现代微生物学实验指导

1、实验一、微生物学基础实验实验1. 鞭毛染色法及活菌活动性暗视野显微镜观察【目的要求】1了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形态特征。2学习暗视野显微镜操作技术。 【实验器材】 菌种：枯草芽孢杆菌12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 溶液和试剂：硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01美兰水溶液。 仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子等。【基本原理】 细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1-0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法

2、，则在普通光学显微镜下也能看到它。 鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察。暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别

3、在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。 【操作步骤】 1鞭毛染色（硝酸银染色法） （1）载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。 （2）制片：在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，再在清水中

4、蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。 （3）染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面35min后用蒸馏水充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面4050秒，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。2、运动观察（1）使用研究用暗视野显微镜，或将普通光学显微镜上的聚光器取下，换上暗场聚光器。 （2）不论是使用干燥物镜还是油浸物镜，镜检时都应在聚光器的上透镜上加一大滴香柏油。 （3）将制作好的细菌悬滴标本片置于载物台上，上升聚光器至顶部使油与载玻片接触。 （4）放大光源 。 （4）进行聚光器光轴调节及调焦。用

5、10*物镜找到被检物像，关小聚光器虹彩光圈至可在视野中看到视场光阑的轮廓，再上下缓慢调整聚光器，这样会使视场光阑的像变得清晰，如视场光阑不在场中央，利用聚光器外侧 的两个调节钮进行调整，当亮光点调到场中央后，再将其开大，即可进行观察。 实验2. 荧光原位杂交技术【目的要求】 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法 【基本原理】 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生

6、物进行定量分析。下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。非生物学专业的同学请不要往下看了。【实验器材】Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200L移液器、20L移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。 【操作步骤】 1 载玻片涂层处理(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixa

7、tion）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛，置于4冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20冰箱保存。3 脱水 （Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridizati

8、on buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48Washing buffer(2) 在48恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。Hybridiz

9、ation buffer配制方法： Washing buffer配制方法：实验3. 细菌化学趋向性测定【目的要求】 通过研究细菌运动方式，了解细菌的趋向性. 通过研究细菌的趋向性，了解细菌的生 活方式，有利于微生物的培养。 【实验器材】 实验仪器:基显微镜、培养皿、载玻片、镊子、滤纸等。 试剂:琼脂培养基、,细菌、NACL试剂等。 【基本原理】 某些细菌在一定的生长因子下快速生长繁殖;某些细菌在一定的特殊环境下,例如:光 照、一定的PH、一定的温度下有利于生长.本实验通过对照试验对三种细菌进行在特殊因子下进行培养,观察细菌的运动趋势,并作出明确判断,细菌的化学趋向性。 【操作步骤】 1、取18

10、一24小时待检菌培养物,用0.9%NaCL配成浊度达20麦氏单位的浓悬液。 2、将琼脂溶化于0.9%的NACL溶液中,制成0.6%的琼脂基。 3、将此半固休琼脂溶化,冷却,待冷至40一50时,在3ml琼脂基中加入3 ml待检菌悬液,混匀,注入小培养皿中。 4、冷凝后在惊脂表面滴一滴5不同浓度的化学趋向性试验物质,并在另一部位滴加等量0.9%NaCI作为对照。 5、37孵育1小时,检查滴加试验物质部分浊度变化。浊度增加为阳性趋化性,局部透亮为阴性趋化性。再用配有测微器的显微镜测是浊度变化区的直径。 6、也可用直径1mm的滤纸片,用试验物溶液润湿,并贴敷于惊脂基表面,观察结果(标准同上)此类纸片于

11、37干燥后,在4可长期保存。 以类鼻疽杆菌,绿脓杆菌,霍乱弧菌各一株作为试验菌。结果类鼻疽杆菌和绿脓杆菌对。.IML一精氨酸,。.IM DL一颗氨酸,0.IML一异亮氨酸等都有阳性趋化作用。类奥疽杆菌对。.IML一半胧氨酸有阳性趋化作用。 7、实验结果及预测 通过实验对照可以证明细菌的趋向性。实验二、分子生物学技术在微生物学中的应用实验1. 土壤微生物总DNA提取【目的要求】 学习从土壤微生物中提取总DNA并纯化的方法。【实验器材】 TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)、PBS缓冲液(

12、137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)、DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)、蛋白酶K(25 mg/mL)、溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)、20% SDS、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNAse 20 mg/mL、QIAX大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)50mL、1.5 mL离心管、摇床、高速离心机、水浴锅、电泳槽、电

13、泳仪、涡旋仪、土壤样品【操作步骤】 1. 总DNA提取：(1) 取2 g土样，置于50mL灭菌的离心管中；(2) 加入10 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；(3) 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；(4) 用5 mL PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一

14、次；(5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混匀后加入100 L蛋白酶K(25 mg/mL)和200 L溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；(6) 加入2 mL 20% SDS，65水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；(7) 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次；(8) 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4沉淀过

15、夜；(9) 11 000 r/min 4离心20 min收集DNA沉淀；(10) 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 L ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，转入1.5 mL离心管。2. 总DNA纯化：(1) 配制0.8%琼脂糖凝胶；(2) 每个上样孔加入50 L粗DNA，进行低电压长时间电泳(4, 25 V, 8 h)；(3) 电泳结束后，切下主带所在的凝胶(胶的体积尽可能小)；QIAX大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收：加入3倍体积的Buffer QX及适量的QIAX(Glassmilk)，55温浴10 min，每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀(回收大片段时不要涡旋)，

16、待凝胶完全溶解，12 000 g离心1 min，弃上清；再加入500 L Buffer QX洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶；再用500 L Buffer PE洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O，离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。实验2. 菌落PCR【目的要求】学习菌落pcr方法，比较菌落PCR和常规PCR差别。 【基本原理】 菌落PCR可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。菌落PC

