第二章DNA复制

1、能量能量看守看守DNTP胶水胶水生产检验河南师范大学河南师范大学1 1、原核生物和真核生物、原核生物和真核生物DNADNA的复制会一样吗？的复制会一样吗？2 2、DNADNA复制时是两条链都做模板吗？如果是的复制时是两条链都做模板吗？如果是的 话如何解决两条链的方向问题？话如何解决两条链的方向问题？3 3、DNADNA链为什么不选择链为什么不选择3-53-5的方向延伸呢？的方向延伸呢？4 4、DNADNA复制都需要那些酶？他们是如何起作用复制都需要那些酶？他们是如何起作用 的？的？5 5、线性、线性DNADNA复制的复制的55末端隐缩问题是如何解决的末端隐缩问题是如何解决的6 6、DNADNA

2、的复制是如何保证其准确性的？意义何的复制是如何保证其准确性的？意义何 在？在？河南师范大学河南师范大学l第一节第一节 DNADNA的半保留复制的半保留复制l第二节第二节 复制原点、方向、和方式复制原点、方向、和方式l第三节第三节 DNADNA复制的酶学复制的酶学l第四节第四节 DNADNA的半不连续复制的半不连续复制l第五节第五节 真核生物真核生物DNADNA的复制的复制l第六节第六节 DNADNA复制的错误校对复制的错误校对河南师范大学河南师范大学 单独复制的单独复制的DNADNA单元称为复制子（单元称为复制子（Replicon ），原核），原核细胞的复制子就是细菌染色体本身，每个真核细胞染

3、色细胞的复制子就是细菌染色体本身，每个真核细胞染色体都包含有大量的复制子。体都包含有大量的复制子。河南师范大学河南师范大学l1958 1958 年年Meselson-Stahl experiment using 15N (the Heavy isotope) and 14N (the Light isotope) to grow E. coli cells 证明证明了了DNADNA的复制是半保留复制的复制是半保留复制 DNA 可能的三种复制模式可能的三种复制模式河南师范大学河南师范大学河南师范大学河南师范大学15N15Nl复制原点：复制原点： （replication origins）一般用一

4、般用o或者或者ori表示，是表示，是DNA的复制起始位置。结构特点：的复制起始位置。结构特点：DNA呼吸作用强烈的区段，富含呼吸作用强烈的区段，富含AT Whyl复制方向：复制方向：从特定位置开始的双向或者单向从特定位置开始的双向或者单向l复制方式：复制方式：复制叉式（复制叉式（复制）复制） 滚环式复制滚环式复制Replication fork is the point at which strands of parental duplex DNA are separated so that replication can proceed.河南师范大学河南师范大学The electron mi

5、crograph of the replicationintermediate of a plasmid DNA is -shaped.河南师范大学河南师范大学Replicated DNA is seen as a replication eye flanked by nonreplicated DNA.河南师范大学河南师范大学 从两个复制原点开始的单向单链复制从两个复制原点开始的单向单链复制 从一个复制原点开始的单向双链复制从一个复制原点开始的单向双链复制 从一个复制原点开始的双向双链复制从一个复制原点开始的双向双链复制河南师范大学河南师范大学 DNA DNA 复制是核苷酸链的不断生长，那就

6、需要将复制是核苷酸链的不断生长，那就需要将四种四种脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸在在酶酶的作用下通过磷酸二酯键的作用下通过磷酸二酯键连接在一起。连接在一起。l一、一、脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸的来源的来源（生物化学（生物化学 ）：）：l二、二、酶酶河南师范大学河南师范大学DNA Pol I catalyzes the 5 to 3 elongation of the new strand河南师范大学河南师范大学The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the bi

7、ological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid Arthur Kornberg Stanford University Stanford, CA, USA Severo Ochoa New York University; College of Medicine New York, NY, USA 河南师范大学河南师范大学l废物利用：废物利用：体内核酸降解或者直接来自培养体内核酸降解或者直接来自培养基基l新合成新合成：（参考生物化学） 注意dTTP的合成，dUTP的渗入阻止河南师范大学河南师范大学1 1、一个能够

