条件治病菌之(粪)肠球菌研究观察

1、条件致病菌肠球摘要：肠球菌不像大多数的乳酸菌一样，它不被认为是“安全可靠”(gras)。对于肠球菌 的安全评价仍存有争议。虽然肠球菌被认为是“积极“或在奶酪技术屮有用，但它的隔离种 群己经作为对人类的条件致病菌出现。因此，这些细菌对发酵乳制品是否有益处于似是而非 的地位，以为它存在冇潜在的危险。本篇综述是概述了肠球菌的积极的和消极的两种特性, 并举例说明这个菌的具有争议的特性。根据食品安全评价准则，我们提出对于每个潜在的技 术应变逐个进行评估，并且建议肠球菌在发酵食晶中使用前进行个别研究。1. 简介肠球菌最初列为d群链球菌，这种分类可以追溯到由兰斯菲尔徳建立的计划。1984年, 肠球菌给予了新

2、的位置被列为肠球菌属，在经过dna-dna和dna-rna杂交的研究后证 明它与链球菌属冇较远的关系(schleifer and kilpper-balz, 1984)。到目前为止32种已被提 议列入肠球菌属(2005年10月26号)。肠球菌种适宜在6.5%氯化钠，40%胆汁盐且 ph值在9.6,并可以在60“ c的环境下生存30分钟。大多数品种也町以在10°c至45°cz 间生长(moellering,1992;flahautet al.,1996)。粪肠球菌和屎肠球菌部是人类消化道微生物 白然存在的菌种，在胃肠道屮因为个体差异其含量差异变化很大(在每克消化系统内容物屮

3、含有10211108) o肠球菌通常从食品、植物、水和土壤中分离，可能由于它的来源是粪便 使得他们的天性在恶劣环境中比较耐受(giraffa,2002)o在牛奶和奶酪制品中通常会找到粪 肠球菌、屎肠球菌和少量的坚忍肠球菌，偶然也会发现小肠肠球菌和铅黄肠球菌。不同于其 他乳酸菌，肠球菌不能被认为是“-般认为安全”(gras)，并且它在水中检测是作为粪 便污染物的指标的(godfree et al.,1997)。一般认为对于肠球菌的安全评价程序是一个模棱 两可的状况。一方血，肠球菌在作为奶酪技术屮作为发酵培养物被认为是由积极作用的 (giraffa,2003)：另一方面，它们被认为是新兴的人类病原

4、体(moellering,1992)o这篇综述主 耍是根据现有知识总结了肠球菌的积极和消极的性状，來强调这种菌屈的争议性。食品安全 准则着重强调了对抗生素耐药性和毒力的因素，这样使我们建议在发酵食品屮使用肠球菌前 应对这儿项进行研究。2. 分类和鉴定山于肠球菌的表空多样性，这使得肠球菌种的牛理测试鉴定一臣存在问题(devriese et al.,1993;park et al.,1999)。此外，物种鉴定的常规实验往往需耍很长的培养时间(facklam et al.,2002)o使用16s和23s rdna基因的基因型鉴定方法更加的准确，虽然它们还不能区 分所有肠球菌的物种(例如鹑鸡肠球菌和铅

5、黄肠球菌有99.8%的16srdna的同源性)。 这种方法已经成功的在应用：1 )rrna基因间隔区的特异pcr扩增技术(naimi et al.,1997), ddl 和 van 基因(satake et al.,1997;kariyama et al.,2000),ace 基因(duh et al.,2001),soda 基因(jackson et al.,2004), 2)转录调控基因 ef0027 的扩增(liu et al.,2005), 3) ddl 基因 (ozawa et al.,2000), cpn60 基因(goh et al.,2000)和 atpa 基因(naser e

