胞外的热休克蛋白90α介导屋尘螨导致的支气管上皮屏障破坏过程及其机制的探讨

1、胞外的热休克蛋白90介导屋尘螨导致的支气管上皮屏障破坏过程及其机制的探讨研究背景支气管哮喘 ( 简称哮喘 ) 是多种细胞成分和细胞组分参与的持续的慢性气道炎症性疾病。气道屏障的破坏和高通透性是哮喘发病的启动环节。既往研究表明屋尘螨 (HDM)能增加气道上皮屏障的通透性, 从而参与哮喘的发生发展。然而 , 其具体机制尚不明确。热休克蛋白 (Hsp)90 通过分泌到细胞外的微环境( 简称胞外 ) 而发挥其促细胞动力作用 , 目前的研究主要集中在伤口的愈合和肿瘤的转移。RhoA信号是生物体内重要的信号 , 参与了血管内皮及肠道的屏障的破坏, 抑制 Hsp90可通过破坏src 调节的 RhoA信号保护

2、内毒素 (LPS) 诱导的肺内皮细胞的屏障破坏。因此 , 胞外的 Hsp90(eHsp90) 可能在 HDM诱导的气道上皮屏障破坏中扮演十分重要的作用 , 同样 , 体外研究也进一步表明了抑制表皮生长因子受体信号(EGFR信号 ) 可明显改善 HDM所导致的气道上皮高通透性, 但其具体机制尚不明确。实验目的 :1 、探讨 HDM诱导的气道上皮屏障破坏的具体机制和eHsp90通过激活 RhoA/肌球蛋白轻链 (MLC)介导 HDM诱导的支气管上皮屏障的破坏。2、探讨 HDM对肌动蛋白应力纤维 (F-actin)重新排布的影响及EGFR信号在其中的作用。实验方法 : 通过测量跨膜电阻值 (TEER

3、)和右旋糖苷的通透率(FITC-DX) 来评估 HDM诱导的人支气管气道上皮细胞16HBE14o-(16HBE)的屏障功能的破坏 , 通过免疫蛋白印记法 (Western blotting)和免疫荧光 (Cofocal)来评估粘附连接蛋白E-cadherin及-catenin的表达和分布的情况。通过浓缩和纯化条件培养基检测气道上皮细胞对eHsp90的分泌情况。RhoA的活性是通过 Rho G-LISA(?)RhoA activation assay kitTM biochem kit试剂盒测定 , 通过蛋白免疫印记法测定MLC磷酸化水平。另外 , 应用 Western blotting方法检测

4、 HDM对 EGFR、磷酸化 EGFR及 F-actin蛋白水平变化 , 应用免疫荧光技术观察F-actin的分布变化。实验结果 : 与对照组相比 ,HDM刺激 16HBE细胞引起上皮细胞单层的高通透性, 表现为 TEER值下降和FITC-DX升高 , 且均在 400U/ml 的 HDM最明显。同时 ,HDM亦可引起粘附连接蛋白E-cadherin 和 -catenin的在细胞膜上面的分布异常 , 由细胞膜向胞浆弥散。另外,HDM刺激 16HBE细胞时 , 可以观察到eHsp90 的分泌是明显增多 , 且均在 400 U/ml 的 HDM最明显。进一步通过慢病毒下调Hsp90及预处理 eHsp

5、90 的单克隆抗体 1G6-D7可以保护 HDM诱导的屏障的破坏 , 表现为 TEER和 FITC 的改善及 E-cadherin和 -catenin的分布异常的改善。同时,400 U/ml的 HDM作用 16HBE细胞在 6h 引起RhoA的活性的增加 , 而同浓度的 HDM可引起 MLC的磷酸化水平开始6h 升高 ,24 h达最高。然而发现下调 Hsp90 及预处理 eHsp90 的单克隆抗体 1G6-D7可以保护HDM诱导的 RhoA的活性和 MLC的磷酸化水平。进一步使用Rho激酶的抑制剂GSK429286A和 Y27632 2HC1预处理 16HBE细胞可以保护 HDM诱导的支气管上

6、皮屏障的破坏 , 表现为 TEER和 FITC 的改善及 E-cadherin和-catenin的分布异常的改善。另外 , 人重组 (hr)Hsp90 而不是 hrHsp90刺激 16HBE细胞亦可以诱导支气管上皮屏障的高通透性及RhoA/MLC信号的活化。然后 , 予 EGFR抑制剂 AG-1478进行预处理 , 实验分为四组 : 对照组 ,AG-1478 组,HDM组,AG-1478+HDM组。与对照组比较 ,HDM组磷酸化 EGFR表达明显增多 , 加入 EGFR抑制剂 AG-1478后 E-cadherin 和-catenin 的分布异常及 TEER值、FITC-DX通透率均明显改善。HDM刺激后促进 F-actin表达增多并出现重新排布, 而 EGFR抑制剂 AG-1478可明显抑制这一过程。实验结论 :1 、研究证明了 eHsp90 通过激