酶、细胞和原生质体固定化

1、游离酶在应用中的不足 稳定性差：稳定性差：高温、强酸、强碱、重金属离子高温、强酸、强碱、重金属离子 难于回收和重复利用：难于回收和重复利用：一次性使用酶一次性使用酶 产物的分离纯化困难产物的分离纯化困难固定化酶（细胞）的由来和发展19161916年，年，Nelson & Griffin “ “酶不溶于水而具有活酶不溶于水而具有活性性”19481948年，年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶19531953年，年，Grubhofer & Schleith 第一次实现了酶的第一次实现了酶的固定化固定化19601960年，千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究年，千畑一

2、郎开始了氨基酰化酶固定化研究19691969年，千畑一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用年，千畑一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于于DL-AADL-AA的光学分析上的光学分析上19711971年，固定化酶名称提出，年，固定化酶名称提出，Immobilized enzyme19731973年，固定化微生物的应用年，固定化微生物的应用19761976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精19781978年，日本用固定化细胞生产酶年，日本用固定化细胞生产酶19791979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究究19821982年，日本首次研究用固

3、定化原生质生产年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸氨基酸19861986年，郭勇等人固定化原生质研究年，郭勇等人固定化原生质研究固定化酶 固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 用于固定化的酶，通常是经提取分离纯化后的酶，也可以用于固定化的酶，通常是经提取分离纯化后的酶，也可以是含酶菌体或菌体碎片。是含酶菌体或菌体碎片。 优点：稳定性增加；可反复使用；利于连续操作；易于和优点：稳定性增加；可反复使用；利于连续操作；易于和反应产物分离。反应产物分离。固定化细胞 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞，固定在载体上并在一

4、定的空间范围内进行生命活动的细胞，也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。 为动植物来源的天然产物的工业化生产开辟了新的途径。为动植物来源的天然产物的工业化生产开辟了新的途径。 固定化原生质体 为为胞内酶胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方法。生产技术路线的变革提供了新的方法。第一节 酶固定化一、酶和菌体固定化的方法 吸附法吸附法包法包法结法结法交法交法热处法热处法1.1.吸附法吸附法定义定义: :利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。吸附在其表面上而使酶固定的方法。吸附剂吸附剂: :活性炭、氧化铝、硅藻

5、土、羟磷灰活性炭、氧化铝、硅藻土、羟磷灰石等。石等。特点特点: :操作简单操作简单, ,条件温和条件温和, ,不会引起酶活性不会引起酶活性损失损失, ,但结力弱但结力弱, ,使用受限制。使用受限制。二、包法二、包法将酶或含酶菌体包在各种多孔载体中使酶固定化的方法。将酶或含酶菌体包在各种多孔载体中使酶固定化的方法。（1 1）凝胶包法：）凝胶包法：将酶分子包在凝胶内部的微孔中。将酶分子包在凝胶内部的微孔中。天然凝胶：琼凝胶、藻藻酸凝胶、角叉胶、胶等；天然凝胶：琼凝胶、藻藻酸凝胶、角叉胶、胶等；结合凝胶：聚丙烯酰凝胶、交联琼等。结合凝胶：聚丙烯酰凝胶、交联琼等。 注意：不适用于底物和产物分子量大的酶

6、的固定化。注意：不适用于底物和产物分子量大的酶的固定化。（2 2）半透膜包法（微囊化法）：）半透膜包法（微囊化法）：将酶包在有各种高分子将酶包在有各种高分子：结物制合的小球中，制合固定化酶。：结物制合的小球中，制合固定化酶。半透膜：烯酰膜、火胶膜等。半透膜：烯酰膜、火胶膜等。 注意：适用于底物和产物分子量都小的酶固定化。注意：适用于底物和产物分子量都小的酶固定化。定义：酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基定义：酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形合共价键或离子键而固定的方法。团之间形合共价键或离子键而固定的方法。（1 1）离子键结法）离子键结法定义定义: :通过离子键使酶与载体结的固定

