微生物检测方法

1、-1992 、fda 细菌分析手册需氧菌平板计数，或 15300 个（如iso 4833 : 1991 微生物学大肠杆菌菌落计数通用指南最大可能数技术）等。菌落计数前先观测菌落生长的情况，一般同一稀释度的平板上的菌落数应相近，不同稀释度平板上的菌落数则应与稀释倍数成反比。蔓延菌落的生长会抑制其他菌株的生长，或者会覆盖其他的小菌落， 所以最好不要选择有蔓延菌落生长的平板作为计数平板，但如必须选择， 应在记录中标记清楚。 如片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2 以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若只有一条链可视为一个菌落，如果

2、有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。当每个稀释度制备了两块平板时，用所选择的平板的算术平均值来计算原始样品中的微生物的含量。样品的菌落数等于每克或每毫升的cfu 值除以稀释度。报告方式：空白对照实验：2.2 大肠菌群大肠菌群或称总大肠菌群是指一群能在37条件下发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。符合这些条件的肠杆菌科细菌主要包括4 个菌属：埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠杆菌；其次有柠檬酸杆菌属，其代表种有弗劳地枸橼酸杆菌；克雷伯氏菌属，代表种为肺炎克雷伯氏菌；肠杆菌属，代表种有阴沟杆菌和产气杆菌。大肠菌群卫生学意义：大肠菌群主要来源

3、于人、畜粪便。 大肠菌群是反映食品中是否存在粪便污染的指示菌，食品中有粪便污染， 则可推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，同时也反映出被测食品对人体健康存在危害。大肠菌群检测已被广泛应用于食品卫生工作中。检验的标准通常使用gb/t 4789.3-2003、sn 0168-92 检验中需了解和注意事项：1. 挑选菌落在实际工作中， 为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在 gb/t 4789.3-2003检验方法中规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上， 大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率为最高；红色、粉色菌落检出率较低。2.

4、发酵管的产气量在日常工作中，有时在发酵倒管内有极微小的气泡（有时比小米粒还小），有时可遇到在初发酵时产酸未产气，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。这种情况大肠菌群的阳性检出率能达到30%-50% 。所以不能忽视产气量少的，对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。3. 抑菌剂大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂可抑制样品中的些杂菌，特别是g+ 的生长，而有利于大肠菌群的生长和挑选。gb/t 4789.3-2003中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，sn 0168-92中

5、 lst 肉汤利用十二烷基硫酸钠（月桂基）作为抑菌剂，bglb 肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。2.3 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、土壤、水、饲料、食品、灰尘及人和动物的排泄物中都可以存在。因此， 食品受污染的机会很多，是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒已成为世界性的卫生问题。一 . 生物学特性：1. g+ 、需氧或兼性厌氧，通常在肉浸液肉汤及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。2. 耐盐性强。 10%-15% 的氯化钠培养基中能生长。3. 在血琼脂上，几乎所有的葡萄球菌可产生 、 、和 溶血素（一种或一种以上）。多数

6、致病菌株可产生透明溶血环，菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。4. 葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，耐干燥可达数月，加热 80 30min 才被杀死。5石炭酸，0.1% 升汞10 15 min 死亡。l : 100000 200000 龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺增效剂、青霉素、红霉素等较敏感，但耐药菌株逐年增多。葡萄球菌肠毒素具有耐热性，加热100 30min 不被破坏 . 要使其完全破坏需煮沸2h，这是葡萄球菌肠毒素的特点二 . 毒素和酶金黄色葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素和酶的能力。致病性菌株产生的毒素和酶主要有下列几种：1血浆凝固酶：此

7、酶由金黄色葡萄球菌产生，能使含抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要标志。2溶血毒素：多数致病性菌株均能产生，包括 、 、和溶血素，对人致病主要是 -溶血素。3杀白细胞素：能破坏人和家兔的中性粒细胞，抵抗吞噬细胞的吞噬。4. 肠毒素：分a 、b 、c 、d 、e 和 f 六个型别。耐热，100 30min 不被破坏。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒以a 型为多见，其次是b 、 c 型。5剥脱毒素：由噬菌体l 群中某些金黄色葡萄球菌菌株产生。对新生儿和免疫功能低下的成年人，可引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合征。三 . 检验方法及鉴定金黄色葡萄球菌检验方法主要有gb/t4789

8、.10-2003食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验和sn0172-1992出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法。3 操作步骤3. 1 增菌培养法3. 1.1.! 检样处理 :按无菌操作取检样25 g(ml) ，加入 225 ml灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。3. 1.2 增菌及分离培养:吸取 5 ml 上述混悬液，接种于7.5% 氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 ml 培养基内， 36士 1培养 24 h, 转种血平板和baird-parker平板，36士 1培养 24 h ，挑取血平板上金黄色(有时为白色 )菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。3.1.3 形态 : 本菌

9、为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5m -1m3. l. 4 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪脉大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在bird-parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2 mm- 3 mm ,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。3.

