基因工程和基因重组

1、第十四章 基因重组与基因工程内容提要：细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用。通过自动获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。由病毒携带将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。重组DNA技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基因的结构与功能，从构建的基因组DNA文库或cDNA文库分离、扩增某一感兴趣的基因就

2、是基因克隆或分子克隆，又称重组DNA技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1分，即目的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几种途径：化学合成、PCR技术、基因组文库或cDNA文库中获得。载体是目的基因的携带者，常用的载体有质粒、噬菌体等。2切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，是实现重组DNA技术的重要的工具酶。3接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组DNA）。4转，即将重组体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、转染及感染。5筛，即重组体的

3、筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和Southern印迹或免疫学方法对抗药菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组DNA获得基因克隆。重组DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。一、选择题【A型题】1下列DNA序列属于回文结构的是 （ ）AATGCCG TACGGCBGAATTC CTTAAGCGGCCGG CCGGCCDTCTGAC AGACTGECTAGGG GATCCC2DNA经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾

4、相接，自行成环。这是因为存在着（ ）A钝性末端 B平端 C粘性末端 D5端 E3端3限制性内切核酸酶的通常识别序列是（ ）A粘性末端 B聚腺苷酸 C回文对称序列 DRNA聚合酶附着点 E甲基化“帽”结构4pBR322是 （ ）A经人工改造的大肠杆菌质粒 B天然的大肠杆菌质粒 C天然的酵母质粒 D经人工改造的大肠杆菌噬菌体 E经人工改造的酵母质粒5免疫球蛋白的生成是通过以下哪个过程（ ）A转化 B转导 C转染 D转位 E溶原6常用载体-质粒的特点（ ）A是线形双链DNAB插入片断的容纳量比噬菌体DNA大C含有抗药性基因D含有同一限制性内切核酸酶的多个切口E不随细菌繁殖而进行自我复制7基因工程的操

5、作程序可概括为（ ）A切、转、接、筛、分 B转、接、筛、分、切 C接、筛、分、切、转 D筛、分、切、转、接 E分、切、接、转、筛8cDNA文库指（ ）A一个生物组织和细胞的全部基因信息 B一个生物组织和细胞的全部mRNA信息C一个生物组织和细胞所表达的mRNA信息 D一个物种的全部mRNA信息E一个物种的全部基因信息9限制性内切核酸酶（ ）A可将单链DNA任意切断 B由噬菌体提取而得 C可将双链DNA序列特异地切开 D可将两个DNA分子连接起来 E不受DNA甲基化影响10在重组DNA技术中，不常用的酶是（ ）A限制性内切核酸酶 BDNA聚合酶 CDNA连接酶 D反转录酶 EDNA解链酶11可作

6、为重组DNA的目的基因的是（ ）AmRNA BtRNA CrRNA D基因组DNA EmRNA和基因组DNA12以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称（ ）A转化 B转染 C感染 D转导 E转移13最常用的筛选转化细菌是否含质粒的方法是（ ）A营养互补筛选 B抗药性筛选 C免疫学方法 DPCR筛选 E分子杂交筛选14-互补筛选法属于（ ）A抗药性标志筛选 B酶免检测分析 C标志补救筛选 D原位杂交筛选 E免疫学方法15F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为（ ）A 转化 B转导 C转染 D转座 E接合16由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为（ ）A转化 B转导 C转染 D

7、转座 E接合17发生在同源序列间的重组称为（ ）A位点特异的重组 B 非位点特异的重组 C基本重组 D随机重组 E人工重组18在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA（ ）A聚合酶 B解链酶 C连接酶 D拓扑酶 E内切酶19在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指（ ）A建立单克隆抗体 B建立多克隆抗体 C构建重组DNA分子 D无性繁殖DNA E有性繁殖DNA20无性繁殖依赖DNA载体的最基本性质是（ ）A青霉素抗性 B卡那霉素抗性 C自我复制能力 D自我转录能力 E自我表达能力21在已知序列的情况下获得目的DNA最常见的是（ ）A化学合成法 B筛选基因组文库 C筛选cDNA文库 D聚