7、化方法。通过离子键使酶与载体结的固定化方法。常用载体常用载体（不溶于水的离子换剂）：（不溶于水的离子换剂）：DEAEDEAE纤纤维素、维素、TEAETEAE纤维素、纤维素、DEAEDEAE葡：糖凝胶。葡：糖凝胶。特点：特点：反应条件温和，活力损失少，结力弱，反应条件温和，活力损失少，结力弱，pHpH和离子强度等条件改变易影响固定化效果，因和离子强度等条件改变易影响固定化效果，因此须严格控制此须严格控制pHpH、离子强度和温度等操作条件、离子强度和温度等操作条件3. 结法结法（2 2）共价键结法）共价键结法定义：定义：通过共价键将酶与载体结的固定化方法。通过共价键将酶与载体结的固定化方法。特点：

8、特点：稳定性好，反应条件激烈，操作复杂，控制稳定性好，反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，相对酶活力较低条件苛刻，相对酶活力较低载体：载体：纤维素、：琼糖凝胶、葡：糖凝胶、甲壳素纤维素、：琼糖凝胶、葡：糖凝胶、甲壳素与载体结的酶官能团：与载体结的酶官能团：氨基、羟基、巯基、咪唑氨基、羟基、巯基、咪唑基、羧基和酚基基、羧基和酚基载体的选择载体直接关系到固定化酶的性质和形成，对载体载体直接关系到固定化酶的性质和形成，对载体要求：要求： 一般亲水载体优于疏水载体一般亲水载体优于疏水载体 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度 带有与酶结合的功能基团带有与酶

9、结合的功能基团 没有或很少有非专一性基团没有或很少有非专一性基团 载体来源容易，便宜，并能反复使用载体来源容易，便宜，并能反复使用要使载体与酶形合共价键，必须首先使要使载体与酶形合共价键，必须首先使载体活载体活化化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团；然后此活泼基团再与酶分子上的某一泼基团；然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形合共价键。基团反应，形合共价键。载体活化方法：载体活化方法：重重法重重法重法重法化化法化化法基化法基化法 重重法：将含有重重法：将含有苯氨基苯氨基的不溶性载体与亚硝藻的不溶性载体与亚硝藻反应，生合重重盐衍生物，使载体引

10、进了活泼的反应，生合重重盐衍生物，使载体引进了活泼的重重基团重重基团。载体活化后，活泼的载体活化后，活泼的重重基团重重基团可与酶分子中的可与酶分子中的酚基酚基或或咪唑基咪唑基发生偶交反应，制得固定化酶。发生偶交反应，制得固定化酶。 重法：含有重法：含有烯肼基团烯肼基团的载体可用亚硝藻的载体可用亚硝藻活化，生合含活化，生合含重基团重基团的的重化结物。重化结物。羧甲基纤维素重衍生物中活泼的羧甲基纤维素重衍生物中活泼的重基团重基团可与可与酶分子中的酶分子中的氨基氨基形合形合肽键肽键，使酶固定化。，使酶固定化。重基团重基团还可以与酶分子中的还可以与酶分子中的羟基羟基、巯基巯基等反应，等反应，制合固定化

11、酶。制合固定化酶。 化化法：结有化化法：结有羟基羟基的载体，如纤维素、的载体，如纤维素、：琼糖凝胶、葡：糖凝胶等，可用化化活化：琼糖凝胶、葡：糖凝胶等，可用化化活化生合生合亚氨基亚氨基碳藻衍生物：碳藻衍生物：活化载体上的活化载体上的亚氨碳藻基团亚氨碳藻基团在微碱性的条件下，在微碱性的条件下，可与酶分子上的可与酶分子上的氨基氨基反应，制合固定化酶。反应，制合固定化酶。 基化法：含基化法：含羟基羟基的载体可用三氯的载体可用三氯- -均三均三嗪等多卤代物进行活化，形合含有嗪等多卤代物进行活化，形合含有卤素基团卤素基团的活化载体。的活化载体。活化载体上的活化载体上的卤素基团卤素基团可与酶分子上的可与酶

12、分子上的氨基氨基、巯巯基基、羟基羟基等发生基化反应，制备合固定化酶。等发生基化反应，制备合固定化酶。4. 4. 交法交法定义：定义：利用利用双功能试剂双功能试剂，在酶分子间或酶与载体，在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交反应，将酶固定间，或酶与惰性蛋白间进行交反应，将酶固定化。化。交试剂：交试剂：戊二醛、己二酰、顺丁丙二藻酐、双戊二醛、己二酰、顺丁丙二藻酐、双偶重苯等。偶重苯等。戊二醛的两个醛基都可与酶的游离氨基反应，形戊二醛的两个醛基都可与酶的游离氨基反应，形合席夫碱，使酶交制合固定化酶。合席夫碱，使酶交制合固定化酶。特点：特点：结牢固，可长时间使用；结牢固，可长时间使用；交反应条

