抗生素生产工艺系列3

1、抗生素工业生产抗生素工业生产第二部分第二部分菌种优化菌种优化抗生素发酵及抗生素发酵及提取精制提取精制工业生产方法工业生产方法及总的工艺及总的工艺抗生素生产菌抗生素生产菌的菌种的菌种菌种来源菌种来源抗生素的工业生产方法抗生素的工业生产方法及工艺介绍及工艺介绍第一节第一节教学目的教学目的工业生产方法工业生产方法 生物合成法生物合成法全化学合成法全化学合成法半化学合成法半化学合成法一、抗生素的工业生产方法一、抗生素的工业生产方法1、生物合、生物合成成法法生物合成法（生物合成法（即微生物发酵法即微生物发酵法）：是利用）：是利用特定的微生物，在一定的条件下（特定的微生物，在一定的条件下（培养基、培养基、

2、温度、温度、ph、通气、搅拌、通气、搅拌等）使之生长繁殖，等）使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当化学手段将抗生素从发酵液中提取、精制，化学手段将抗生素从发酵液中提取、精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。目前目前dna重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的新型抗生素问世。的新型抗生素问世。 返回2、全、全化学化学合成合成法法 氯霉素分子结构图氯霉素分子结构图o2nch3

3、oc6h5clo2nch2obrc6h5clo2nch2obr.c2h5ohhcl,h2obr2(ch2)6n4(ch2)6n4o2nch2onh2.hclaconao2nch2onhcoch3hchoo2nchonhcoch3ohac2oo2nchohnhcoch3ohthreo()hclh2oo2nchohnh2.hclohthreo()naoho2nchohnh2ohthreo()aloch(ch3)23(ch3)2chohresolutionch2oho2nhhohnh2d-(-)-threoch3ohch2oho2nhhohnhcochcl2cl2chcooch3合成路径合成路径o2

4、ncoch3为起始原料为起始原料溴代溴代 成盐成盐水解成胺水解成胺酯化酯化羟醛缩合羟醛缩合选择性还原选择性还原（）苏阿糖）苏阿糖型型酯水解酯水解酸碱中和酸碱中和拆分拆分d d（- -）苏阿糖型）苏阿糖型成酰胺成酰胺全化学合成法的优缺点全化学合成法的优缺点效率较高，受效率较高，受影响因素少，影响因素少，克服了发酵法克服了发酵法生产的缺点。生产的缺点。导致严重的环导致严重的环境污染问题。境污染问题。 返回3、半、半化学化学合成合成法法即半合即半合成法，成法，将生物合成法制得的抗生将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团素用化学或生化方法引入特定的功能基团,进行分子结构改造而获得的

5、新抗生素品种进行分子结构改造而获得的新抗生素品种或制成各种衍生物或制成各种衍生物。此种方法一般分两个阶段进行：此种方法一般分两个阶段进行： 增强抗菌力；增强抗菌力；12对耐药菌有效；对耐药菌有效；34 降低毒副作用或提高生物有效性。降低毒副作用或提高生物有效性。5 扩大抗菌谱；扩大抗菌谱；便于口服；便于口服；生物合成法生物合成法生产抗生素生产抗生素的的工艺过程工艺过程抗生素总的生产工艺过程抗生素总的生产工艺过程菌种菌种孢子制备孢子制备种子制备种子制备 发酵发酵精制过程精制过程成品检验成品检验提取过程提取过程成品包装成品包装发酵液发酵液预处理及过预处理及过滤滤出厂检验出厂检验微生物合成抗生素微生

6、物合成抗生素上游：上游：菌种保存、选育、孢子及种子制备菌种保存、选育、孢子及种子制备发酵发酵适宜的培养基适宜的培养基碳源碳源 氮源氮源 无机盐（微量元素）无机盐（微量元素）前体前体下游：下游：提取提取 预处理预处理 过滤过滤 进一步提取进一步提取结晶干燥结晶干燥纯品纯品成品成品:制剂工作制剂工作1、产生菌种、产生菌种菌种：菌种：来源于自然界，得到能产生抗生素的微生物，来源于自然界，得到能产生抗生素的微生物，经分离、选育和纯化后的物质；经分离、选育和纯化后的物质； 保藏：保藏：冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱箱(-190-196)内保藏；内保藏； 复