8、合酶链式反应 EDNA合成仪合成 22重组DNA技术领域常用的质粒DNA是（ ）A细菌染色体DNA的一部分 B细菌染色体外的独立遗传单位 C病毒基因组DNA的一部分 D真核细胞染色体DNA的一部分 E真核细胞染色体外的独立遗传单位23直接针对目的DNA进行筛选的方法是（ ）A青霉素抗药性 B氨苄青霉素抗药性 C分子杂交 D分子筛 E电泳24“克隆”某一目的DNA的过程不包括（ ）A基因载体的选择与构建 B外源基因与载体的拼接 C重组DNA分子导入受体细胞D筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞 E表达目的基因编码的蛋白质25表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是（ ）AEcoli表达体系 B原核表达体

9、系 C酵母表达体系 D昆虫表达体系 E哺乳类细胞表达体系26不能用作克隆载体的DNA是（ ）A质粒DNA B噬菌体DNA C细菌基因组DNA D腺病毒DNA E逆转录病毒DNA27关于重组体的叙述，下列哪项是错误的（ ）A包括外源性的目的基因 B包括载体 C重组体有独立繁殖的能力 D重组体要回到细胞水平表达 E目的基因和载体通过连接酶连接28基因组代表一个细胞或生物体的（ ）A. 部分遗传信息 B整套遗传信息 C可转录基因 D非转录基因 E可表达基因29下列常用于原核表达体系的是（ ）A酵母细胞 B昆虫细胞 C哺乳类细胞 D真菌 E大肠杆菌30构建基因组DNA文库时，首先需分离细胞的（ ）A.

10、 染色体DNA B线粒体DNA C总mRNA DtRNA ErRNA31构建cDNA文库时，首先需分离细胞的A. 染色体DNA B线粒体DNA C总mRNA DtRNA ErRNAB.【X型题】1限制性内切核酸酶作用特性是（ ）A在对称序列处切开DNA BDNA两链的切点常不在同一位点C酶切后产生的DNA片段多半具有粘性互补末端DDNA两链的切点常在同一位点 E限制酶通常识别46碱基对，有些识别8个或8个以上碱基对2一般来说限制性内切核酸酶（ ）A只识别一种核苷酸序列 B其识别不受DNA来源的限制C不同生物的DNA经同一限制性内切核酸酶切割后产生相同末端D对双链DNA和单链DNA一视同仁 E可

11、识别多种不同的核苷酸序列3经限制性内切核酸酶切割后的DNA可产生以下哪些情况（ ）A产生带有5磷酸基团的伸出股 B产生3-OH的伸出股C粘性末端 D钝性末端 E以上均不对4大肠杆菌质粒经ECoR切割后，可与经ECoR切割后的目的DNA重组结合，为得到重组体，需经（ ）A加热 B混合 C退火 DRNA连接酶催化 EDNA连接酶催化5有关载体和目的基因连接方法的叙述，正确的是（ ）A平端切口可直接连接 B平端切口可采用“尾接法” C载体与目的基因通过非共价键连接D利用人工连接器也可连接 E需要DNA连接酶参与6自然界基因转移可能伴发基因重组的有（ ）A接合作用 B转化作用 C转导作用 D转座 E以

12、上都不是7在分子克隆中，目的DNA可来自（ ）A原核细胞染色体DNA B真核细胞染色体DNA C真核细胞mRNA反转录获得的cDNA D聚合酶链反应 E人工合成的DNA8从基因组DNA文库或cDNA文库分离、扩增某一感兴趣基因的过程就是（ ）A基因克隆 B分子克隆 C重组DNA技术 D构建基因组DNA文库 E构建cDNA文库9可用作克隆基因载体的DNA有（ ）A细菌质粒DNA B噬菌体DNA C病毒DNA D酵母人工染色体 E真核细胞基因组DNA10将重组DNA分子导入受体细菌的方法有（ ）A. 接合 B转座 C转化 D转染 E感染11下述操作可能用于DNA克隆过程的是（ ）ADNA的制备和降

13、解 B不同来源DNA的拼接 C核酸分子杂交 D细菌的生长和繁殖 ERNA的制备12关于质粒DNA的叙述正确的是（ ）A是基因组DNA的组成部分 B具有独立复制功能 C可以赋予宿主细胞额外的生物学特性D含有感兴趣的目的DNA E含有各种抗生素抗性基因13重组DNA时，外源基因又称（ ）A目的基因 B目的RNA C目的DNA D外源RNA E重组DNA14作为载体的质粒应具备下列哪些特点（ ）A分子量相对小 B常用的质粒载体有pBR322和pUC系列等C用作基因工程载体的常是接合型质粒D在复制子以外的适当位置，存在几个单一的限制性内切核酸酶位点E具有插入失活的筛选标记15载体必需具备下列哪些特点（

