第七章1固定化细胞和酶1

1、第七章第七章 固定化细胞和酶固定化细胞和酶immobilized cells and enzymes 酶催化剂的优点：酶催化剂的优点： 专一性强，专一性强， 反应条件温和，反应条件温和， 反应速度较快。反应速度较快。 弱点：弱点： 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难； 溶液酶稳定性差，易失活。溶液酶稳定性差，易失活。 19691969出现了固定化酶技术。出现了固定化酶技术。 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制 或固定于某一或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。局部的空间或者固定于载体上。固定化酶生

2、物反应器固定化酶生物反应器 实际应用中，固定实际应用中，固定化酶可以装在反应化酶可以装在反应器中，连续生产有器中，连续生产有利于生产的自动化，利于生产的自动化，提高生产率。提高生产率。 鉴于此，鉴于此，70年代以年代以来，该技术受到各来，该技术受到各国学者的瞩目，纷国学者的瞩目，纷纷开展固定化酶的纷开展固定化酶的研究研究。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和固定化方法及固定化后酶和细胞的性质细胞的性质 一、一、 固定化的原则和方法固定化的原则和方法 由于酶催化作用依靠它的由于酶催化作用依靠它的高级结构高级结构及及活性中心活性中心。 固定化时，活性中心的固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应

3、必需基团避免参加反应； 避免避免高温、强碱、有机溶剂高温、强碱、有机溶剂以及以及高浓度盐高浓度盐的处理，的处理，保护保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的白质的高级结构高级结构。尽可能在。尽可能在温和条件温和条件下进行固定下进行固定化反应。化反应。 固定化方法固定化方法： 载体结合法载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶：将酶（细胞）固定在不溶性载体上。靠共价结合、离子结合、和性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。物理吸附。常用的载体常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。等多糖衍生物颗粒或多孔玻

4、璃等。载体结合法载体结合法交联法交联法包埋法包埋法8.18.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质 交联法交联法：使酶与具有两个以上官能：使酶与具有两个以上官能团的试剂（戊二醛）进行反应，应团的试剂（戊二醛）进行反应，应用化学键把酶固定用化学键把酶固定。 包埋法包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。固定化方法。常用的凝胶常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、卡拉胶等。胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶包埋法简单，可适用于大多数

5、酶。二、二、 固定化酶和细胞的性质固定化酶和细胞的性质 1 1、固定化后的活性固定化后的活性 酶经固定化后，活力降低。酶经固定化后，活力降低。 原因是原因是： a.a. 酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或多或少地参与了结合多或少地参与了结合 ，使得酶的结构发生部，使得酶的结构发生部分变化，酶活力有一部分丧失。分变化，酶活力有一部分丧失。 b.b. 由于载体的存在，有空间位阻，影响底物由于载体的存在，有空间位阻，影响底物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。和酶接触，酶的活性得不到全部表达。 细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内酶细胞固定化后，一般酶活力不下降

6、。细胞内酶受细胞膜、壁的保护。受细胞膜、壁的保护。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质固定化酶结构的改变固定化酶结构的改变 2 2、稳定性、稳定性 酶或细胞被固定化后，由于载体的酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶分子的存在，酶分子的结构或细胞被约束结构或细胞被约束，对外部恶劣环境的对外部恶劣环境的敏感性下降，使敏感性下降，使其稳定性增加其稳定性增加（对热、对各种化学（对热、对各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的试剂等）。而且有时稳定性增加的幅度比较大。幅度比较大。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性，反应的phph

7、值，值，t t，动力学常数）动力学常数）a.a. 底物专一性底物专一性：当底物为大分子时，酶或细：当底物为大分子时，酶或细胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶或细胞对底物专一性变化不大。酶或细胞对底物专一性变化不大。 b b最适最适phph：依固定化载体与酶分子、细胞上依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向有的不变化，有的向phph小的方向移动，有的小的方向移动，有的向向phph大的方向移动。大的方向移动。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性

8、，反应的phph值，值，t t，动力学常数）动力学常数） c.c.反应的反应的最适温度最适温度 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升高的幅度不同，升高的幅度不同，215215 o oc c不等。不等。d.d.动力学常数动力学常数 酶：米氏常数酶：米氏常数kmkm反映了酶和底物的亲和力。反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现固定化酶的表现km(appkm(app) )与游离酶的与游离酶的kmkm相比相比有些不变，有的变化很大。有些不变，有的变化很大。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性，反应的phph值，值，t t，动力学常数）动力学常数