13、件激烈，酶活力损失大。交反应条件激烈，酶活力损失大。常将交法与吸附法或包法交结使用。常将交法与吸附法或包法交结使用。双重固定化酶法：将酶先用凝胶包后再用将酶先用凝胶包后再用戊二醛交，或先将酶用硅胶等吸附后再进行戊二醛交，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交等。交等。5.5.热处法热处法定义：定义：将含酶细胞在一定温度下加热处一段时间，将含酶细胞在一定温度下加热处一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。适用范围：适用范围：热处法只适用于那些稳定性较好的热处法只适用于那些稳定性较好的酶的固定化。酶的固定化。注意：注意：在加热处时，要严格控制好加温度和时在

14、加热处时，要严格控制好加温度和时间，以免引起酶的变性失活。间，以免引起酶的变性失活。二、固定化酶的性质酶活力酶活力稳定性稳定性最适温度最适温度最适最适PHPH值值底物特异性底物特异性1.1.活力活力固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。一性也能发生改变。例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3030，而，而对低分子底物苯酞精氨酸对低分子底物苯酞精氨酸- -对硝基酰替苯胺的活对硝基酰替苯胺的活力保持力保持8080。固定化

15、酶的活力降低的原因 酶分子在固定化过程中，空间构象会发生变化，酶分子在固定化过程中，空间构象会发生变化，甚至影响活性中心的氨基藻。甚至影响活性中心的氨基藻。 固定化后，酶分子空间自由度受到限制固定化后，酶分子空间自由度受到限制( (空间位空间位阻阻) )，会直接影响到活性中心对底物的定位作用。，会直接影响到活性中心对底物的定位作用。 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻。内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻。 包时酶被高分子物质半透膜围，大分子底物包时酶被高分子物质半透膜围，大分子底物不能透过膜与酶接近。不能透过膜与酶接近。2.2.稳定性稳定性固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主

16、要固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：表现在：(1)(1)对的稳定性提高，可以耐受较高的温度。对的稳定性提高，可以耐受较高的温度。(2)(2)对对pHpH的稳定性提高。的稳定性提高。(3)(3)保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长的保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长的时间。时间。(4)(4)对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。(5)(5)对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐藻胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的盐藻胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力。酶活力。固定化酶的

17、固定化酶的pHpH稳定性、显优于游离酶稳定性、显优于游离酶青霉素酰化酶在不同青霉素酰化酶在不同pHpH的缓冲液中，于的缓冲液中，于3737保温保温16h16h测定酶活力测定酶活力: :固定化酶在固定化酶在pH5.5-10.3pH5.5-10.3活力稳定；活力稳定；游离酶则仅在游离酶则仅在pH7.0-9.0pH7.0-9.0稳定稳定。固定化后酶固定化后酶pHpH稳定性提高的可能原因稳定性提高的可能原因: : 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形子伸展变形 酶活力的缓慢释放酶活力的缓慢释放 抑制酶的自降解抑制酶的自降解: :将菌与固态载体结后，

18、酶将菌与固态载体结后，酶由于失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了由于失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解降解3 3最适温度最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。活化能也变化不大。 有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较、有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较、显的变化。显的变化。例：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白例：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高酶，其作用的最适温度比游离酶高5-105-10 同一种酶，在采用不同的方法或不同载体进行固同一种酶，在采用不同的方法

19、或不同载体进行固定化后，其最适温度也可能不同。定化后，其最适温度也可能不同。4 4最适最适pHpH值值酶经过固体化后，其作用的最适酶经过固体化后，其作用的最适pHpH值往往会发值往往会发生变化生变化, ,影响固定化酶最适影响固定化酶最适pHpH值的因素主要有值的因素主要有: :载体的带电性质载体的带电性质酶催化反应产物的性质酶催化反应产物的性质(1)(1)载体性质对最适载体性质对最适pHpH值的影响：值的影响： 用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pHpH值值比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH值为高值为高( (即向碱性一侧移动即向碱性一侧移动) )。 用带