14、 ）A本身是一个复制单位，具有复制起点 B插入外源性DNA后并不影响载体本身的复制C进入细胞后用本身的酶系进行复制 D易进入受体细胞 E易于鉴定和筛选16DNA重组的步骤包括（ ）A用PCR技术合成大量的重组DNA B用连接酶将外源性DNA与载体连接C通过转化将重组DNA引入受体细胞 D培养细胞以扩增重组DNA E筛选出含有重组体的克隆二、填空题1通过自动获取或人为地供给外源_，使细胞或培养的受体细胞获得新的_，这就是转化作用。2由_和_介导的基因移位或重排，称为转座。3基因重组包括_、_和_等类型。4依赖整合酶，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称_。5发生在同源序列间的重组称为_，又称

15、_。6一个完整的基因克隆过程应包括：目的基因的获取，_的选择与改造，_的连接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选出含感兴趣基因的重组DNA转化细胞。7限制性内切核酸酶是一类识别_的_核酸酶。8科学家感兴趣的外源基因又称_，其来源有几种途径：化学合成、酶促合成cDNA、制备的基因组DNA及_技术。9根据采用的克隆载体性质不同，将重组DNA分子导入细菌的方法有_、_及感染。三、名词解释8 / 81DNA克隆2cDNA文库（cDNA library）3基因组DNA文库（genomic DNA library）4Plasmid5回文结构6Vector7目的基因8restriction endonucle

16、ase四、简答题1何谓DNA克隆？试述DNA克隆的基本过程。2试述基因组文库的定义和制备方法。3试述质粒的特性及天然质粒作为基因载体必须具备的条件。参考答案一、选择题【A型题】1B 2C 3C 4A 5D 6C 7E 8C 9C 10E 11D 12A 13B 14C 15E 16D 17C 18C 19D 20C 21D 22B 23C 24E 25E 26C 27C 28B 29E 30A 31C【X型题】1ABCE 2ABC 3ABCD 4BCE 5ABDE 6ABCD 7ABCDE 8ABC 9ABCD 10CDE 11ABCDE 12BC 13AC 14ABDE 15ABDE 16B

17、CDE解析【A型题】1B 考察要点为回文结构特点。回文结构是指该DNA片段的碱基序列在其互补链上正读、反读都相同。6C 考察要点为质粒的特点。常见错误选D或E。质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，其本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，又依赖细菌的繁殖而复制。理想的质粒对同一限制性内切核酸酶只有一个切口。质粒往往带有一个或一个以上的抗药性基因，根据质粒赋予细菌的表型，可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据，这是质粒作为载体的特性。质粒的分子小于噬菌体，能容纳的插入片断也较小。如pBR322只能容纳小于10kb的外源基因。而噬菌体可插入20kb以上的DNA

18、片段。7E 考察要点是基因工程操作的基本原理。常见错误选A，基因工程是一项较为复杂的技术，其操作基本过程可简单概括为：（1）分-分离提纯载体和目的基因；（2）切-限制性核酸内切酶的应用（切割载体和目的基因）；（3）接-将载体和目的基因连接成重组体；（4）转-把重组体导入宿主菌；（5）筛-重组体的筛选与鉴定。8C 考察要点为cDNA文库的概念。常见错误选B或D。cDNA文库的建立首先是从特定组织或细胞中提取总的mRNA，然后经反转录作用合成与mRNA互补的DNA（complementary DNA,cDNA），再复制成双链cDNA片断，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。建立cDNA

19、文库所用的mRNA只来自某一特定组织或细胞，所以此文库包含了一个生物组织或细胞所表达的各种mRNA信息。10E 重组DNA技术中常用的工具酶为考察要点。常见错误为选B或D或C。在重组DNA技术中的许多工作都涉及到对DNA进行切割和重组，或对DNA进行修饰或合成。这些工作都是通过酶的作用来完成的。常用的一些基本工具酶：（1）限制性内切核酸酶：它能识别双链DNA内部特异位点，并在准确的位置上切割DNA，使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段；（2）DNA连接酶：将DNA片段与克隆载体共价连接构建重组DNA分子；（3）反转录酶：用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库；（4）DNA-p