7、壮：复壮：一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。产能力。 条条 件：件：生产用的菌株须经纯化和生产能力的检生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子；验，若符合规定，才能用来制备种子； 孢子制备：孢子制备：将保藏的处于休眠状态的孢子，在严格将保藏的处于休眠状态的孢子，在严格的无菌条件下，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养的无菌条件下，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养基上，在一定温度下培养5-7日或日或7日以上，这样

8、培养日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的出来的孢子数量还是有限的； 扩大培养：扩大培养：必要时可进一步用扁瓶在固体培养基必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如如小米、大米、玉米粒或麸皮小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。上扩大培养。 2、孢子制备、孢子制备目目 的：的：使孢子发芽、繁殖以获得足够数使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中；量的菌丝，并接种到发酵罐中； 方方 法：法：可用可用摇瓶培养摇瓶培养后再接入种子罐进逐后再接入种子罐进逐级扩大培养或直接将孢子接入级扩大培养或直接将孢子接入种子罐逐级放大种子罐逐级放大培养培养。 扩大培养：扩大培养：级数通常为二级。级数通常为

9、二级。 3、种子制备、种子制备1.砂土孢子砂土孢子 2.冷冻干燥孢子冷冻干燥孢子 3.斜面孢子斜面孢子 4.药瓶液体培养药瓶液体培养 5.茄子瓶斜面培养茄子瓶斜面培养 6.固体培养基培养固体培养基培养 7、8.种子罐培养种子罐培养 9.发酵罐发酵罐在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。培养基主要成分包括碳源、氮源、无机盐类碳源、氮源、无机盐类(包括微量元素)和前体前体等。4、培养基的配制、培养基的配制(1)碳源碳源主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。

10、有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一；常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。(2)氮源氮源主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质、核酸)和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。有机氮源：有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。无机氮源：无机氮源：氨水(氨水既作为氮源，也用以调节ph)，硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。(3)无机盐和微量元素无机盐和微量元素 抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度与菌种的生理活性有一定

11、影响。(4) 前体前体(precursor)在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。前体的加入量应当适度。(5)培养基的质量培养基的质量1）在必要时作摇瓶试验以控制其质量；2）培养基的储存条件对培养基质量的影响；3）培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质；4）培养基初始ph亦要严格按规程执行。定 义：利用为生物体的代谢作用，并借助于代谢过程的控制来获得产品的过程。目 的：使微生物大量分泌抗生素。灭灭 菌：菌：在发酵开始前，有关设备

12、和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接接 种：种：将活化的菌种转移到无菌的培养基，将活化的菌种转移到无菌的培养基，接种量一般为接种量一般为10%或或10%以上。以上。发酵控制发酵控制视抗生素品种和发酵工艺而定。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气 和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持 一定罐温。加泡沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、 碱以调节发酵液的ph。发酵控制发酵控制 定时取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、ph、通气量、搅拌转速和液面控制等。对有的抗生素在发酵过程中还需加入葡萄对有的抗生素在发酵

13、过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。目目 的：的：分离菌丝、去除杂质；分离菌丝、去除杂质；多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中；抗生素存在于发酵液中；个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。 从发酵液中制取高纯度的符合药典从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。规定的抗生素

14、成品。1)时间短；时间短；2)温度低；温度低；3)ph宜选择宜选择对抗生素较稳定的范围；对抗生素较稳定的范围；4)勤清洗消毒勤清洗消毒(包括厂包括厂房、设备、管路并注意消灭死角房、设备、管路并注意消灭死角)。1)溶媒萃取法；溶媒萃取法； 2)离子交换法；离子交换法； 3)其他提取方法其他提取方法溶媒萃取法溶媒萃取法 利用抗生素在不同利用抗生素在不同ph条件下以不同的化学状条件下以不同的化学状态态(游离酸、碱或成盐游离酸、碱或成盐)存在时，在水及与水互不存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相从一种液相(如发酵滤液如发酵滤液