6、t al.,2005)的测序, 和4)利用5端引物(gtg)的细菌基因组垂复序列pcr技术(svecet al.,2005)。有许多人试图区分从人分离的菌株和从食物分离的菌株，大部分主要关注的dna指纹图 谱。这些研究使用了多种分子分型方法,如扩增rdna限制性分析(ardra) (ulrich and muller,1998),脉冲场凝胶电泳(pfge)的dna宏观限制模式(deschee-maeker et al.,1997;gambarotto et al.,2001 ;vancanneyt et al.,2002),随机扩增多态性 dna (rapd) -pcr 检测(cocconce

7、lli et al.,1995;descheemaeker et al.,1997;andrighetto et al.,2001;cosentino et al.,2004;martin et al.,2005)和扩增片段长度多态性(aflp)技术 (antonishyn et al.,2000;willems et al.,2000;vancanneyt et al.,2002)。脉冲场凝胶电泳 (pfge)已成功地川于表现临床和食品株之间的差异，以及从家禽和住院患者分离的菌株 的淬异(van den braak et al.,1998;lemcke and bulte,2000)o虽然h

8、l泳是区分肠球菌属菌株的黄 金标准方法，但是它比较昂贵且耗时和比较复杂。最近，有两种方法被证明比pfge更有辨 识力，一种是基于管家基因的核芹酸序列的多位点序列分型(mlst),另有一种是基于可变 数h串联重复序列的多位变量分析(mlva) (homan et al.,2002, top et al., 2004, titze-de-almeida et al., 2004)。例如，411株屎肠球菌的种群结构(来自于不同人洲和生态位), 通过这种方法分析衣明，人多数源占医院的万古霉素抗药性肠球菌被叫做c17复合体都是 单一无性系(willems et al., 2005)。mlsa是廉肠球菌株

9、的流行病学分析的一种极好的方法, 它与mlva都能很好的替代pfgeo尽管肠球菌的分子分型方法在很大范围内都有效，并且 mlst的流行病学分析方法都是很有效的方法，但它们仍然难以明确区分食品株系和临床株 系。3. 肠球菌在乳制品中的作用奶酪屮肠球菌的使用备受争议。在南欧国家中肠球菌对于奶酪风味的影响是必要的因素 (表1),但在北欧大多数国家中对这持否定的态度。这些不同的观点可能仅仅是由于文化 差异。一些研究表明，乳品株肠球菌对于传统奶酪成熟具有积极的作用(franz et al., 1999; giraffa, 2003;foulquiemoreno et al., 2006)。肠球菌污染牛奶

10、要么是直接來自于动物粪便，要 么是间接的来自污染的水源，挤奶设备或者是散装的储存罐(giraffa, 2003)o在地中海式奶酪 凝乳中肠球菌的范围从io。到106cfu/g ,而在完全成熟的奶酪菌落数达到io：到 107cfu/g(macedo et al., 1995; bouton et a., 1998; centeno et al., 1999)o 在牛奶制甜中经常课 分离出粪肠球菌和屎肠球菌(franz et al., 1999; gelsomino et al., 2001)。坚忍肠球菌也经常在 奶制品中分离出来(suzzi et al., 2000; andrighetto e

11、t al., 2001; cosentino et al., 2004),但往往被 低估，它过去可能是一种错误的鉴别。肠球菌对于奶酪的成熟和香气的形成都有很大的帮助, 例如切达干酪、羊乳酪、water-buffalo mozarella> cebreiro> venaco 和 hispanico 都是由 于他们蛋白水解和酯水解和他们通过柠檬酸盐的新陈代谢产生的双乙酰产品(centeno et al.,1999; tsakalidou et al., 1993; centeno et al., 1999)。除了他们的工艺性能，许多的肠球菌株 (主要是粪肠球菌和屎肠球菌)生产的细菌素能

12、够抑制李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭 菌、产气荚膜梭菌和霍乱弧菌(giraffa et al., 1994; maisnier-patin et al., 1996;nunez et al.z 1997; sim on etta et al., 1997; enn ahar et al., 2001;laukova and czikkova, 2001; sara ntinopoulos et al., 2002b;leroy et al., 2003)。由于他们在奶酪成熟、风味形成和细菌素的生产的作用,表明了 这个具有理想的技术和代谢特点的肠球菌町以川做各种奶酪的发酵剂培养物(villan