8、在模板链上合成新的、一个能够在模板链上合成新的DNADNA链的酶叫做链的酶叫做DNADNA聚合酶聚合酶。原核和真核生物中都包含有多种。原核和真核生物中都包含有多种DNADNA聚合聚合酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制的；有时候把这些酶叫做的；有时候把这些酶叫做DNADNA复制酶复制酶。2 2、一个所有、一个所有DNADNA聚合酶都具有的特点是：它们不能够聚合酶都具有的特点是：它们不能够从自由的核苷开始初始化从自由的核苷开始初始化DNADNA链的合成。它们需要链的合成。它们需要一个引物提供一个自由的一个引物提供一个自由的3-OH3-OH端可以

9、加入核苷。端可以加入核苷。3 3、原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶目前发现的主要有三种：分目前发现的主要有三种：分别是别是PolPol、PolPol和和PolPol河南师范大学河南师范大学Only one DNA polymerase is the replicase. The others participate in repair of damaged DNA.河南师范大学河南师范大学 DNA polymerase I 有四种主要的活性有四种主要的活性: 1、 Polymerase (DNA repair and RNA primer replace); 2、 3 5 exon

10、uclease (proofreading) ;3、 5 3 exonuclease ( removing RNA primers and damaged DNA fragments) 4、 endonuclease （DNA repair ）河南师范大学河南师范大学lPolPol是是DNADNA链延长的主要的聚合酶，是一个复杂的多链延长的主要的聚合酶，是一个复杂的多亚基酶，它的活性主要有：亚基酶，它的活性主要有： 1、 Polymerase (DNA replication ); 2、 3 5 exonuclease (proofreading) ;3、 5 3 exonuclease (

11、damaged DNA fragments) 河南师范大学河南师范大学1、Polymerase ： PolPol主要是主要是DNADNA的修复和的修复和RNARNA引物引物的替换；的替换； PolPol主要是负责链的延伸主要是负责链的延伸2、3 5 exonuclease： PolPol和和PolPol都具有该活性，都具有该活性，主要是保证聚合作用的正确性，起校对作用，他的主要是保证聚合作用的正确性，起校对作用，他的意义还在于它对于意义还在于它对于DNADNA作为遗传物质的稳定性和极作为遗传物质的稳定性和极高的保真度是非常重要的。高的保真度是非常重要的。53河南师范大学河南师范大学35外切酶作

12、用位点外切酶作用位点AC3、5 3 exonuclease: PolPol和和PolPol都具有该活性但是区别较大：都具有该活性但是区别较大：（1 1） Pol Pol 5 3外切活性外切活性只能作用于单链只能作用于单链DNADNA（2 2） PolPol的外切活性不能作用于单链的外切活性不能作用于单链DNADNA，只要是具有，只要是具有5-5-磷酸末端的磷酸末端的DNA PolDNA Pol就可以起作用就可以起作用（3 3） PolPol外切核苷酸是一个一个切去；外切核苷酸是一个一个切去；（4 4） PolPol不仅可以外切不仅可以外切DNADNA，也可以外切，也可以外切RNARNA，在复制

13、中就是用，在复制中就是用 PolPol切去切去RNARNA引物的。引物的。535335 Pol Pol355335 Pol Pol5335河南师范大学河南师范大学4 4、PolPol还具有内切酶活性，它可以从还具有内切酶活性，它可以从5-5-磷酸末端切去磷酸末端切去 单链的单链的DNADNA53PolPol水解位点水解位点35河南师范大学河南师范大学DNA polymerase I 和和 nick translation l切刻切刻（NickNick）：双链：双链DNADNA中一条上的磷酸二酯键的断裂，但中一条上的磷酸二酯键的断裂，但是并没有缺少碱基或者核苷酸。是并没有缺少碱基或者核苷酸。l切

14、刻平移切刻平移（ Nick translationNick translation）：在：在DNA polymerase I DNA polymerase I 的聚合活性和的聚合活性和5 3 5 3 外切酶活性同时作用下，使双链外切酶活性同时作用下，使双链DNADNA上的切刻沿着上的切刻沿着5 3 5 3 方向有一个位置移动到另一位置，方向有一个位置移动到另一位置，这一过程称为切刻平移。这一过程称为切刻平移。河南师范大学河南师范大学l作用：作用：将相邻的将相邻的3-OH3-OH和和5-P5-P形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键l条件：条件：必须是相邻的必须是相邻的3-OH3-OH和和55P P； 必

