性(p&gt；o. 05)o结论 特异性dc疫苗治疗慢性乙型肝炎，可显著降低hbv-dna载 量，icam-1、icam-3可能不是影响其疗效的主要因子。【关键词】特异性dc疫苗icam树突细胞乙型肝炎abstract objective to observe the efficacyand changes of hbv-d

3、na, icam-1 and icam-3 in chronichepati-tis b patients treated with specific dc vaccine. methodsthe subjects were taken peripheral blooddendritic cells from 37 chronic hepatitis b patients, dcs were cultured and proliferated in vitro with hbsag to prepare the specific dc vaccine, and transfused twice

4、 for a course of treatment (interval 2 weeks) after two courses of treatment, changes of hbv-dna, icam-1 and icam-3 were observed. results after dc transfusion, the levels of hbvdna in 19 cases were decreased2.0 log 10. the effective rate was 51.4%(x 2=25.56, p&lt； 0.001 ) . there was no obvious

5、 differences in levels of icam-1 and icam-3 (p&gt；0. 05). conclusionspecific dc vaccine can obviouslydecrease the level of hbv-dna. perhaps icam-1 and icam-3 are not the main factors.key words specific dc vaccine； cell adhesion molecules； dendritic cells； hepatitis b自1970年至今，随着树突细胞的发现及对树突 细胞(dc)

6、的体外分离、扩增和培养技术方面的基础研究， dc用于乙型肝炎的治疗在动物、体外及临床试验中，取得了 很好的疗效13。目前已经成为临床研究的一个“热 点”，但在临床的应用中仍缺乏有力的依据，本实验通过体 外分离、培养、扩增慢性乙型肝炎患者外周血的dc,以hbsag 致敏，制成特异性dc疫苗，经皮下行自体回输，观察特异 性dc疫苗治疗前后患者hbv-dna及治疗后血清icam-1、 icam-3水平，判定dc治疗慢性乙型肝炎的疗效，通过对特 异性dc疫苗治疗后疗效好与疗效差的慢性乙型肝炎患者血 清icam-1、icam-3水平的比较，了解其是否为影响dc疫苗 疗效的主要因子。为临床dc治疗慢性乙型

7、肝炎提供理论依 据。1 材料与方法1.1 材料1. 1. 1 研究对象 选取2004年5月2007年5月 河北医科大学第一医院肝病中心门诊或住院慢性乙型肝炎 患者37例，其中男30例，女7例；年龄1863岁，平均 37 岁。所有病 hbv-dna 均&gt； 1. ox 105copies/ml。入选患 者无其他病毒合并感染及严重并发症，治疗前半年内未使用 过任何抗病毒及调节机体免疫的药物，全部获得了知情同 意。诊断标准符合2000年修订的病毒性肝炎防治方案4 及2005年慢性乙型肝炎防治指南。1. 1.2 主要试剂1. 1.2. 1 dc 疫苗制备试剂 rhgm-csf、rhil-4

8、、 rpmi1640培养液、鼠抗人cd40, cd83,购于河北博海生物 工程有限公司，hbsag购于中国预防医学科学院病毒所。1. 1. 2. 2 elisa 试剂 icam-1、icam-3 elisa 试剂 盒，国外生产国内组装，试剂号分别为eia05821 , qrct-225998eia/utlo1. 1. 2. 3 主要仪器 c02 培养箱（thermo forma, 美国），倒置显微镜（olympus,日本），可在450mm处进行计 数的全自动酶标仪（thermo,芬兰），379恒温箱（sbhw-iv, 北京），可调多道移液器及枪头（eppendorf,德国），离心 机（ld-2

9、5-2,北京）,振荡混匀器（xw-80a,上海）。1.2 实验方法 采用自身前后对照实验，在无菌条 件下抽取受试者外周静脉血20ml,肝素抗凝，在百级实验室 进行下面操作：生理盐水1： 1稀释抗凝血，层加到淋巴细 胞分离液2000r/min离心30min,分离出外周血单核细胞并 计数，用1640液选2次，再加入含有体积分数150ml/l入 ab血清的1640完全培养基重悬细胞，以2x109/l的细胞浓 度加入一次性6孔培养板中，于37°c 50ml/l c02饱和湿度 下培养4h,弃上清液，再用1640培养液轻洗2次，除去非贴 壁细胞，加入含 8335 n kat/l rhgm-gs

10、ft 8335 u kat/l rhil-4 的完全培养基，隔日换液，培养至第6天再加入终浓度为 2. 5mg/l的hbsag, 4h后加入终浓度为10 u g/l的tnf,继 续在37°c 50ml/l c02饱和湿度下培养1天，收获dc用生 理盐水洗涤2次并计数，即刻在受试者腋下部位常规消毒后 经皮下注入体内。同时取细胞洗液做无菌实验。回输2次为 1个疗程（间隔2周），每名患者均治疗2个疗程。分别检测 治疗前及治疗结束1月后患者hbv-dnao留取患者治疗结束 后的血清，冻存于-86£冰箱。用elisa法集中检测icam-1、 icam-3o1.3 统计学处理 计量资料