13、i and coppola, 1994; giraffa, 1995; centeno et al.z 1999; sarantinopoulos et al., 2002a)« 对于肠球菌在 奶酪的消极作用可能是由于它们能够生产生物胺。在生产奶酪和发酵香肠时产生的生物胺中 一些肠球菌株被定义为有害的(gardin et al., 2001; connil et al., 2002;giraffa, 2002)。鉴于其共生的状态，肠球菌也被用來作为人或家畜的益生菌(tannock and cook,2002)。 益生菌发酵乳商业上称为gaio,这里面包含有是肠球菌菌株，在丹麦已经商业

14、化(tamime, 2002)o肠球菌sf68已被用来治疗腹泻,并可以替代抗生素的治疗(bellomoetal.,2980)。另 一种肠球菌的益生菌的使用是causidor培养，它包括嗜热链球菌和粪肠球菌两种菌株。然 而，作为-种益生菌肠球菌或作为奶酪的起始发酵的使用仍存在争议，这是因为它的耐药性 和毒力基因对人类仍有风险(franz etal., 2003)。2004年，加拿大禁止了益牛菌肠球菌的使用。4. 肠球菌和人类的健康 4.1肠球菌为条件致病菌虽然肠球菌己经使用了儿个世纪，并没有明确地把它作为剧毒的有机体。他们现在己经成为 全球院内感染的重要原因(murray and weinsto

15、ck, 1999)。在美国肠球菌是引起医院血液感染 的第三大最常见原因(wisplinghoffetal., 2004)，在欧洲排笫四。肠球菌的感染主要是粪肠球 菌和屎肠球菌引起的,其中临床菌株分别高达80%和20%(huycke et al., 1998; reynolds et al.,2004; coqueetal., 2005)o最近的研究表明，屎肠球菌感染的比例有所增加，主要是由于 表1与肠球菌冇关的奶酪产品(表中不太详尽)originproductsreferencefrancecomt6 cheesesbouton et al. (1998)saint nectaire chee

16、sesduthoit et al. (2003)italytraditional goat and buffalo cheesesandrighetto et al. (2001)artisanal fiore sardo cheesecosentino et al. (2004)traditional alps(vanoi and rolle) cheesespoznanski et al. (2004)artisanal montasio cheesesmarino et al. (2003)artisanal goat's cheese (semicotto caprino)su

17、zzi et al. (2000)waterbuftalo mozzarella cheeserillani and coppola, 1994portugalmodel curdled goat's milkpintado et al. (2001)ewes'milk and cheesesfrom four portugueseregistered designation of originareasalves et al. (2004)greecefeta cheesessarantinopoulos et al (2002b)feta cheesesmanolopoul

18、ou et al (2003)spainfive different artisanal cheesesdelgado et al. (2002);cebreiro raw cow l-milk cheesescenteno et al (1996)serra ewe's cheesesmacedo et al. (1995)sloveniatolminc cheesescanzek maj henic et al (2005)irelandcheddar cheesesgelsomino et al (2001)对抗生素有抗药性的肠球菌株越来越多(bhavnani et al., 2

19、000;jones et al., 2004; coque et al., 2005; treitmanet al., 2005)o k他的肠球菌菌种例如坚忍肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌、 棉子糖肠球菌被较少的与肠球菌感染有牵连。对于健康个体是无害的，肠球菌临床菌株主要 使重症监护病房患者及严重基础疾病的病人或免疫系统受损病人，或者是老人病院的病人致 病。肠球菌常与英他病原体的多种微生物腹内感染冇关系，因此很难确定它在感染中的作用。 但是，肠球菌是泌尿道感染，菌血症，心内膜炎和后发性白内障手术术后并发症有关，这点 己经很明确(malanietal., 2002)。在欧洲和美国肠球菌导致尿道感