15、须是各自的碱基处于配对状态下必须是各自的碱基处于配对状态下55333355NickNick55333355NickNick55333355NickNick55333355OHPAC河南师范大学河南师范大学l螺旋酶（螺旋酶（helicaseshelicases）：）：又称解旋酶，有两种，在又称解旋酶，有两种，在DNADNA复制中需要螺旋酶复制中需要螺旋酶，它常常与，它常常与SSBSSB（单链（单链DNADNA结合蛋白）配合，防止链间或者链内退火，需要结合蛋白）配合，防止链间或者链内退火，需要ATPATP能量。能量。lDNADNA旋转酶（旋转酶（DNA gyraseDNA gyrase）：）：目前

16、只在原核生物中目前只在原核生物中发现，属于拓扑异构酶发现，属于拓扑异构酶，它可以引入负超螺旋同，它可以引入负超螺旋同时断裂并连接双股时断裂并连接双股DNADNA，需要，需要ATPATP能量。能量。河南师范大学河南师范大学Single-stranded DNA is needed for replicationlSSB ：single-strand DNA binding proteinl作用：阻止已经解开的双链链间或者链作用：阻止已经解开的双链链间或者链 内退火内退火河南师范大学河南师范大学1 1、 DNADNA的半不连续复制的发现的半不连续复制的发现2 2、引物、引发酶和引发体、引物、引发酶

17、和引发体3 3、原核生物半不连续复制的过程、原核生物半不连续复制的过程4 4、几种噬菌体的复制过程、几种噬菌体的复制过程河南师范大学河南师范大学lDNADNA链的生长方向是从链的生长方向是从5-35-3的，那么的，那么DNA DNA 的复制就可能有几种方式：的复制就可能有几种方式：335555555533子代链子代链ABC3 5 3 3 5 3 553 5 3 3 5 3 55河南师范大学河南师范大学几个概念几个概念 Lagging strand of DNA must grow overall in the 3-5 direction and is synthesized discontin

18、uously in the form of short fragments (5-3) that are later connected covalently.Leading strand of DNA is synthesized continuously in the 5-3 direction.Okazaki fragments are the short stretches of 1000-2000 bases produced during discontinuous replication; they are later joined into a covalently intac

19、t strand.1968年冈琦发现的因此称为年冈琦发现的因此称为Okazaki fragments lSemidiscontinuous replication is mode in which one new strand is synthesized continuously while the other is synthesized discontinuously.河南师范大学河南师范大学Priming is required to start DNA synthesisl DNA DNA聚合酶不能初始一个脱氧核糖核酸链，必须要由一聚合酶不能初始一个脱氧核糖核酸链，必须要由一个引导行

20、为提供一个自由的个引导行为提供一个自由的3-OH3-OH端开始前导链和后随链端开始前导链和后随链的合成。前导链只需要一次这样的初始事件，是在复制起的合成。前导链只需要一次这样的初始事件，是在复制起点开始的。但是后随链必须要有一系列的初始事件。因为点开始的。但是后随链必须要有一系列的初始事件。因为每一个冈崎片段都需要自己重新开始。每一个冈崎片段都每一个冈崎片段都需要自己重新开始。每一个冈崎片段都是由一个引物开始的。这个引物可以具有多种形式：是由一个引物开始的。这个引物可以具有多种形式：河南师范大学河南师范大学河南师范大学河南师范大学Priming is required to start DNA

21、 synthesisA DNA polymerase requires a 3-OH end to initiate replication.河南师范大学河南师范大学l起始起始l延伸延伸l终止终止河南师范大学河南师范大学Initiation requires several enzymatic activities, including helicases, single-strand binding proteins, and synthesis of the primer.河南师范大学河南师范大学河南师范大学河南师范大学河南师范大学河南师范大学l单链环形单链环形DNADNA噬菌体：噬菌体：