20、正电荷载体制备的固定化酶，其最适用带正电荷载体制备的固定化酶，其最适pHpH值值比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH值为低值为低( (即向藻性一侧移动即向藻性一侧移动) )。 用不带电荷的裁体制备的固定化酶，其最适用不带电荷的裁体制备的固定化酶，其最适pHpH值一般不改变值一般不改变( (有时也会有所改变，但不是由于载有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的体的带电性质所引起的) )。(2)(2)产物性质对最适产物性质对最适pHpH值的影响：值的影响： 产物为藻性时，固定化酶的最适产物为藻性时，固定化酶的最适pHpH值要比游离值要比游离酶的最适酶的最适pHpH值高一些。值高一些。 产

21、物为碱性时，固定化酶的最适产物为碱性时，固定化酶的最适PHPH值要比游离值要比游离酶的最适酶的最适pHpH值低一些。值低一些。 产物为中性时，最适产物为中性时，最适pHpH值一般不改变。值一般不改变。5.5.底物特异性底物特异性固定化酶的底物特异性与游离酶比较有些不同，固定化酶的底物特异性与游离酶比较有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。其变化与底物分子量的大小有一定关系。 对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有、显变化。的底物特异性没有、显变化。例例: :氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异

22、构酶 对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化会发生变化例：例： 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在按甲基纤维素用于低分子的二肽或多肽，固定在按甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3 3左右；左右； 以羧甲基纤维素为载体经迭氮法制备的核糖核以羧甲基纤维素为载体经迭氮法制备的核

23、糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的离酶的2 2左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的速度可达游离酶的50-6050-60。三、固定化酶的应用已用于工业化生产的固定化酶有已用于工业化生产的固定化酶有: :氨基烯化酶：氨基烯化酶：世界上第一种工业化的固定化酶世界上第一种工业化的固定化酶葡萄糖异构酶：葡萄糖异构酶：世界上生产规模最大的固定化酶世界上生产规模最大的固定化酶天门冬氨藻酶天门冬氨藻酶青霉素烯化酶：青霉素烯化酶：医药工业中应用广泛医药工业中应用广泛延胡索藻酶延胡索藻酶-半乳糖苷酶半乳糖苷

24、酶天冬氨藻天冬氨藻-脱羧酶脱羧酶(1)(1)利用固定化氨基烯化酶生产利用固定化氨基烯化酶生产L L氨基藻氨基藻 由化学结合法得到的氨基藻都是无、学活性的由化学结合法得到的氨基藻都是无、学活性的DLDL型外消旋混结物，必须进行、学拆分以获得型外消旋混结物，必须进行、学拆分以获得L L型型氨基藻。氨基藻。 外消旋氨基藻拆分的方法有物处化学法、酶法外消旋氨基藻拆分的方法有物处化学法、酶法等，其中以酶法最有效，能够产生纯度较高的等，其中以酶法最有效，能够产生纯度较高的L-L-氨基藻。氨基藻。19691969年日本人千畑一郎等通过离子换法将氨基年日本人千畑一郎等通过离子换法将氨基烯化酶固定在烯化酶固定在

25、DEAE-DEAE-葡：糖载体上，从而制得了葡：糖载体上，从而制得了世界上第一个适用于工业生产的固定化酶。酶活世界上第一个适用于工业生产的固定化酶。酶活性高，稳定性好，可用于连续拆分烯化性高，稳定性好，可用于连续拆分烯化-DL-DL-氨基氨基藻。藻。 产物的纯化较简单产物的纯化较简单 收率高收率高 合本低：固定化氨基烯化酶非常稳定，酶的费合本低：固定化氨基烯化酶非常稳定，酶的费用减少。固定化氨基烯化酶酶柱的生产工艺还用减少。固定化氨基烯化酶酶柱的生产工艺还可以自动控制，减少了劳动力费用。可以自动控制，减少了劳动力费用。(2)(2)利用固定化酶结合氨基藻利用固定化酶结合氨基藻即利用化学法结合分子

