分子生物学技术ppt课件

1、分子生物学常用实验技术分子生物学常用实验技术The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology2010.9.231;.2现代分子生物学现代分子生物学遗传中心法则与组学遗传中心法则与组学 遗传信息传递的基本规律遗传信息传递的基本规律分子生物学研究内容分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用生物大分子的相互作用 分子生物研究技术分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质蛋白质- -蛋白质相互作用蛋白质相互作用蛋白质蛋白质- -核酸相互作用核

2、酸相互作用工具酶的应用工具酶的应用3遗传中心法则 基因信息的流向、基因表达的环节与调基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；控的不同水平； DNA所占的中心位置；所占的中心位置； RNA是信息表达的体现；是信息表达的体现； 蛋白质执行生物学功能。蛋白质执行生物学功能。 基因工程的基本原理基因工程的基本原理! 生命的起源？生命的起源？ 4基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系 基因组学是基础、基因组学是基础、转录组学是信息、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。代谢组学是结果。5整合也是创新整合也是创新方法的结合

3、方法的结合形态与机能研究的结合形态与机能研究的结合 中西医的结合中西医的结合62121世纪分子医学发展的主要领域世纪分子医学发展的主要领域分子诊断基因治疗生物工程药物7第一讲第一讲蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析Isolation, Purification, Identificationand Structural Analysis of Proteins8一一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀: 是常用的蛋白质沉淀方法是常用的蛋白质沉淀方法 使用丙酮沉淀时，必须在使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般低温下进行，丙酮用量一般

4、10倍于蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。 除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析盐析(salt precipitation) 是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 9+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白

5、质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉10将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 免疫沉淀法免疫沉淀法（immunoprecipitation）11二、透析及超滤法二、透析及超滤法: 可清除蛋白质溶液中的小分子化合物可清除蛋白质溶液中

6、的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤法超滤法 透析透析(dialysis)(dialysis)12三三、电泳、电泳: 是蛋白质分离与鉴定的常用方法是蛋白质分离与鉴定的常用方法电泳电泳(elctrophoresis)蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。

7、这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为称为电泳电泳。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 13SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳：几种重要的蛋白质电泳：14蛋白质的二维电泳蛋白

8、质的二维电泳1516四四、应用相分配或亲和原理：、应用相分配或亲和原理： 可将蛋白质进行层析分离可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。层析层析(chromatography) (chromatography) 17离子交换层析：

9、离子交换层析： 利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)： 又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法181920五五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：、利用蛋白质颗粒沉降行为不同： 可进行超速离心分离可进行超速离心分离 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation) 既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的

10、分子量。 沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient, S) 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉降系数与蛋白质的密度和沉降系数与蛋白质的密度和形状相关形状相关 。21因为沉降系数因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。2223六、用化学或反向遗传学方法：六、用化学或反向遗传学方法： 可分析或演绎多肽链的氨基酸序列可分析或演绎多肽

11、链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。24化学法化学法溶解法溶解

12、法二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNP法）法） 肼解法肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法氯法）还原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶羧肽酶A A法法羧肽酶羧肽酶B B法法羧肽酶羧肽酶C C法法氨基酸和肽的末端测定法氨基酸和肽的末端测定法25通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列26七、应用物理学、生物信息学原理：可进

13、行蛋白质空间结构测定或预测七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测通常采用圆二色光谱通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。结构含量。 -螺旋的螺旋的CD峰有峰有222nm处的负峰、处的负峰、208nm处的负峰和处的负峰和198nm处的正峰处的正峰3个成分；而个成分；而 -折叠的折叠的CD谱不很固定。谱不很固定。 （一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例27X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术核磁共振技术(nuc

14、lear magnetic resonance, NMR) 是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 （二）（二）X X射线衍射法和核磁共振技术：射线衍射法和核磁共振技术： 用于三维空间结构分析用于三维空间结构分析1A2. Structure of dCTP 3. Base Tautomerism Chargaff rules- A=T, G=C helical10 layer Lines BetweenCrossPatterns(10 ResiduesPer turn)Evidence for the Double Helix1. Fiber Diffra

15、ction data:-Helical geometry-3.4 A spacing (1A = 10-10 m)-34 A pitch28;.29* * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。质分子的空间结构。 （三）根据氨基酸序列：（三）根据氨基酸序列： 预测预测蛋白质蛋白质三维空间结构三维空间结构* * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构

16、的预测。结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。3030第二讲第二讲DNADNA操作的基本技术操作的基本技术The Basic Technologies for DNA Manipulations3131 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization3232什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以以DNADNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同

17、源序列的两条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一定条件下按碱基互补配），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程 可用于基因诊断可用于基因诊断33n核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把单链分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，只要在放在一起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链就可以在