15、)转移到另一种液相转移到另一种液相(如如有机溶媒有机溶媒)中去，以达到浓缩和提纯的目的。中去，以达到浓缩和提纯的目的。离子交换法离子交换法 利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来。条件将抗生素从树脂上洗脱下来。生产周生产周期长，对某些产期长，对某些产品质量不够理想品质量不够理想优点：成本优点：成本低、设备简低、设备简单、操作方单、操作方便便离子交换法离子交换法其他提取方法其他提取方法 由于近

16、年来许多抗生素发酵单位已大幅由于近年来许多抗生素发酵单位已大幅度提高，提取方法亦相应适当简化。度提高，提取方法亦相应适当简化。直接直接沉淀法沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的就是提取抗生素的方法中最简单的一种。一种。 例：四环素的提取例：四环素的提取 脱色和去热原质脱色和去热原质结品和重结晶结品和重结晶a. 改变温度结晶改变温度结晶. 利用等电点结晶利用等电点结晶 c. 加成盐剂结晶加成盐剂结晶 d. 加入不同溶剂结晶加入不同溶剂结晶其他精制方法其他精制方法脱色和去热原质脱色和去热原质结晶和重结晶结晶和重结晶a.改变温度结晶改变温度结晶 利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变利用抗生素在溶剂中的

17、溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。化而显著变化的这一特性来进行结晶。 例例:制霉菌素的浓缩液在制霉菌素的浓缩液在5条件下保持条件下保持4-6h后即结晶完全，分离掉母液、洗涤、干燥、磨后即结晶完全，分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。粉后即得到制霉菌素成品。 当将某一抗生素溶液的当将某一抗生素溶液的ph调到等电点调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。析出。 例：例：6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-apa)水溶液当水溶液当ph调至等电点调至等电点(4.3)时，时，6-apa即从水溶液中沉即从水溶液中沉淀析出。淀析出。b.利

18、用等电点结晶利用等电点结晶c.加成盐剂结晶加成盐剂结晶 在抗生素溶液中加成盐剂在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结晶。使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结晶。 例：例：在青霉素在青霉素g或头孢菌素或头孢菌素c的浓缩浓中加入的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。醋酸钾、即生成钾盐析出。d. 加入不同溶剂结晶加入不同溶剂结晶 利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出另一溶剂使抗生素析出。 例：例：巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的巴龙霉素具有

19、易溶于水而不溶于乙醇的性质。在其浓缩液中加入性质。在其浓缩液中加入10-12倍体积的倍体积的95%乙乙醇，并调醇，并调ph至至7.2-7.3使其结晶析出。使其结晶析出。其他精制方法其他精制方法(1)共沸蒸馏法共沸蒸馏法(2)柱层析法柱层析法(3)盐析法盐析法(4)中间盐转移法中间盐转移法(5)分子筛分子筛9、成品检验成品检验抗生素成品常规检验的主要项目有：抗生素成品常规检验的主要项目有：10、成品的分包装成品的分包装 就是将大包装原料药进行小包装或加工成就是将大包装原料药进行小包装或加工成多种类型的抗生素剂型，如果是注射用的多种类型的抗生素剂型，如果是注射用的抗生素剂型，还必须在无菌条件下进行。抗生素剂型，还必须在无菌条件下进行。抗生素工业抗生素工业生产特点生产特点三、抗生素工业生产特点三、抗生素工业生产特点1 菌体的生长菌体的生长与与产物的形成不平行产物的形成不平行2 理论产量难理论产量难以用以用物料平衡来计算物料平衡来计算3 生产稳定性差生产稳定性差与一般制药工业相与一般制药工业相比较的比较的特殊问题特殊问题1、染菌问题：、染