9、） 原因可能是原因可能是：载体间的静电作用，以及扩：载体间的静电作用，以及扩散效应。如果固定化酶区域的散效应。如果固定化酶区域的底物浓度比底物浓度比外部液相主体溶液高外部液相主体溶液高，km(appkm(app) )下降。相反，下降。相反，用包埋法的固定化酶的用包埋法的固定化酶的km(appkm(app) )值，可较游值，可较游离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的扩扩散效应使底物浓度减少，散效应使底物浓度减少，导致内部底物浓导致内部底物浓度低于外部区域的浓度，度低于外部区域的浓度，km(appkm(app) )上升。上升。 对于固定化细胞，情况类似。对于固定化细

10、胞，情况类似。 vmaxvmax 一般不变化。一般不变化。8.2 8.2 固定化酶和固定化细胞的应用固定化酶和固定化细胞的应用 在在7070年代初，首先固定年代初，首先固定单一的酶单一的酶，催化单一，催化单一反应；反应； 随后同随后同时固定两种酶或两种以上的酶时固定两种酶或两种以上的酶，以及，以及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应； 再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件，易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件，还可以还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复利用活细胞的完整代谢体系来完成复

11、杂的反应。杂的反应。如乙醇的生产。如乙醇的生产。8.2 8.2 固定化酶和固定化细胞的应用固定化酶和固定化细胞的应用 在固定化酶、固定化细胞的研究中发展在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的起来的亲和层析技术亲和层析技术，已经远远超出了已经远远超出了 利用酶和微生物进行催化反应的范畴。利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。疫吸附反应。 固定化酶和细胞技术的显著特点固定化酶和细胞技术的显著特点： 1 1连续反应；连续反应； 2 2获得的产物纯度高；获得的产物纯度高； 3 3固定化酶或细胞可重复使用，减少固定化酶或细胞可

12、重复使用，减少 了浪费；了浪费； 4 4易实现自控易实现自控。应用实例：应用实例： dl-dl-氨基酸的光学拆分氨基酸的光学拆分 人体只能利用人体只能利用l-l-氨基酸，所以氨基酸，所以l-l-氨基酸氨基酸在食品医药领域的应用非常广泛，并且在食品医药领域的应用非常广泛，并且需要量不断增加。需要量不断增加。 化学合成法是生产氨基酸的方法之一，化学合成法是生产氨基酸的方法之一，该法成本低，但生产出来的氨基酸是该法成本低，但生产出来的氨基酸是dl dl 外消旋体。要想把外消旋体。要想把l-l-氨基酸分离出来，氨基酸分离出来，需要进行光学拆分。需要进行光学拆分。 复习几个概念：复习几个概念： 外消旋体

13、外消旋体：对映体的右旋体和左旋：对映体的右旋体和左旋体等量混合后，它们的旋光性相互体等量混合后，它们的旋光性相互抵消，不再有旋光性。这样的混合抵消，不再有旋光性。这样的混合物称为外消旋体，以物称为外消旋体，以d、l表示。外表示。外消旋体可以用适当方法拆开或分开。消旋体可以用适当方法拆开或分开。复习几个概念：复习几个概念： 外消旋化外消旋化：在一般情况下，和不对称碳在一般情况下，和不对称碳原子相连的四个原子或原子团，不能随原子相连的四个原子或原子团，不能随意调换位置，因此对映体不能相互转换，意调换位置，因此对映体不能相互转换，旋光度维持不变。旋光度维持不变。 但在热、光、或者化学试剂的影响下，但

14、在热、光、或者化学试剂的影响下，不对称碳原子上的原子或原子团可发生不对称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象，使旋光物质转化为它的对映调换现象，使旋光物质转化为它的对映体，最后得到外消旋体体，最后得到外消旋体，原来，原来100%的左的左旋体，经变化后，变成旋体，经变化后，变成50%左旋体和左旋体和50%的右旋体，这种现象称为外消旋化。的右旋体，这种现象称为外消旋化。 dl-dl-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的的l-l-aaaa，且收率高且收率高。 氨基酰化氨基酰化edl-r-chcooh +

15、 h2o l-r-ch-cooh + d-r-chcooh 不对称水解不对称水解 nh2 nh2 nhcor 溶解度小溶解度小酰化酰化-dl-aa l-aa 酰化酰化d-aa 外消旋化外消旋化外消旋体外消旋体固定化酶光学拆分固定化酶光学拆分dl-dl-氨基酸生产流程氨基酸生产流程 19691969年，日本千钿一郎成功地利用固年，日本千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶，由酰化定化酰化氨基酸水解酶，由酰化- -dl-dl-氨基酸连续生产氨基酸连续生产l-l-aaaa获得成功。获得成功。 这是这是世界上世界上固定化酶在工业生产上应固定化酶在工业生产上应用的用的第一个实例第一个实例。各种光学活性氨基。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。