18、不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。分子杂交与印迹技术的原理分子杂交与印迹技术的原理34复性复性RNADNA35印迹技术印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。译为印迹技术。 36用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称

19、为苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。源的核酸分子存在。是基因诊断的常用技术是基因诊断的常用技术 探针技术探针技术37基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫血进行诊断。地中海贫血进行诊断。38基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾利用分子生物学技术，通过检测基因及

20、基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或，也可以是蛋白质或者多肽者多肽( (分子诊断分子诊断）。）。 39诊断依据诊断依据( (遗传物质改变遗传物质改变) )lDNADNA、RNARNA或蛋白质水平变化。或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；表达水平从低到高；l基因结构变化基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或

21、灭活。40基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏性高灵敏性早期诊断性早期诊断性应用广泛性应用广泛性41基因诊断中常用的分子生物学技术基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) (PCR) 单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP） 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP） DNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencing） 生物芯片（生物芯片（bioch

22、ipsbiochips） WesternWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blottingWestern blotting） 免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 42基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合

23、适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片选择合适的芯片43印迹技术印迹技术 4444一、一、Southern Southern 印迹印迹: :可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化由由E. M. Southern在在1975年提出年提出可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化基本操作过程包括基本操作过程包括待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记；待测待测DNA

24、样品的电泳分离；样品的电泳分离；电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。 45Edwin Southern Sir Edwin Southern (born 1938), US biologist and deviser of the DNA analytical technique Southern blotting. This technique uses enzymes to fragment

25、 DNA (deoxyribonucleic acid), and the fragments are then separated in an electrophoresis gel. The separated fragments are then blotted onto a nitrocellulose filter and marked with radioactive probes. The probes indicate the presence of specific genes (lengths of DNA that code for proteins). A sheet

26、of photographic film is then laid over the filter. The radioactivity darkens the film, which reveals the position of genes in the DNA. This technique is widely used in genetic research. Photographed in the 1980s.46核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制

27、备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针4747SouthernSouthern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液48Northern Northern 印迹印迹49 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的测特定的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。Northern印迹杂交印迹杂交(Northern blotting)5050二、二、Northern 印迹和印迹和RT-P

28、CR:可用于分析基因转录水平的变化可用于分析基因转录水平的变化Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法；的常用方法；RT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进为模板进行特异性扩增，进行行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化 。51三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较5252三、原位分子杂交技术三、原位分子杂交技术:可用于基因及其表达产物的定位分

29、析可用于基因及其表达产物的定位分析原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。5353（一）利用原位杂交技术（一）利用原位杂交技术:进行基因定位分析进行基因定位分析荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） 基因组原位杂交基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH） 54斑点

30、杂交（斑点杂交（dot blotting） 将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。定基因及其表达产物的定性及定量的研究。55 反向斑点杂交反向斑点杂交（reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或或DNA标记变性标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率大大

31、提高了基因诊断的效率。5656FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置57荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）5858（二）利用原位杂交技术（二）利用原位杂交技术:确定特定基因的表达定位确定特定基因的表达定位RNA原位杂交原位杂交 整体原位杂交（整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization, WISH） 59 固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization) 待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（片段（A、B片段），

32、分别作为捕捉探针片段），分别作为捕捉探针（不标记的（不标记的A片段）和检测探针（标记的片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。片段），同时与靶基因杂交。 先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。60固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 61基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异

33、常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。62（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知635/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制

34、性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变64斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 65 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。色三体（如唐氏综合征）等。 2. 2.

35、基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR PCR 66BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe - -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断- -珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同程度的缺失可引起不同类型的 - -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血67 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）683.

36、3. 基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析69（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清 致病位点不便检测致病位点不便检测70 DNA多态性：多态性： 指群体中的指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只

37、是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2. 2. 遗传标记遗传标记71间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记： RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism)727.6kb13kb患者患者正常正常 HbSHbS的间接基因诊断的间接基因诊断 RF

38、LPRFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针7373聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction7474什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCRpolymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的

39、方法； 由由K. MullisK. Mullis于于19831983年建立年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNADNA序列的相互作用。序列的相互作用。 75The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistryMulls Nobel Prize for his invention

40、of the polymerase chain reaction (PCR) method B.19447676PCRPCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火77772530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环278 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reactio

41、n, PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火79模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分80 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段； 利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；

42、利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。文库或基因组文库中克隆基因。 PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆81PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是的量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的最好方法。微量分析的最好方法。 （二）（二）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（三）基因突变（三）基因突变 利用利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。失、点突变等改造。 82将将PCR技术引入技术引入DN