26、构简单的即利用化学法结合分子构简单的前体前体，再通过，再通过酶反应结合所需要的氨基藻。此法能够价廉、高酶反应结合所需要的氨基藻。此法能够价廉、高收率地生产发酵法或化学结合法尚难解决的一些收率地生产发酵法或化学结合法尚难解决的一些氨基藻。氨基藻。例：酶法合成例：酶法合成L-L-天冬氨酸是以化学法容易合成的天冬氨酸是以化学法容易合成的氨与富马酸为原料，用大肠杆菌细胞内酶天冬氨氨与富马酸为原料，用大肠杆菌细胞内酶天冬氨酸酶酸酶( (系一种裂解酶系一种裂解酶) )进行反应定量地合成天冬氨进行反应定量地合成天冬氨酸。酸。 以：聚丙烯酰凝胶为载体以：聚丙烯酰凝胶为载体, ,将具有高活力天冬氨将具有高活力天

27、冬氨藻酶的大肠杆菌菌体包制合固定化天冬氨藻酶，藻酶的大肠杆菌菌体包制合固定化天冬氨藻酶，用于工业化生产用于工业化生产, ,将延胡索藻转化生产天冬氨藻。将延胡索藻转化生产天冬氨藻。 或改用、角叉胶为载体制备固定化酶，也可将天或改用、角叉胶为载体制备固定化酶，也可将天冬氨藻酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，在用离冬氨藻酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，在用离子键结法制合固定化酶，用于工业化生产。子键结法制合固定化酶，用于工业化生产。三、固定化酶的优缺点极易将固定化酶与底物、产物分开；极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；

28、续反应；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合于多酶反应；较游离酶更适合于多酶反应；可以增加产物的效率，提高产物的质量；可以增加产物的效率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。酶的使用效率提高，成本降低。优点缺点：固定化时，酶活力有损失；固定化时，酶活力有损失；增加了生产的成本，工厂初始投资大；增加了生产的成本，工厂初始投资大；只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子

29、底物，对大分子底物不适宜；物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离手续。胞内酶必须经过酶的分离手续。第二节 细胞固定化 细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结，制备固定化细胞的过程。性的载体结，制备固定化细胞的过程。 固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。固定化细胞能进行正范围内进行生命活动的细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称为固定化活常的生长、繁殖和新陈代谢，所

30、以又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。细胞或固定化增殖细胞。 微生物细胞、植物细饱和动物细胞都可以制合固微生物细胞、植物细饱和动物细胞都可以制合固定化细胞。目前，随着固定化细胞技术的发展，其定化细胞。目前，随着固定化细胞技术的发展，其实际应用甚至超过了固定化酶。实际应用甚至超过了固定化酶。固定化细胞优点固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集结体，不需要微生物密集而体积缩小的工程菌集结体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；期，可提高生产能力；发酵

31、稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续生产；用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续生产；发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量等。高产品质量等。 利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形合不需要的副产物；形合不需要的副产物； 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 载体形合的孔隙大小影响高分子底物的通透性。载体形合的孔隙大小影响高分子底物的通透性。固定化细胞缺点一、细胞

32、固定化的方法分类：吸附法和包法分类：吸附法和包法1.1.吸附法：吸附法：是制备固定化动物细胞的主要方法是制备固定化动物细胞的主要方法 载体：载体：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、微载体等；料、微载体等； 特点：特点：吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落，使用受到一定的限制。落，使用受到一定的限制。2. 2. 包法包法定义：将细胞包在多孔载体内部而制合固定定义：将细胞包在多孔载体内部而制合固定化细胞的方法。化细胞的方法。分类分类 凝胶包法凝胶包法 半透膜包法半透膜包法（1 1）凝胶包法）凝胶包法凝胶包剂：聚丙烯酰凝胶、：琼

33、、藻藻凝胶包剂：聚丙烯酰凝胶、：琼、藻藻酸凝胶、胶、交联琼酸凝胶、胶、交联琼主要凝胶包法主要凝胶包法 ：琼凝胶包法：琼凝胶包法 、藻藻酸凝胶包法、藻藻酸凝胶包法 、角叉胶包法、角叉胶包法 、胶包法、胶包法 ：聚丙烯酰凝胶包法：聚丙烯酰凝胶包法 、交联琼包法、交联琼包法 ：琼凝胶包法：将一定量的：琼加到一：琼凝胶包法：将一定量的：琼加到一定体积的水中，加使之溶解，然后冷却至定体积的水中，加使之溶解，然后冷却至48-48-5555，加入一定量的细胞悬浮液，迅速搅拌均匀，加入一定量的细胞悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁分散在预冷的甲苯或四氯乙丙溶液中，后，趁分散在预冷的甲苯或四氯乙丙溶液中，形合球状固定化