20、染(utis)排名笫二(huycke et al., 1998; bouza et al.,2001a,b)。流行病学研究往往是研究患者的胃肠道定植前与肠球菌感染的关系(weinstein et al., 1996)o肠球菌易位穿过真个肠道粘膜屏障被认为会导致菌血症(wells et al., 1990; jett et al., 1994)o其他可以确认的肠球菌菌血症的来源包括静脉注射管、脓肿和尿道感染(jett et al., 1994)o肠球菌菌血症的死亡率的危险因素包括疾病的严重程度，年龄，广谱抗生素的使川, 如第三代头抱菌素或甲硝哇(soodet al., 1998)o然而，关于万古

21、霉索耐药性和高浓度庆大霉 素耐药性对于死亡率的影响的相关数据仍存有争议(huycke et al., 1991,edmond et al., 1996; caballero-granado et al., 1998; edmond et al., 1996; pelz et al.z 2002) 肠球菌菌血症可导致心 内膜炎，这对于治疗肠球菌感染血液来说是最大的挑战，并l它一直死亡率的增加有关。 在链球菌和金黄色衙萄球菌之后，肠球菌(主要是粪肠球菌)是引起心内膜炎的第三大原因, 它要对 5-20%的心内膜炎症负责(megran, 1992; mcdonaldet al., 2005)。虽然对于

22、肠球菌感染的主要危险因索仍冇争论，但对于未能采取卫生保护扭丿施，预先的 抗生素治疗，长时间的住院以及肠球菌出现在泌尿系统或血管导管屮，这是公认的导致肠球 菌感染的危险因素。虽然各个医院病房対于死广率的研究各不和同，但其平均死亡率大约是 20%到 30%(lucas et al.,1998; caballero-granado et al., 2001; lavigne et al., 2005)。肠球菌感染 是一个重要的健康问题，由于医院病原体他们必须通过延长住院治疗，并要求提供额外的治 疗，这对于医院來说有直接和重大的经济影响(wenzel and edmond,2001)o 4.2抗生素耐

23、药性粪肠球菌和屎肠球菌抗牛素耐药性的趋势得到了广泛的审查(huycke et al., 199& cetinkaya et al., 2000; bonten et al., 2001; franz et al., 2003; klare et al.,2003)。大部分是研究临 床肠球菌株和人肠球菌株，因为他们有很高的临床影响。肠球菌的硬度特性赋予它一个特性, 使它对于儿类低浓度的抗生索的能够冇异常高的固冇的耐药性，这儿类抗生索包括氨棊糖昔 类、b 内酰胺类(第三代头抱菌素类)和唾诺酮类。特別是屎肠球菌临床分离株能够耐受 高浓度的青霉素。除了其国冇的耐受性/抵抗水平，肠球菌已获得了遗

24、传因素使其能抵抗多 种类的抗牛索，特别是糖肽类抗牛索(力古霉索和替考拉宁)，以及对内酰胺类和氨基糖 甘类抗生素的协同作用(endtzetal., 1999)。特别是，万古霉素抗药性肠球菌(vre)构成 人体临床治疗感染的一个主要原因(cetinkaya et al., 2000),因为这种药物是作为最后手段 来治疗对多种抗生素具有抗药性的肠球菌(huycke et al., 1998)。万古寄素的抗药性冇的是 先天固有的(vanc),有的是后天获得的(vana, vanb, vand, vane, vang) (leclercq et al., 1989, 1992;perichon et a

25、l., 1997; fines et al，1999)。最常见的转移万古霉素耐药表型是 vana,它是一个高层次的诱导抗性和替考拉宁交互抗性相关的万古霉素，另一种表型是 vanb,它通常只对万古霉索显示诱导抗性参差不齐(cetinkaya et al., 2000)o在美国医院 抗万占霉素肠道球菌(vre)是广泛存在的。在美国vre的血液感染的发病率从1989年 得0.4%升至1999年的25.2%,随之而來的是是肠球菌株中的vre的快速增长(60%屎 肠球菌比2%的粪肠球菌)(wisplinghoff et al., 2004)0人们普遍认为,在美国vre的出现 是由于在医院使用抗生素的结果