20、ol：利用其5 3聚合活性及核酸外切酶活性，主要用于合成双链cDNA的第二条链，填补3末端，DNA序列分析及切口平移标记DNA探针等。11D 考察要点为目的基因及其来源。常见错误为选E或A。目的基因本质是DNA，所以A，B，C不是，而mRNA经反转录合成的与其互补的cDNA可作为目的基因，答案E只有基因组DNA可作为目的基因。12A 考察要点是将外源DNA导入受体菌的方法。常见错误为选B或D。基因工程中将外源DNA导入宿主菌的方法，根据重组DNA时所采用的载体性质不同有转化（transformation）、转染（transfection）及感染（infection）等不同手段。转化是指以质粒作

21、为载体，将外源DNA导入受体菌，并使其获得新的表型的过程。感染是以噬菌体和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成为具有感染能力的病毒和噬菌体颗粒，感染适当细胞，并在细胞内扩增。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移也称为转导（transduction）。转染是由转化和感染两个词构成的新词。指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。13B 考察要点为质粒的特点。常见错误：选A或C。B是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。如质粒携带有某种抗药性标志基因（如ampr,tetr），转化后只有含这种抗药性基因的转化子

22、细菌才能在含有该抗菌素的培养板上幸存并形成菌落，这样就可直接将含质粒的转化菌与非转化菌区分开，是筛选含有质粒转化菌的最常用方法。标志补救筛选，是利用克隆的基因在宿主菌表达产物与宿主菌（营养突变株）的营养缺陷互补进行筛选。免疫学方法是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。其特异性强，灵敏度高，适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因。免疫学方法又分为免疫化学方法和酶免检测分析。分子杂交筛选是利用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片断进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。PCR(ploymerase chain reaction)技术及酶切鉴定也是筛选和

23、鉴定目的基因的方法。14C 考察要点为重组筛选的方法及原理。常见错误：选不出答案。互补是指质粒pUC18载体携带有细菌的LacZ基因，它编码半乳糖苷酶的一段由146个氨基酸残基组成的片段（酶的N端）。而突变型细菌可表达该酶的片段（酶的C端）。单独存在的及片段均无半乳糖苷酶的活性，只有突变型细菌与pUC18载体同时共表达两个片段时，突变型细菌内才有完整的半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物，这就是所谓的互补。就是利用载体在细菌的表达与细菌的营养缺陷互补，所以这种筛选方法属于标志补救法。答案D是分子杂交筛选中的一种。27C 重组体为目的基因与载体用连接酶连接而成，是利用细胞内各种酶系复制、

24、表达，没有独立的繁殖能力。【X型题】5ABDE 考察要点为外源基因与载体的连接方式。常见错误：漏选A或D，多选C。 目的（外源）基因与载体连接方式：（1） 粘性末端连接：同一限制酶切割位点连接；不同限制酶切位点（即配伍末端）连接。（2） 平末端连接，限制酶切割DNA后产生的平端属配伍末端，可彼此相互连接。（3） 平端切口加尾连接，即在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，经退火作用完成连接，此方式属粘性末端连接的一种特殊形式。（4） 人工连接器连接：指在平端DNA片段或载体DNA末端接上人工合成的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段，而后用相应的限制酶切割产生粘性末端，在DNA连接酶的作

25、用下形成共价结合的重组DNA分子。二、填空题1 DNA ；遗传表型2 插入序列 ；转座子3 位点特异的重组 ；同源重组 ；转座重组4 位点特异的重组5 同源重组 ；基本重组6 克隆基因载体 ；目的基因与载体7 DNA特异序列 ；内切8 目的基因 ；PCR9转化 ；转染三、名词解释1 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。2 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（complementary

26、 DNA,cDNA），再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了细胞所表达的基因信息，称为cDNA文库。3 利用限制性内切核酸酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，称基因组DNA文库。（或存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称基因组DNA文库）。4 Plasmid即质粒，是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。因为质粒

27、DNA有自我复制功能及所携带的遗传信息等特性，故可作为重组DNA操作的载体。5 大部分限制性内切核酸酶为II类酶，识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。6 Vector即基因载体，或称克隆载体，是在基因工程中为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达的功能。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特意设计的克隆载体又称表达载体。克隆载体有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA，它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。7 应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA。8 Restriction endonuclease即限制性核酸内切酶，就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，与相