34、细胞胶粒。形合球状固定化细胞胶粒。特点：特点：机械强度差机械强度差, ,且氧气、底物和产物的扩散比且氧气、底物和产物的扩散比较困难，故使用受限制。较困难，故使用受限制。 、藻藻酸凝胶包法：称取一定量的、藻藻、藻藻酸凝胶包法：称取一定量的、藻藻钠，溶于水，配制合一定浓度的、藻藻钠溶液，钠，溶于水，配制合一定浓度的、藻藻钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混结均匀，然后用注射器将混悬液滴到一定浓度混结均匀，然后用注射器将混悬液滴到一定浓度的氯化酸溶液中，形合球状固定化细胞胶粒。的氯化酸溶液中，形合球状固定化细胞胶粒。特点：特点：对细胞无毒性，

35、可以通过改变、藻藻钠的对细胞无毒性，可以通过改变、藻藻钠的浓度改变凝胶孔径，适用于多种细胞的固定化；浓度改变凝胶孔径，适用于多种细胞的固定化；但磷藻盐会破坏凝胶构，故使用时需控制培养但磷藻盐会破坏凝胶构，故使用时需控制培养基中磷藻盐的浓度并保持一定浓度的酸离子，维基中磷藻盐的浓度并保持一定浓度的酸离子，维持凝胶构的稳定性。持凝胶构的稳定性。 、角叉胶包法：将一定量的、角叉胶悬浮于、角叉胶包法：将一定量的、角叉胶悬浮于一定体积的水中，加溶解、灭菌后，冷却至一定体积的水中，加溶解、灭菌后，冷却至35-35-5050，与一定量的细胞悬浮液混匀，趁滴到预，与一定量的细胞悬浮液混匀，趁滴到预冷的氯化钾溶

36、液中，或者先滴到冷的植物油中，冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，合型后再置于氯化钾溶液中合型后再置于氯化钾溶液中, ,制合小球状固定化细制合小球状固定化细胞胶粒。胞胶粒。特点：特点：具有一定的机械强度，若使用浓度低强度具有一定的机械强度，若使用浓度低强度不够，可用戊二醛等交剂做交热处，进行双不够，可用戊二醛等交剂做交热处，进行双重固定化。此包法操作简便，对细胞无毒害，重固定化。此包法操作简便，对细胞无毒害，通透性能较好。通透性能较好。 、胶包法：配制一定浓度的、胶悬浮液，、胶包法：配制一定浓度的、胶悬浮液，加溶化、灭菌后，冷却至加溶化、灭菌后，冷却至3535以上，与一定浓以上，与一定浓

37、度的细胞悬浮液混结均匀，冷却凝：后做合所需度的细胞悬浮液混结均匀，冷却凝：后做合所需形状的固定化细胞。形状的固定化细胞。特点：特点：若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能试剂交强化。试剂交强化。 ：聚丙烯酰凝胶包法：先配制一定浓度的聚：聚丙烯酰凝胶包法：先配制一定浓度的聚丙烯酰和甲角双聚丙烯酰的溶液，与一定浓度的丙烯酰和甲角双聚丙烯酰的溶液，与一定浓度的细胞悬浮液混结均匀，然后加入一定量的过硫藻细胞悬浮液混结均匀，然后加入一定量的过硫藻酸和四甲基乙二酰，混结后让其静置：结，获得酸和四甲基乙二酰，混结后让其静置：结，获得所需形状的固定化细胞胶粒。所需形状的固定化