26、(menichetti, 2005)o在欧洲各国之间vre的忠病率差异很 大，似乎在意人利和英国的最高(menichetti, 2005)。在欧洲不同的国家，來h于各种动物源 的vre的分离菌株已经收回(klare et al., 1995)。这个储藏已链接到在动物屮使用的阿伏霉 素(aarestrup, 1995;bager et al., 1997; wegener et al., 1999),并且在动物和人类之间发生 基因转移(通过食物链污染)。这种联系进一步支持了在从人类和非人类屮分离的vre菌 株中难分辨的vana基因簇屮基因型的存在，且在欧盟取缔了阿伏霉素的使用之示vre的 定植率

27、在不断下降(quednau et al., 1998; klare et al., 1999;kuhn et al., 2005; van den bogaard and stobberingh, 1999)«临床分离肠球菌菌株对丁临床利益的其他抗菌化合物的 抵抗也是一个重大的关切，特别是对抗生素有抗药性的粪肠球菌比率的增加(treitman et al., 2005) o一些研究试图去比较根据人类，动物或食物来源不同的肠球菌的耐药谱(klare and witte, 1997; drahovska et al., 2004)对抗生索冇抗药性的肠球菌是从食物中分离出来的， 只冇少数的

28、对于临床上的重要抗生素(包括冇氮茉青霉素，青霉素，庆大霉素，万古霉素) 有抗药性。至于其他抗菌化合物，其中乳制品中的抗生素耐药性菌株稍微的有点研究，往往 都是因地区的不同而又很大的变化，或是不同的分离方法。牛奶中的重要的粪肠球菌对于氯 霉素，四环素，红霉素的抗药性分别是64%, 45%和32%。耐抗生素肠球菌的频繁检出可 能与抗性基因的高效传递冇关，这种传递则依靠结合质粒和转座子的传递达成。例如，在食 物中分离的肠球菌菌株四环素抗性(tet)是最常见的抗生素耐约性的形式z-o 2004年 huys研究表明在食物肠球菌中的四环素抗性主要是由同一类型四环素基因赋予的tetm, tetl和tets,

29、这与以前在兽医学和临床分离的肠球菌菌株的发现是一样的。他们还发现四 环索抗性菌株所表现出的重要的部分是共同抵抗红霉索和氯霉索，这表明四环索抗性基因的 选择可以为进一步的多抗的选择提供一个合适的分子基础。这可能是因为四环素抗性基因与 带有多个抗生素耐药性的转座子有联系的原因。在过去儿年中，一些研究报告说，在不同共 辘模型中正在使用抗生素抗性基因转移：i)在实验室条件，在临床，共生，食品和益生菌 株之间；ii)在食物基质；iii)在无菌小鼠中。最近，mater利用宿主小鼠模型的研究显示第 一次在消化道肠球菌株植入到人的微牛物菌群屮发牛了 vana基因簇的转移。另一个严重问 题是抗病慕因转移到更致病

30、物种。noble已经证明了在小鼠皮肤模型小粪肠球菌可转移到金 黄色衙萄球菌，并且在体外转移到李斯特菌种也已经报道。最近这种转移与抗万古霉素和抗 青霉索的金黄色葡萄球菌的出现有关系。市丁这种病原菌的主要威胁，这种新的抗性类型必 须仔细的检测。作为一种潜在的抗生索耐药性基因在肠球菌和其他菌种z间交流，这种普遍存在的抗生 素耐药性提高了奶酪的生态系统问题。4 3致病因子人约有十儿个致病因索已经在各种动物模型小通过毒力分析被报道(表2) o他们附着 在猪主细胞和细胞外基质蛋a(as,esp, efaa),在对抗巨噬细胞(as,hypr),在细胞核组 织损伤中(cyl, gele,spre)和在逃避免疫

