第六节 支原体药敏

1、第六节 支原体支原体是一类目前所知能在无生命培养基中独立生活，自行繁殖的最小微生物。支原体感染的范围非常广泛，包括人，动物，植物，昆虫及组织培养的细胞。人体可分离出十几种支原体，其中一些对人有致病性如：肺炎支原体、人型支原体、解脲支原体、生殖支原体、及发酵支原体等。 能引起生殖泌尿系感染的支原体主要有两种，即解脲支原体和人型支原体。肺炎支原体主要引起呼吸道的感染。支原体的体外药敏试验最早是在上世纪60年代提出。在过去的40多年中，很多研究采用肉汤稀释法和琼脂为基础的方法报道了支原体的抗菌活性，但一直没有一个公认的、标准的参考方法。在过去的几年，有关支原体体外药敏试验方法学的研究也有一些报道，但

2、仍存在着一些不足。直至2011年CLSI M43指南出现，规范了支原体体外药敏实验的方法（微量肉汤法和琼脂稀释法）、明确了质控菌株及对不同抗生素的MIC范围、建立了临床用于支原体治疗药物的折点。因支原体培养时间较长，临床治疗支原体感染很难依靠培养及药敏的结果，基本上采用经验抗菌药物的治疗，因此支原体体外药敏试验对于临床分离株的耐药性监测以及新药的研发更具意义。一、 药敏的适应征1. 临床分离的支原体通常不需要进行药敏试验，可经验性使用抗菌药物治疗。2. 当临床经验性抗菌药物治疗效果不好时，而可用于支原体感染治疗的药物又非常的有限，需要进行支原体的体外药敏试验。目前，已知可能的耐药包括：1）人型

3、支原体、脲原体的某些种对四环素类药物的耐药。2）人型支原体、脲原体的某些种对氟喹诺酮类药物的耐药。3）肺炎支原体、脲原体某些种对大环内酯类药物的耐药。4）人型支原体对克林霉素耐药。这时就要考虑可用于治疗的药物中那些还可以用于耐药菌株的治疗。3. 从无菌体液或生殖道以外的部位中分离的人型支原体、脲原体应做药敏，尽管人型支原体、脲原体的某些种常常是泌尿生殖道的致病菌。特别是从有播散性感染的患者如：新生儿或免疫低下患者的无菌部位分离的人型支原体、脲原体应进行体外药敏试验。 二、方法学（一）肉汤稀释法1. 微量肉汤稀释法1）方法在无菌的96孔板上，加入一定量的液体培养基（含有酚红指示剂），将测试的抗生

4、素倍比稀释。加入终浓度为104105CFU/ml新鲜培养物到不同抗生素浓度孔中。另外设立3个对照孔：阴性对照（只加培养基）；药物对照（肉汤 + 含抗生素肉汤）；阳性对照（肉汤 + 培养物）。 加样完毕，在每孔里面滴加3到5滴无菌液体石蜡，防止长时间培养液体挥发影响实验结果准确性。盖上板盖，在适宜的温度和气体环境中培养，阳性对照孔正常生长后读取MIC。2）观察结果一般情况下脲原体16-18小时就会产生颜色的变化，因此24小时内应多次观察颜色的变化。人型支原体48-72小时会产生颜色的变化，而肺炎支原体需要4-6天或更长的时间产生颜色的变化。 经常观察结果对检测结果的准确性是非常重要的，特别是生长

5、速度较快的脲原体，因为他们生长快速，MIC终点会随时间变化。2. 支原体的浓度测定支原体的MIC测定需要恰当的培养浓度，以免支原体代谢产物的积累对MIC准确性的影响。处于对数生长期的支原体细胞做药敏最合适，一般最大生长时每毫升能存活支原体数目一般在108左右，支原体的细胞数目液相以颜色改变单位或固相以菌落形成单位来表示，在做MIC之前应该对培养物进行浓度测定。（二）琼脂稀释法1. 琼脂及肉汤培养基1）人型支原体：支原体琼脂和肉汤2）脲原体：A8琼脂和10B肉汤3）肺炎支原体：SP4琼脂和肉汤2. 方法采用合适的培养基调节储存的支原体菌液及质控菌液至104105CFU/mL，然后将菌液1：10、