11、用kxd 土s表示，进行 t检验、计量资料进行x2检验，全部资料均用sas8. 1软件 处理。2 结果2. 1 dc疫苗治疗前后病毒学应答情况 37例患者 dc治疗前后hbv-dna下降三2. ologlo的19例，有效率51.4%。 见表1。表1 dc疫苗治疗前后病毒学应答情况2.2回输后血清icam-l、icam-3的水平 见表2、表3°dc治疗后有效者19例，无效者18例，对两组间icam-1、 icam-3分别进行t检验，icam-1方差齐性检验： p=0. 1372&gt；0. 1, 方 差齐。 t 检验： t=0. 33,df=31,p=0. 7421&g

12、t；0. 05,差异无显著性。icam-3 方 差齐性检验：p=0. 1223&gt；0. 1,方差齐。t检验： t=1. 49, df=31, p=0. 1475&gt ； 0. 05,差 异无显著性。表 2 dc疫苗治疗后血清icam-1水平在两组间比较 表3 dc疫 苗治疗后血清icam-3水平两组间比较3 讨论树突细胞(dendritic cells,dc)是由美国学 者steinman于1973年发现的，是目前所知的机体内功能最 强大的抗原提呈细胞57。dc是机体免疫应答的始动者, 在免疫应答的诱导中具有独特的地位。它是抗原与t细胞之 间的“桥梁”，可通过mhci类和

13、ii类分子递呈病毒肽，从 而激活cd4+t、cd8+t细胞。但在慢性乙型肝炎病人中，dc 在数量以及功能上都存在不同程度的改变，抗原提呈及分泌 细胞因子等功能受到不同程度的抑制。dc的质量及功能的改 变会导致thl/th2失衡及细胞免疫功能低下，这是引起hbv 感染慢性化发生的主要原因8。在实验通过体外分离、培 养、扩增慢性乙型肝炎患者外周血的dc,以hbsag致敏，制 成特异性dc疫苗，经皮下行自体回输，观察特异性dc疫苗 治疗前后患者hbv-dna变化，发现37例慢性乙型肝炎患者 中19例病毒载量下降2. ologlo ,有效率51.4% (x2=25. 56,p&lt；0.001

14、)。提示特异性dc疫苗可有效降低 慢性乙型肝炎患者的病毒载量，为治疗慢性乙型肝炎的有效 方法之一。粘附分子(cell adhesion molecules,cam)是 众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分 子的统称。cma以受体-配体结合的形式发挥作用，使细胞与 细胞间，细胞与基质间，或细胞-基质-细胞间发生粘附，参 与细胞的识别，细胞的活化和信号转导，细胞的增殖与分化, 细胞的伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转 移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。 根据其结构特点可分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋 白超家族、钙粘蛋白家族及一些尚未归类的粘附分子。

15、主要 功能为：(1)免疫细胞识别中的辅助受体和协同活化信号;(2)炎症过程中白细胞与血管内皮细胞粘附；(3)淋巴细 胞归巢等。icam-1及icam-3隶属于免疫球蛋白超家庭， icam-3是体内重要的协同刺激分子，介导t细胞与抗原提呈 细胞(apc)细胞之间的粘附及参与树突细胞与t细胞相互 作用，诱导t细胞早期活化、粘附和增殖，在乙型肝炎的免 疫过程中亦为重要角色。本实验显示dc治疗后血清中 icam-1. icam-3在有效与无效两组间比较差异无显著性(p&gt；o. 05)o这与部分文献描述不相符9, 10,提示 icam-1. icam-3可能不是影响dc疫苗治疗慢性乙型肝炎疗

16、 效的主要因子，或是由于观察例数较少，或由于患者个人体 质的差别等因素造成。人体免疫系统是一个复杂的网络系 统，应进一步做多因素研究，了解免疫细胞、免疫因子等诸 多因素之间的交互作用。【参考文献】4 蒲骁麟，束永前，张锦英抗原负载的树突细胞对 细胞因子诱导的杀伤细胞的影响江苏大学学报，2005, 15(1)： 6-9.5 李用国，罗云萍，兰英华，等树突细胞hbsag疫苗 抗乙型肝炎病毒免疫的体外研究中华传染病杂志，2002, 20 (6)： 333-336.6 佟立新，刘树贤，郭力红，等.自体树突细胞联合抗 病毒治疗对hbv慢性感染者的临床效应.世界华人消化杂志, 2007, 15 (11)：

17、 1232-1236.7 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案中华肝脏病杂志，2000, 8： 324-329.8 王全楚，聂青和树突状细胞.实用肝脏病杂志， 2003, 6 (3)： 151.9 罗道升树突细胞相关基础研究进展.国外医学免 疫学分册，2005, 28 (1)： 51-5510 sk md fazle akbar,norio horiike,morikazu onji. immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis b virus infection. wor1d j gastronterol,2006,12 (18) :2876-2883.11 辛永宁，宣世英，孙樱慢性乙型肝炎th1/th2细胞 的免疫功能研究进展临床肝胆病杂志，2005, 21 (3)： 1