17、R与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快捷，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。【操作步骤】 1、PCR混合液的制备Taq buffer（10×） 180uldNTP（2.5 mM） 2025 ulPrimer Forward（引物浓度在10Pmol） 5 ulPrimer Reverse（引物浓度在10Pmol） 5 ulddH2O 147 ulTaq（2U/ul） 1215 ul2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落（强调单个，不能是双克隆），在LB琼脂糖平板上轻点，做

18、一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR管中或者96空pcr反应板（管子做好记号，如平板上点的是1#，则管子上也标1#，以便筛选到克隆后的扩到培养），挑好单克隆菌落后将之前配制好的PCR混合液加入体系是30ul。3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。4、将扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。5、将已经接种有菌落的平板置37培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定

19、向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。实验3. 16S rDNA序列分析鉴定【目的要求】1. 了解PCR 反应

20、的基本原理和应用2. 学习PCR的基本实验方法【实验器材】 【操作步骤】 1. 模板DNA的提取1）挑取单菌落接种至50 mL MRS液体培养基中，28、180 r/min摇床培养24 h； 2）取1.5 mL培养物离心，12000 r/min、1 min收集菌体，加入STE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，再次离心，菌体重悬于1 mL STE溶液中； 3）加入100 mg/mL溶菌酶溶液1 L（终浓度为100 g/mL），37保温1 h2 h； 4）加入1/10体积10% SDS溶液，混合均匀，静置片刻，6065水浴，不超过10 min； 5）加入1/10体积5 mol/L NaCl，至终浓度

21、为1 mol/L，充分混匀； 6）加入等体积的Tris平衡酚，混匀，12000 r/min离心5 min，取上清于另一洁净离心管中，重复操作一次； 7）上清液中加入等体积的氯仿，混匀，离心12000 r/min、5 min，取上清于另一个洁净的离心管中； 8）加入2倍体积的无水乙醇沉淀，-20静置30 min以上，离心，12000 r/min、 5 min； 9）70%乙醇洗涤2次，室温晾干； 10）冷冻抽干，于-20保存备用。 2. 16S rDNA的PCR扩增以提取的各菌株的DNA为模板，采用通用引物P0（5-GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3）和PC3（5-CTAHAGGGTA

22、TCTAATCCT-3），扩增各菌株的16S rDNA序列，PCR 反应体系见表9.1。表7-1 PCR反应体系的配制 反应物 加入体积（L） 终浓度 10×Buffer（含MgCl2） 2.5 1× dNTP（10 mmol/L） 2.5 1 mol/L P0 （100 mmol/L） 0.75 3 mol/L PC3（100 mmol/L） 0.75 3 mol/L 模板DNA 1.0 1 g Taq酶 0.25 ddH2O 补加到总体积25 L PCR程序为：94预变性3 min，94变性1 min，45复性1 min，72延伸1 min，循环30次，72延伸8 mi

23、n，4保温3 min。PCR扩增结果，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3. PCR产物的纯化及序列分析PCR产物按Omega Bio-Tek公司试剂盒操作方法纯化后，寄给北京奥科生物技术有限公司或上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序，测序引物为P0、PC3。将序列结果提交到GenBank 数据库（http：//BLAST） 中搜索比对。实验4. 酶切与连接技术 【目的要求】 1、 将成功扩增出所需基因片段的PCR产物纯化回收，除去DNA以外的杂质，如蛋白（酶）、 RNA等，得到高质量的DNA用于后续实验。 2、 将纯化好的DNA和表达型载体分别酶切后连接，

24、用于后续转化感受态细胞。 【实验器材】 选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶，识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。 【基本原理】 【操作步骤】 1、PC

25、R产物回收 （1）于PCR产物中加入其两倍体积的Binding Buffer，即80ul。然后转入2ml的收集管中（带柱子），13000r，1min，离心，弃去收集管中滤液。 （2）加Binding Buffer 300ul，13000r，1min，离心，弃去收集管中滤液，此时DNA挂于柱子上。 （3）加Wash Solution 700ul，13000r，1min，离心，弃去收集管中滤液。 （4）重复步骤（3），此时已把DNA以外的杂质洗脱完毕。 （5）将柱子装入1.5ml的EP管中，加50ul，60的水洗脱DNA，13000r，1min，离心。 2、将回收所得产物酶切 （1）上游引物：Nc

26、ol 下游引物：Xhol 适应温度：37Buffer4 50ul体系： Ncol：0.5ul Xhol：0.5ul 10xBuffer4：5ul DNA片段：44ul 放入37水浴锅酶切2.5小时。 （2）所得酶切产物按上述纯化方法再次纯化回收。 3、将DNA片段与载体连接 (1)20ul体系： 10xBuffer：2ul T4连接酶：2ul 载体：2ul DNA片段：14ul放入37温箱过夜。 （2）回收所得连接产物。实验5. 琼脂糖凝胶电泳技术 【目的要求】 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【基本原理】 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂

27、糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓

28、度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4与30之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4条件下电泳

29、。 (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。【实验器材】 1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪

30、 1.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝 5.蔗糖 6.琼脂糖 7.溴化乙锭 8.DNA marker 9.DNA样品【操作步骤】 1.缓冲液的配制 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000ml 5×TBE:Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA20mlPh8.0 凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%溴化乙锭溶液(EB) 0.5g/ml2.制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围0.3%5-60 kb0.6%1-20 kb0.7%0.8-10 kb0.9%0.5-7kb1.2%0.4-6kb1.5%0.2-4kb2.0%0.1-3kb3.胶板的制备(1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。(2) 配制足够用于灌满电泳