6、1：100、1：1000稀释成 3个浓度，直接点种在含不同浓度抗菌药物的相应的培养皿，接种菌量为110l/点。 室温放置使接种点干燥，但不要超过30分钟，然后37，5% CO2的环境中孵育。一定的湿度环境有利于支原体的生长及防止培养皿干燥。3. 观察结果：脲原体孵育24h-48h，人型支原体孵育48h-72h， 肺炎支原体孵育4d-6d或更长。（三）方法学比较1. 琼脂稀释法：因其稳定的终点观察时间曾被认为是支原体药敏试验的参考方法，但这个方法不适用于小批量样本或临床单个分离的菌株。 2. 琼脂扩散法：因为没有建立起抑菌圈与MIC的相关性，不适用于支原体药敏。而且支原体的生长速度较慢，这个方法

7、今后也将会有很多局限性。3. 微量肉汤法：是目前广为使用的方法，缺点是比较费力，终点会随着时间而变化。4. 琼脂梯度扩散法：操作简单、终点不随时间变化，更适用于临床分离的单个菌株的药敏试验。5. 商品化MIC试剂盒：目前，欧洲有一些商品化的试剂盒用于支原体的MIC测定，成分主要是含有干燥抗生素（一般有两个浓度）的微孔板，这些试剂盒的结果与传统MIC方法的结果一致，但临床应用很有限。6. 耐药基因检测：肺炎支原体的培养常常需要几天的时间，获得药敏结果再需要几天，从临床治疗角度来看体外药敏试验对指导患者治疗的意义不大。目前，肺炎支原体对于大环内酯类抗生素的耐药比率在不断的增加，临床需要快速准确的药

8、敏结果，因此以分子技术为基础的药物耐药基因的检测方法建立起来，可以从临床标本中直接鉴定肺炎支原体并检测有无耐药基因 （目前， 肺炎支原体对大环内酯类耐药的机制是rRNA的点突变，还没有其他获得性的耐药机制的报道）。三、 质量控制1. 质控菌株人型支原体：ATCC 23114；肺炎支原体：ATCC 29342； 解脲支原体：ATCC 331752. 人型支原体、肺炎支原体和解脲支原体的质控范围（MIC，g/mL）：微量肉汤法抗生素人型支原体ATCC 23114肺炎支原体ATCC 29342解脲支原体ATCC 33175阿奇霉素-0.06-克林霉素0.030.25-红霉素-0.0040.0318加

9、替沙星0.0150.12-左氧氟沙星-0.1210.50.2莫西沙星0.0150.120.030.250.50.2泰利霉素-0.121四环素-0.060.5-3. 人型支原体、肺炎支原体和解脲支原体的质控范围（MIC，g/mL）：琼脂稀释法抗生素人型支原体ATCC 23114肺炎支原体ATCC 29342解脲支原体ATCC 33175阿奇霉素-克林霉素0.060.5-红霉素-加替沙星0.060.250.030.25-左氧氟沙星0.1210.120.50.54莫西沙星0.060.250.030.250.252泰利霉素-0.121四环素0.1210.060.58四、 药物选择和判断标准1. 肺炎支

10、原体药敏试验解释标准（MIC，g/mL）抗生素种类抗生素MIC（g/mL）解释标准评语敏感中介耐药喹诺酮类左氧氟沙星 1-莫西沙星 0.5-四环素类四环素 2-对四环素敏感同样对多西环素敏感大环内酯类红霉素 0.5- 1大环内酯类耐药的菌株通常MIC 16g/mL阿奇霉素 0.5- 12. 人型支原体药敏试验解释标准（MIC，g/mL）抗生素种类抗生素MIC（g/mL）解释标准评语敏感中介耐药喹诺酮类左氧氟沙星 1- 2莫西沙星 0.25- 0.5四环素类四环素 4- 8对四环素敏感同样对多西环素敏感林可霉素克林霉素 0.25- 0.5大环内酯类耐药的菌株通常MIC 16g/mL3. 解脲支原