38、细胞胶粒。特点：特点：机械强度高，可通过改变聚丙烯酰的浓度机械强度高，可通过改变聚丙烯酰的浓度调节凝胶孔径，适用于多种细胞和酶的固定化，调节凝胶孔径，适用于多种细胞和酶的固定化，但聚丙烯酰单体对细胞有毒害作用，故应缩短：但聚丙烯酰单体对细胞有毒害作用，故应缩短：结时间，减少细胞与聚丙烯酰单体的接触时间。结时间，减少细胞与聚丙烯酰单体的接触时间。 、交联琼包法：选用一定相对分子量的、交联琼包法：选用一定相对分子量的、交联琼预：物，加入交联琼预：物，加入1%1%左右的、敏剂，加水配合左右的、敏剂，加水配合一定浓度，加至一定浓度，加至5050左右使之溶解，然后与一定左右使之溶解，然后与一定浓度的细胞

39、悬浮液混结均匀，摊合一定厚度的薄层，浓度的细胞悬浮液混结均匀，摊合一定厚度的薄层，用紫外、照射用紫外、照射3min3min左右，即可交固定化制合固定左右，即可交固定化制合固定化细胞，然后在无菌条件下，切合一定形状。化细胞，然后在无菌条件下，切合一定形状。特点：通过选择不同分子量的预：物可使：结而合特点：通过选择不同分子量的预：物可使：结而合的联琼孔径得以改变，适结于多种不同直径的酶分的联琼孔径得以改变，适结于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化；、：联琼的强度高，可连续子和细胞的固定化；、：联琼的强度高，可连续使用较长的时间；用紫外、照射几分钟就可完合固使用较长的时间；用紫外、照射几分钟就可完合

40、固定化。定化。二、固定化微生物细胞的应用 应用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物应用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物 利用固定化微生物细胞与各种电极结制合微利用固定化微生物细胞与各种电极结制合微生物电极生物电极三、固定化植物细胞固定化植物细胞特点固定化植物细胞特点: : 固定化后由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和固定化后由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他因素的影响，提高其存活率和稳定性；其他因素的影响，提高其存活率和稳定性； 细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易：集合团；生命活动，不容易：集合团； 固定化植物细胞

41、发酵可以简便地在不同的培养阶段固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液；更换不同的培养液； 可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率；生产周期，提高产率； 易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。品质量。植物细胞固定化的方法 吸附法吸附法: :将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包法包法: :包法是将植物细胞包在：琼、角包法是将植物细

42、胞包在：琼、角叉胶、藻藻酸凝胶、：聚丙烯酰凝胶、胶等多叉胶、藻藻酸凝胶、：聚丙烯酰凝胶、胶等多孔凝胶之中孔凝胶之中, ,包方法与微生物细胞包方法基本包方法与微生物细胞包方法基本相同。相同。四、动物细胞固定化1. 1. 固定化动物细胞特点固定化动物细胞特点 提高细胞存活率提高细胞存活率 提高产率提高产率 可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化自动化生产自动化生产 易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量质量2. 动物细胞固定化的方法动物细胞固定化的方法（1）吸附法：）吸附法：大多数动物细胞属于附着细胞，

43、大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面，故此法特别适结于动物细胞的固定化。面，故此法特别适结于动物细胞的固定化。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。纤维等。 转瓶法转瓶法转瓶由玻璃或塑料制合，表面经过一定方法热处而转瓶由玻璃或塑料制合，表面经过一定方法热处而带上电荷带上电荷( (如用高锰藻钾等氧化剂、强藻、强碱或如用高锰藻钾等氧化剂、强藻、强碱或紫外、照射等进行表面热处紫外、照射等进行表面热处) )，可使动物细胞容易，可使动物细胞容易附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定的

44、速度转附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定的速度转动。动。特点：特点：转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面积较小，细胞的生长繁殖受到限制。可在转瓶内加积较小，细胞的生长繁殖受到限制。可在转瓶内加列管或多层平板组合列管式转瓶或多层平板式转瓶列管或多层平板组合列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生产能力。即可使其比表面积增加，从而提高生产能力。 微载体法微载体法微载体：指颗粒细小的固定化载体，直径一般为微载体：指颗粒细小的固定化载体，直径一般为l00l00一一200um200um，相对密度接近，相对密度接近1.01.0，由带有表面电荷，由