10、1.5 血浆凝固酶试验:吸取 1，4 新鲜兔血浆0. 5 ml ，放入小试管中，再加人培养24 h 的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物o. 5 ml. ，振荡摇匀，置36 士 1温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6 h, 如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。3.2 直接计数方法3.2.1 吸取上述1：10 混悬液，进行10 倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度稀释液 1 ml ，分别加入三块baird-parker平板，每个平板接种量分别为0. 3 ml,0. 3 mi.,0.4 ml，然后用灭菌l 棒涂布整个平板。

11、如水分多不易吸收，可将平板放在36 士 10c 1 h ，等水分蒸发后反转平皿置36士 1培养。3.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，36士 1 0c 24 h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。3.2.3 菌落计数 :将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。四鉴定试验（ 1）血浆凝固酶试验：本试验是鉴定金黄色葡萄球菌致病性的重要试验血浆凝固酶通常以兔血浆为最好，避免使用柠檬酸抗凝的血浆，以 edta 抗凝兔血浆为最好。取肉汤培养物0.3

12、ml 同 0.5 ml凝固酶试验免血浆于8 mm x 100 mm试管内充分混合，置36 士 1培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h 。以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。sn0172-1992中明确规定对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验如耐热核酸酶试验等加以证实。( 2 ）触酶试验：挑取菌落置于清洁玻片上，滴加3%h2o2 1 2 滴，1min 产生大量气泡为阳性。( 3 ）甘露醇发酵试验：多数致病性葡萄球菌菌株发酵甘露醇。( 4 ）耐热核酸酶试验：方法在 sn0172-1992中附录 c。( 5 ) spa 的检测：sp

13、a 能与免抗羊红细胞血清中的igg 的 fc 段结合，使致敏羊红细胞发生凝集，a 蛋白的存在是金黄色葡萄球菌的特征。( 6 ）新生霉素敏感试验：每片含5g ，抑菌环16mm 者为敏感， 16mm 者为耐药。五肠毒素的测定方法在 gb/t4789.10-2003中。当食品中检出金黄色葡萄球菌时，表明食品加工处理卫生条件较差，并不一定说明该食品导致了食物中毒。 但当食品中未分离出金黄色葡萄球菌时，也不能证明食品中不存在葡萄球菌肠毒素。2.4 沙门氏菌沙门菌属分类属肠杆菌科，是肠杆菌科中最复杂的菌属，是一种重要的肠道致病菌，可从人和世界各地所有动物中分离得到，其致病性具有种系特异性，例如人是伤寒、副

14、伤寒a 、b 、c 沙门菌的天然宿主。有些专对动物致病，也有些对人和动物都能致病。沙门菌可致多种感染。1 生物学性状形态染色革兰阴性直杆菌，较细长，多具有周鞭毛，能运动，有时会出现无鞭毛的突变型。无芽胞，无荚膜。1.1 培养特性兼性厌氧，最适生长温度35 一 37，最适生长ph 6.8 一 7.8, 本菌属对营养的要求不高，在普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落，有时出现粗糙型的菌落。有些能产生硫化氢的菌株，在ss 琼脂上形成中心黑色的菌落。在亚硫酸铋琼脂上，不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落，在亚硫酸铋琼脂上，不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落：深黑色菌落，

15、 大小为 2mm ，扁平的菌落， 并有向周围扩散的灰褐色晕环，如伤寒沙门氏菌往往形成这样的菌落；灰黑色至灰褐色的菌落，大小为2mm 3mm ，圆形、光滑、湿润、突起，周围有向外扩散的灰褐色晕环，多数沙门氏菌属于此类型；浅灰色菌落，一般较大，直径为2mm 4mm ，突起黏液状，有向周围扩散或无扩散的灰色晕环。在 he 琼脂上，沙门氏菌培养24h 后，可形成两种不同的菌落。一类菌落大小为2mm 3mm ，绿色至蓝绿色，中央有黑色沉淀物。另一类菌落大小为2mm ，绿色至蓝绿色，无黑心。亚利桑那沙门氏菌，因为发酵乳糖，可形成橙黄色，带有黑心的菌落，直径为2mm 。在 xld 琼脂（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼

16、脂）上，沙门氏菌培养24h 后，大多数沙门氏菌形成浅粉色，大小为2mm ，光滑、湿润、边缘整齐。而发酵乳糖的亚利桑那沙门氏菌形成带有黑心的黄色菌落。在 dhl- 琼脂（胆硫乳琼脂）上，沙门氏菌培养24h 后，产生硫化氢的沙门氏菌可形成带有黑心的菌落大小为2mm 3mm ，圆形、突起、湿润、边缘整齐。不产生硫化氢的沙门氏菌，菌落中心无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌，因发酵乳糖和产生硫化氢，形成红色带黑心的菌落。1.2 生化反应不发酵乳糖、蔗糖，对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵，除伤寒沙门氏菌不产气外，其它沙门氏菌均产酸产气。tsi 上典型的沙门氏菌培养物显示斜面碱性（红色）或不变色和底部酸性（黄色），

17、伴随着产气和（约90% 情况下）硫化氢产生（k/a + + ）；当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时，tsi 的斜面是黄色的。因此，沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据tsi 琼脂实验的结果，还要再接种尿素琼脂或赖氨酸脱羧酶培养基。尿素琼脂如果反应为阳性，尿素分解释放氨，其颜色由粉红变成玫瑰红，最后变成深樱红色。赖氨酸脱羧酶培养基阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。对初步反应可疑为沙门氏菌属的tsi 培养物进行生化试验。生化结果符合沙门氏菌属特性的进行血清学试验。2.血清学特性2.1 抗原构造本菌属的抗原结构主要有3 种，即菌体（o ）抗原、鞭毛（h ）抗原及表面抗原（vi 抗原等）。根据o 抗原、 h

18、 抗原双相抗原及vi 抗原的不同，可将沙门氏菌分为近 3000 种血清型。( l ) o 抗原： 为多糖一类脂蛋白质复合物，具耐热性， 能耐受100 2.5 h 。o 抗原共有58 种，以阿拉伯数字顺序排列，现已排至第67 （其中有9 种被删除）。每个沙门菌的血清型可含一种或多种o 抗原。 凡含共同抗原成分的血清型归为个群，每个群以0 加上阿拉伯数字及括号中大写的26 个英文字母（a z）顺序编排，则可将沙门氏菌属分成az 、051 063 、o65 o67 42 个群，引起人类疾病的沙门氏菌大多数在ae 群。 0 抗原是分群的依据。其刺激机体产生的抗体以ig m 为主 ,与相应的抗血清反应时

19、呈颗粒状凝集。( 2 ) h 抗原为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙醇处理均被破坏。有两个相，第一相特异性较高称特异相，用小写英文字母a 、 b 、c 表示，沙门菌h 抗原直至z , z 以后z 加阿拉伯数字表示，如 21 、 22 、 23 265 。第二相抗原为沙门菌所共有，称非特异，直接用1、2、3 表示。同时有第一相和第二相h 抗原的细菌称双相菌，仅有一相者用相称单相菌。h 抗原是定型的依据。其刺激机体产生的抗体以igg 为主，与相应的抗血清呈絮状反应。( 3 ）表面抗原：在沙门菌属中已被证实的表面抗原有vi 抗原、m 抗原和s 抗原三种：l ) vi 抗原：是一种不耐热的酸性多糖聚合物

20、，加热6030 分钟或经石炭酸处理即被破坏，经人工培养基传代后也易丧失。新分离的伤寒及副伤寒丙沙门菌常带有此抗原。vi 抗原位于菌体的最表层，有抗吞噬及保护细菌免受相应抗体和补体的溶菌作用。vi 抗原存在时可阻止0 抗原与相应抗体发生凝集，故在沙门菌血清学鉴定时应加以注意，需事先加热破坏vi 抗原之后，o 抗原才得以与相应的o 抗血清发生凝集。带vi 抗原的沙门菌亦可用vi 噬菌体进行分型，有助于流行病学调查和追踪传染源。2 ) m 抗原：又称粘液抗原。多种沙门菌均可产生m 抗原。m 抗原有免疫原性，但各菌种之间无特异性，不能用于血清学分型。m 抗原存在时亦可阻止o 抗原与相应抗体发生凝集，同

21、样可用加热的方法加以破坏。3 ) s 抗原：过去认为s 抗原是一种o 抗原，与o 抗原的区别是s 抗原可被lmol / l 的盐酸所破坏，故与o 抗原不同，仍属表面抗原。2.2 抗原变异沙门菌属在一定条件下可发生变异，主要表现为：( 1 ) s 一 r 变异：自临床标本初次分离的菌株一般都是光滑型，经人工培养、 传代后可逐渐变成粗糙型菌落。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，在生理盐水中可出现自凝。（ 2） h-o 变异：是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异。( 3 ）位相变异：具有双相h 抗原的沙门菌变成只有其中某一相h 抗原的单相菌，称位相变异在沙门菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别是只有第相（非