11、体药敏试验解释标准（MIC，g/mL）抗生素种类抗生素MIC（g/mL）解释标准评语敏感中介耐药喹诺酮类左氧氟沙星 2- 4莫西沙星 2- 4四环素类四环素 1- 2对四环素敏感同样对多西环素敏感大环内酯类红霉素 8- 16对红霉素敏感同样对阿奇霉素敏感酮内酯类泰利霉素 4-五、 结果报告和解释1. 质控结果失控时的结果报告：任何的失控如：生长失控、培养基失控、药物失控、试剂失控及质控菌株不在控制范围时，应重复患者及质控菌株的药敏试验。直至质控在可接受的范围方可发出报告。2. 质控结果在控制范围时的结果报告：仅凭可接受的质控结果不能完全保证患者结果的准确性，因此报告结果之前全面验证患者分离株的

12、所有药物的检测结果是非常重要的。验证的内容包括：患者分离株测试的所有的抗生素药敏结果与鉴定结果的一致性；患者分离株对某种抗生素敏感时是否有耐药的报道等。3. 出现不寻常的药敏结果时：1） 检查患者以前的药敏结果是否有相同的不寻常耐药的表型2） 检查以前的质量控制结果是否有相似趋势3） 检查试验材料、过程及仪器设备是否有异常 如果没有发现与不寻常耐药表型相关的原因，则应重复药敏试验或重新鉴定菌株。实验室应有相应的措施，验证不寻常的或不一致的药敏结果，并强调这些结果可能对临床治疗带来的巨大影响。六、 耐药机制1. 临床治疗支原体及脲原体的药物非常有限，常用的药物包括：大环内酯类、林可酰胺类、链阳霉

13、素类和氟喹诺酮类。支原体最突出的特点就是没有细胞壁，因此支原体对作用于细胞壁生物合成的抗生素如：-内酰胺类、万古霉素等天然耐药，对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。对干扰蛋白质合成的药物，如红霉素、卡那霉素、四环素、链霉素等敏感。2. 肺炎支原体1）对肺炎支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内脂类及一些氟喹诺酮类抗生素；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对肺炎支原体有较小的抑制作用，故不常用来作为治疗支原体感染的药物。新大环内酯类如阿奇霉素和克拉霉素以及酮内酯类（泰利霉素），比红霉素的体外活性好。2） 目前，呼吸道感染的肺炎支原体对大环内酯类耐药的报道多来自日本（耐

14、药率40%）、中国（71.1%）、法国（低于10%）及美国（8.3%），中国的耐药率最高。肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药机制主要是核糖体23S rRNA V区中心环核苷酸序列点突变，从而导致抗生素与核糖体亲和力下降引起耐药， A2063G和A2064G基因点突变是最常报道的突变位点，A2063C等突变也有报道。不同的核苷酸点突变所引起的大环内酯类耐药水平也有不同， A2063G所引起的耐药主要是针对14环和15环大环内酯类,而A2064G的点突变可引起16环大环内酯类的高水平耐药。Real time PCR检测方法,可检出肺炎支原体并鉴别大环内酯类耐药突变株。3. 人型支原体和脲原体1）人型

15、支原体和脲原体对四环素的耐药早在上世纪80年代中期就有报道， 对四环素的耐药机制是由tet（M）介导，其编码的蛋白可以结合核糖体引起耐药。tet（M）基因是目前已知的唯一介导人型支原体和脲原体耐四环素的基因，获得tet（M）基因的转痤子可整合到支原体染色体DNA上, 从而使支原体产生四环素抗药性。2）不同地域及抗生素应用的不同，支原体对四环素耐药的比例也不同，在美国的某些地区的耐药率为40%-50%。3）支原体的种类不同对大环内酯类及林可酰胺类的耐药也不同，人型支原体对红霉素及其他14-环和15-环的大环内酯类天然耐药，但对林可酰胺类如：克林霉素敏感。脲原体正好相反。4. 微小脲原体对高水平的大环内酯类耐药的机制是由于支原体核糖体蛋白插入或缺失氨基酸或23SrRNA的点突变造成，这类耐药虽有报道但很少见。类似的例子还有克林霉素对人支原体耐药。5. 氟喹诺酮类耐药的机制：DNA 螺旋酶和拓扑异构酶IV 是氟喹诺酮类药物作用的两个靶位,其分别由GyrA、GyrB 和ParC、ParE 两组基因编码。这两组