22、M13M13、G4G4、174174l双链线性双链线性DNADNA噬菌体：噬菌体：T7T7l双链环状双链环状DNADNA噬菌体：噬菌体：噬菌体噬菌体l哺乳动物线粒体哺乳动物线粒体DNADNA的复制：的复制：D D噜噗滚环复制噜噗滚环复制 D D噜噗（噜噗（D-loopD-loop）：）：DNADNA在复制起点开始复制时，总是先出在复制起点开始复制时，总是先出现一个复制泡，其中先导链已经引发并开始合成，与其摸板形成现一个复制泡，其中先导链已经引发并开始合成，与其摸板形成双链结构，而另一条亲本链则被先导链置换出来。这样的由一条双链结构，而另一条亲本链则被先导链置换出来。这样的由一条单链和一条双链组

23、成的单链和一条双链组成的三元泡状结构三元泡状结构称为称为D D噜噗噜噗河南师范大学河南师范大学The D loop maintains an opening in mammalian mitochondrial DNA, which has separate origins for the replication of each strand.河南师范大学河南师范大学l1 1、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶l2 2、真核生物、真核生物DNADNA复制过程复制过程l3 3、线性、线性DNADNA复制结束后的复制结束后的55末端隐缩问题末端隐缩问题河南师范大学河南师范大学l聚合酶主

24、要有四种：聚合酶主要有四种：、。目前发现除聚合酶。目前发现除聚合酶外外其它三种聚合酶只有聚合作用，聚合酶其它三种聚合酶只有聚合作用，聚合酶除了聚合作用外还有除了聚合作用外还有3355外切活性。外切活性。l它们的主要生物学作用是：它们的主要生物学作用是： 聚合酶聚合酶、协同作用主要是负责协同作用主要是负责DNADNA复制的复制的 聚合酶聚合酶作用不明可能是作用不明可能是DNADNA修复有关修复有关 聚合酶聚合酶主要是负责线粒体主要是负责线粒体DNADNA复制的，因为它是目前发现复制的，因为它是目前发现的唯一存在于线粒体中的的唯一存在于线粒体中的DNADNA聚合酶聚合酶 真核生物细胞中真核生物细胞

25、中DNADNA聚合酶分子数目要比原核的多聚合酶分子数目要比原核的多河南师范大学河南师范大学l DNA replication in eukaryotic cells use essentially the same principles but more complex in the details. l真核生物真核生物DNADNA复制过程是一个更为复杂的过复制过程是一个更为复杂的过程，仍有许多的未解之谜，比如复制的引发程，仍有许多的未解之谜，比如复制的引发复合体，复合体， 55末端隐缩问题等末端隐缩问题等河南师范大学河南师范大学l环状环状DNADNA：不存在此问题不存在此问题l线状线状DNA

26、DNA： 噬菌体：噬菌体：末端冗余，形成连环分子末端冗余，形成连环分子 腺病毒：腺病毒：在其末端存在一个末端蛋白，它的丝在其末端存在一个末端蛋白，它的丝氨酸有一个活性氨酸有一个活性-OH-OH，可以和，可以和5-P5-P形成磷酸二酯键，形成磷酸二酯键，补平因末端补平因末端RNARNA引物去除留下的空白引物去除留下的空白 真核生物：真核生物：端粒端粒河南师范大学河南师范大学l 复制的精度依赖于碱基配对的准确性。然而，当我们考复制的精度依赖于碱基配对的准确性。然而，当我们考虑到碱基配对所涉及到的一些反应的时候，实际上细菌中的虑到碱基配对所涉及到的一些反应的时候，实际上细菌中的错误率看起来大约为错误

27、率看起来大约为1010-8-8-10-10-10-10。这相当于每一个基因组的每。这相当于每一个基因组的每10001000次复制才只有大约一次错误，或者是每一个基因的每一次复制才只有大约一次错误，或者是每一个基因的每一代的错误率相当于代的错误率相当于1010-6-6。l DNADNA聚合时的错误来源主要有两个：一是错误的碱基配聚合时的错误来源主要有两个：一是错误的碱基配对；二是读框移码，即多余的碱基被加入或者是一个核苷酸对；二是读框移码，即多余的碱基被加入或者是一个核苷酸被漏加入时发生。被漏加入时发生。河南师范大学河南师范大学lDNADNA聚合酶的碱基选择作用和对底物的识别作用聚合酶的碱基选择作用和对底物的识别作用