31、系统时。表2粪肠球菌毒性相关基因和其假定的功能基因编码因子假定的作用粘附素agg聚集物质附着和定植efaa (心内膜炎抗原a)粪肠球菌抗原a抗宿主防御和泄植esp (表面蛋白)肠球菌表面蛋白附着和定植ace (胶原结合蛋白)粪肠球菌胶原蛋白粘附到细胞外基质(ecm)蛋白酶gele明胶酶组织损伤spre丝氨酸蛋白酶组织损伤分泌的因素cyla-m细胞溶素/血溶索组织损伤gls24葡萄糖饥饿诱导蛋白在宿主的持久性胞外多糖cpsa-k荚膜多糖抗宿主防御epa荚膜多糖nd*转录调节bcylr1-r2二肽系统纽件cyla-m的管理fsra-c地带样的监管制度gele和spre的管理eta rsompr类2

32、组分体系ndhypr过氧化氢稳压器抗宿主防御perr过氧化调节nda未确定的b作为调节器，他们可能会有多效性这些致病因素被编码通过接合质粒基因(as和cyl)或染色体区域重新排列。i) fsr位点 (gele, spre和fsr), ii)被描述为致病岛大的染色体区域(esp, cyl, as和gls24-like iii) cps位点。质粒编码的毒力因素被证明是通过基因转移机制而具有的传染性(chow et al., 1993;wirth, 1994)。最近，从粪肠球菌v583的基因纽序列和在应变mmh594屮的致病岛屮 鉴别出一组与粪肠球菌毒力有关的基因(shankar et al., 2

33、002; paulsen et al.,2003)。他们假 定的粘附素和侵袭素、胞外酶、蛋白酶和表面细胞外的蛋白质。在这个具有多重抗生素耐药 性的临床菌株的基因组中很大一部分转座因子可以通过同水平转移的基因组进化來影响它 的高容量。数据集由多种将会提供新的研究粪肠球菌毒性因子和隔离组间基因组多变性的方 法的基因序列和组成，而这一方法将会是全球通用。至于屎肠球菌，只有两个假定的致病基 因己被确定，它们编码肠球菌表而蛋口(espefm)和一个假泄的透明质酸酶(hyl) (willems et al.,2001; rice et al., 2003)。然而，屎肠球菌基因组( 可能显示了额外的假定的如

34、一些种特片性的致病因子，迄今为止，在屎肠球菌基因组草案中 已检测到不超过40%的粪肠球菌蛋ll|(p. scrror, personal communication)0据我们所知，还没有 在其他肠球菌种中发现毒力因子。人们已经对山不同资源分离出來的粪肠球菌之间的的毒力 因子的分布做了大虽的研究，分离资源包括临床，共生体，食品和环境。根据早期的综述 (gilmore et al., 2002; tendolkar et al., 2003),各种研究之间的毒力因子发生率的多变性,经常 导致才盾的结论。例如肠球菌聚合物质，有文献报道(huycke and gilmore, 1995; archim

35、baud et al., 2002)其相似地分布于粪便和临床分离中，但是另有文献(coque et al., 1995;waar et al., 2002)i|j认为其在临床分离屮更频繁。虽然粪肠球菌和屎肠球菌假定的致病因素在临床菌株 中发生率较高，但是它们也被发现在食品相关菌株中(eaton and gasson, 2001;franz et al., 2001; mannu et al., 2003; semedo et al., 2003; creti et al., 2004; lepage et al., 2006)。在乳制品 和临床的坚忍肠球菌和小肠肠球菌分离的esp,as和gele编码基因的检测结果都衣明在肠球菌 种属里，我们所己知的粪肠球菌毒力是决定因索且是普遍存在的(semedoetai., 2003) 0到目 前为止，上述致病因素都没有被发现在临床菌株屮普遍存在，因此尽管这些因素可能并不是 粪肠球菌致病性必不可少的，但是它们任然可能影响疾病的严重程度，同样建议对致病突变 体进行动物模型研究(d