22、特异相）抗原时，需反复分离和诱导出第相（特异相）抗原方可作出鉴定。( 4 ) v-w变异：是指沙门菌失去vi 抗原的变异。初次分离得到的具有vi 抗原、 o 不凝集的沙门菌称v 型菌；vi 抗原部分丧失，既可与o 抗血清发生凝集又可与vi 抗血清凝集者称vw 型菌； vi 抗原完全丧失， 与 0 抗血清发生凝集而与vi 抗血清不凝集者称w 型菌。 v-w 变异的过程是v 型菌经人工培养，逐渐丧失部分vi 抗原而成为vw 型菌，进而丧失全部vi抗原而成为w 型菌。3检验方法：按照gb/t4789.4-2003 sn0170-1992进行检验。2.5 大肠埃希氏菌大肠杆菌是肠道的正常菌群。在一定条

23、件下可引起肠道外感染，一部分血清型的大肠杆菌致病性强， 引起腹泻， 与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻大肠杆菌。包括肠产毒素性大肠杆菌（etec ）、肠致病性大肠杆菌（epec ）、肠出血性大肠杆菌（ehec ）、肠侵袭性大肠杆菌（eiec ）、肠集聚性粘附大肠杆菌（eaggec ）。肠出血性大肠杆菌（ehec ）引起散发或暴发性出血性结肠炎，主要血清型是o157:h7 ，ehec o157:h7的一个显著性特征是产生志贺样毒素（ vero toxin,vt），是 ehec 的主要致病因子。ehec o157:h7不发酵或迟缓发酵山梨醇。在山梨醇麦康凯琼脂平板上菌落呈无色半透明。绝大多数o15

24、7:h7 大肠杆菌不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基伞形酮 - -d 葡萄糖醛酸苷（mug ），不能产生荧光。肠产毒素性大肠杆菌（etec ）能产生不耐热肠毒素（lt ）和耐热肠毒素（ st）。卫生学意义：检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染，卫生学上被用于饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；由于大肠杆菌在外界存活时间与一些肠道致病菌相近，它的检出也可能预示着某些肠道致病菌（沙门菌、志贺氏菌）的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。251 形态与结构革兰阴性直短杆状，多数有鞭毛，能运动，某些菌株尤其是引起肠外感染的菌株有荚膜（微荚膜）和周身菌毛。252 培养和生化反应兼性厌

25、氧，营养要求不高，在普通营养琼脂上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落,在血琼脂上某些菌株可产生 -溶血，在肠道选择培养基上可发酵乳糖，形成有色菌落。大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖等多种糖类产酸产气，典型的大肠杆菌的吲哚、甲基红、 v -p 、枸椽酸盐（ i mvic ）的生化试验结果为+ + - - ，在三糖铁琼脂（tsi ）上斜面和底层均产酸、产气，h2 s 阴性（a/a + - ），不分解尿素。大肠杆菌一般不产生硫化氢，但近来发现产硫化氢的菌株，应引起注意。大肠杆菌的血清学反应，往往是对经分离、鉴定、确证为大肠杆菌的进一步分型。根据 o 抗原、 h 抗原及 k 抗原的不同进行大

26、肠杆菌血清学分型。表示大肠杆菌血清型的方式按 o；k；h 排列。检验方法： gb/t4789.6-2003；sn0169-92 。志贺菌属志贺菌属与沙门菌属一样，是主要的肠道病原菌之一，是引起人类细菌性痢疾的病原体。在伯杰手册（1984 ）中将志贺菌属分为4 个血清群（种）: a 群为痢疾志贺菌, b 群为福氏志贺菌 , c 群为鲍氏志贺菌, d 群为宋内志贺菌）而沿用至今。生物学性状1 形态结构和染色革兰阴性杆菌，菌体短小，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。2.培养和生化反应发酵葡萄糖产酸不产气，大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。不分解尿素，不产生h2s 。tsi ：(k/a - -)

27、2. 检验方法 : 按照 gb/t4789.5-2003标准检验。三 .生物安全基本知识3.1 生物安全柜的使用（ 1）生物安全柜必须在运行正常时才能使用。（ 2） 生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。（ 3） 生物安全柜内应尽量少放置器材或样品，不能影响后部压力排风系统的气流循环。（ 4） 生物安全柜内不能使用酒精灯，否则燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环。（ 5） 所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。（ 6） 尽量减少操作者身后的人员流动。（ 7） 操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。（ 8） 不

28、要使实验记录本、移液管以及其他物品阻挡空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。（ 9） 工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。(10) 在生物安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行15min 。(11) 在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。3.2 移液管和移液辅助器的使用1、应使用移液辅助器，严禁用口吸取。2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。4、感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。5、不能将液体从移液管内用力吹出。6、刻度对应（ mark-to-mark）移液管不需要排出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。8、盛放废弃移液管的容器不能放在外面，应当放在生物安全柜内。9、有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。10、在打开隔膜封口的瓶子时，应使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射针头和注射器。11、为了避免感染性物质从移液管中滴出