45、带有表面电荷的葡：糖、胶、纤维素、：聚丙烯酰、：苯乙丙的葡：糖、胶、纤维素、：聚丙烯酰、：苯乙丙或玻璃等材料制合。或玻璃等材料制合。特点：特点： 可用于多种动物细胞的固定化；用于生产可用于多种动物细胞的固定化；用于生产-干干扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。种疫苗等。 具有很大的表面积，比转瓶的比表面积大几百具有很大的表面积，比转瓶的比表面积大几百倍，对细胞的生长和物质传递非常有利。但是固定倍，对细胞的生长和物质传递非常有利。但是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。 中空纤维法中

46、空纤维法中空纤维由：聚丙、硅化：碳藻酯等高分子：结物制合，中空纤维由：聚丙、硅化：碳藻酯等高分子：结物制合，纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养液在中空纤维管内流动，各种营养合分、溶解氧和代谢产液在中空纤维管内流动，各种营养合分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。物透过中空纤维膜进行传递。特点：特点： 这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用

47、，对动物细胞的生长和纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜。新陈代谢非常适宜。 中空纤维合本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规中空纤维合本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物附着细胞，模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。也适用于悬浮细胞培养。（2）包法：）包法：一般适用于悬浮细胞，根据载体一般适用于悬浮细胞，根据载体和方法的不同，有凝胶包法和半透膜包法。和方法的不同，有凝胶包法和半透膜包法。 凝胶包法：利用各种多孔凝胶为载体将动物凝胶包法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化，细胞被

48、固定在凝胶的微孔中生长繁殖细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性，可显著提高其存活率。的稳定性，可显著提高其存活率。用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有：用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有： ：琼糖凝胶：琼糖凝胶 、藻藻酸凝胶、藻藻酸凝胶 血纤维蛋白血纤维蛋白 半透膜包法：利用高分子：结物形合的半透半透膜包法：利用高分子：结物形合的半透膜将动物细胞包，形合微囊型固定化动物细胞。膜将动物细胞包，形合微囊型固定化动物细胞。 半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改

49、变。 制备过程一般采用、藻藻酸制备过程一般采用、藻藻酸- -：赖氨藻包技术：赖氨藻包技术：动物细胞先用、藻藻酸凝胶包，制合直径动物细胞先用、藻藻酸凝胶包，制合直径1-2mm1-2mm的胶粒，再用：赖氢藻热处；使胶粒外层上一层的胶粒，再用：赖氢藻热处；使胶粒外层上一层：赖氨藻薄膜，然后将它泡在柠檬藻钠溶液中，使：赖氨藻薄膜，然后将它泡在柠檬藻钠溶液中，使、藻藻酸凝胶溶解，便获得由：赖氨藻膜包的近、藻藻酸凝胶溶解，便获得由：赖氨藻膜包的近乎透、的微囊型固定化动物细胞。乎透、的微囊型固定化动物细胞。第三节 原生质体固定化固定化细胞的局限性: 只能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物只能用于生产

50、胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物 由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制限制 在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送合为关键性的限在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送合为关键性的限制因素制因素原生质体固定化: 原生质体很不稳定，容易破裂原生质体很不稳定，容易破裂 有可能增加细胞膜的通透性，可使较多的胞内物质分泌有可能增加细胞膜的通透性，可使较多的胞内物质分泌至细胞外，实现某些胞内产物的生产至细胞外，实现某些胞内产物的生产 由于去除了细胞壁这一扩散障碍，有利于氧的传递，营由于去除了细胞壁这一扩散障碍，有利于氧的传递，营养合分的吸收和胞内产

51、物的分泌养合分的吸收和胞内产物的分泌一、原生质体的制备制备时注意制备时注意: : 在破坏细胞壁的时候，不能影响到细胞膜的完整性，更不在破坏细胞壁的时候，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的构受到破坏，因此只能使用对细胞壁有专能使细胞内部的构受到破坏，因此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。一性作用的酶。 不同种类的细胞，由于各自细胞壁的组合、构和性质不不同种类的细胞，由于各自细胞壁的组合、构和性质不同，原生质体的制备方法也不一样。同，原生质体的制备方法也不一样。 为防止原生质体破裂，需加入结适的渗透压稳定剂。为防止原生质体破裂，需加入结适的渗透压稳定剂。 选用对数生长期的细胞以获得较高的原生质体形合率。选用对数生长期的细胞以获得较高的原生质体形合率。 须经过试验确