43、A序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析83PCRPCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用RT-PCRRT-PCR荧光定量荧光定量PCRPCR多重多重-PCR-PCRPCR-ASOPCR-ASOAS-PCRAS-PCRPCR-SSC

44、PPCR-SSCPPCR-RFLPPCR-RFLP84RT-PCR8585一、一、PCRPCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物反转录反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将）是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反反应联合应用的一种技术。应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量进行定性及半定量分析的最有效方法。分析的最有效方法。 8686mRNA 5 AAAAAA(n) 3 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(

45、n) 5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 反转录合成反转录合成cDNAcDNA87 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR88 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合

46、成的针对正常和突变常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）89PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM90单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为

47、单链后在中性聚丙烯酰胺凝片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。分离开来。91PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意92正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+ + PCR-SSCP分析分析 93 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化

48、变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。94 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在在PCR扩增后用该限制酶切割扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。出诊断。PCR-RFLP95ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoREcoR

49、 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化96 1985年，英国遗传学家年，英国遗传学家Jeffeys等人用等人用TR的核心序列为探针进的核心序列为探针进行行RFLP分析时，检测到许多分析时，检测到许多HVR，并产生相应的图谱，所得，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为一性，所以称其为DNA指纹图谱指纹图谱（DNA fingerprinting）。）。 Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 目目 录录Alec John Jeffrey

50、s97亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。 98DNADNA指纹用于罪犯识别指纹用于罪犯识别9999二、二、PCRPCR技术可以进行实时、定量分析技术可以进行实时、定量分析QR3355上游引物上游引物下游引物下游引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355100100三、三、PCRPCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNADNA序列序列101PCRPCR与点突变与点突变 重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术(gene splicing by

51、overlap extension PCR,简称简称SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物由于采用具有互补末端的引物,使使PCR产物形成了重叠链产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 102重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术103 此技术利用此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连而且不需要内切酶消化和连接酶处理接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。可利用这

52、一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。 重叠延伸重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。技术成功的关键是重叠互补引物的设计。 重叠延伸重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因扩增等方面有其广泛而独特的应用。以及目的基因扩增等方面有其广泛而独特的应用。104104 DNADNA序列测定序列测定DNA Sequencing105105DNADNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变和发展20世纪世纪70年代年代双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F. Sang

53、er化学裂解法：化学裂解法：A. Maxam和和W. Gilbert20世纪世纪80年代年代PCR及自动测序技术及自动测序技术106106一、一、DNADNA序列分析序列分析: :有双脱氧链终止法和化学裂解法有双脱氧链终止法和化学裂解法（一）（一）SangerSanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法利用22，3 -3 -双脱氧核苷酸掺入双脱氧核苷酸掺入（二）（二）Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应 107The Nobel Prize in Chemistry 1980for his

54、fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNAfor their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger108108双脱氧链终止法双脱氧链终止法109109GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAA

55、ACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddC110DNADNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应。测序反应。反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依片段上的荧光分子

56、使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 111111DNADNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示112 DNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）113113二、二、DNADNA序列分析序列分析: :可以揭示基因和基因组一级结构变化可以揭示基因和基因组一级结构变化通过通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异序列分析可以鉴定基因和基因组的变异通过通过DNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因通过

57、通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认114左侧：正常；右侧：突变左侧：正常；右侧：突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究（黄金标准）（黄金标准）115 Megabace 测序仪测序仪3700 测序仪测序仪116116 DNADNA芯片技术芯片技术DNA Chip Technologies117117什么是什么是DNADNA芯片技术芯片技术DNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的

58、遗传信息通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。118特定基因检测特定基因检测突变检测突变检测多态性分析多态性分析基因表达谱基因表达谱基因芯片的应用基因芯片的应用生物信息学的工具生物信息学的工具基因相关性研究基因相关性研究基因功能基因功能药物设计和开发药物设计和开发潜在反义试剂开发潜在反义试剂开发个体化医疗个体化医疗身份识别身份识别基因诊断基因诊断其他与生物有关的领域其他与生物有关的领域119119基因芯片工作流程基因芯片工作流程120121121一、利用一、利用DNADNA芯片

59、技术芯片技术: :可同时进行高通量基因转录活性的分析可同时进行高通量基因转录活性的分析cDNA芯片每个探针是芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段片段或基因的一段PCR产物，可以同任何具有同源序列的产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有1020个相对应的探针，个相对应的探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。 122122二、染色质免疫共沉淀与芯片

60、技术结合二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合: :检测蛋白质检测蛋白质-DNA-DNA相互作用相互作用染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀- -芯片芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特异性地富集目的蛋白结合的特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；荧光标记，再用于芯片分析；寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。（一）（一）ChIP-on-ch