浅谈肝癌干细胞的研究现状

1、综述浅谈肝癌干细胞的研究现状恶性肿瘤是人类疾病中病情最严重、预后最差的疾病之一。肿瘤患者为此承受 了巨大的痛苦，同时也消耗了众多的医学资源。因此，肿瘤发生的机制、肿瘤转移 的机理和如何彻底有效治疗一盲是医学界研究的焦点。一盲以来，大家普遍认为肿 瘤是由肿瘤细胞增殖而来。因而，在临床工作过程中，i矢生评估肿瘤的治疗效果标 准之一就是观察肿瘤的体积是否缩小或消失。然而，困扰医务工作者的是，许多恶 性肿瘤患者接受治疗时已经处于疾病晚期，不能实施手术或者不能彻底切除肿瘤， 随后肿瘤复发，难以彻底治愈。近年来，随着对肿瘤以及干细胞研究的不断深入，人们惊喜的发现，肿瘤细胞 在一定程度上具有自我复制和增殖的

2、特点，而这一特征恰恰与干细胞相符，从而促 使人们把肿瘤细胞的调控机制与干细胞联系在一起，并由此提出肿瘤干细胞的概念 l，jo许多研究认为正是由于肿瘤干细胞有自我复制及无限增值的特点，才导致肿瘤 的持续进展和治疗后的复发转移。肿瘤干细胞代表肿瘤的牛物学特性，在肿瘤的牛 长及发展进程中起着关键的作用；而肿瘤组织中大部分剩余的细胞，则通过程序性 凋亡途径最终死亡。此外，越来越多的研究提示，肿瘤容易复发或者转移是因为 肿瘤中存在肿瘤干细胞。普通肿瘤细胞缺少肿瘤源性，放、化疗等措施对其有较好 治疗效果，所以临床上传统的治疗措施可以有效减小肿瘤的体积。但由于肿瘤干细 胞的存在，其可以对相关的治疗产生“耐受

3、性”，可以免于杀死，继而导致了肿瘤患 者术后复发以及肿瘤的远处转移。鉴于此，肿瘤干细胞的相关研究越来越多，医务 人员以求找到治疗肿瘤的新方法。干细胞(stem cell, sc)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有再生各种 组织器官和人体的潜在功能。根据干细胞(sc)的分化能力可分为以下三类：(1) 胚胎干细胞(esc),也称为全能干细胞(tsc),它的来源是早期胚胎(原肠胚期z前) 或原始性腺。它具有强大的分化潜能，可分化成机体几乎所有类型或种类的细胞。 然而不同的国家对胚胎干细胞在科研上的应用实施了有别的法律及伦理的限制。同 样的，我们国家对胚胎干细胞的科研应用也有很大的争议。(2)骨

4、髓干细胞(bmsc) 或造血干细胞(iisc),也称多能干细胞。骨髓干细胞广泛应用于科研并且在临床上也 有越来越多的报道；研究已证实，bmsc能够分化成血细胞及肝细胞。由于bmsc具 有独特的优势：来源广泛(可以来自志愿者、患者亲属等)、数量较多及操作方便, 所以bmsc r泛应用于临床，可喜的是bmsc r泛应用于白血病的临床治疗。成体 干细胞(asc),也称单能干细胞(usc),它是一种具有未分化状态及性能的细胞，但 是存在于分化组织中。是一种具有可以向任何特定细胞系分化潜力的干细胞，也称 之为祖细胞。最近几年，研究的比较热门的肿瘤干细胞就属于第三种类型一一成体 干细胞。原发性肝癌是指由肝

5、细胞和肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，是我国常见恶 性肿瘤之一。而在全世界范围中，肝癌也普遍存在，它主要分布于东南亚、西太平 洋地区及非洲撒哈拉沙漠以南的地区。肝癌的死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三 位，仅次于胃癌和食管癌。预计在未来的生活中，肝癌的患病率和死亡率还会逐渐 上升原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, phc)是我国常见且恶性程度 最高的肿瘤之一，其中,肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, 11cc)占phc的 90%以上。虽然近年来我们在hcc的诊疗上取得了一些突破性的进展，但hcc预后 仍然较差，hcc的发病机理，转移机制仍

6、不明确。随着研究的不断深入，在诸多实 体肿瘤中均发现了肿瘤干细胞(cancer stem cells, cscs)的存在®巴由此推测在 肝癌中也可能存在肝癌干细胞(liver cancer stem cells, lcscs)o1肝癌干细胞的来源目前，关于lcscs的来源有以下两种观点：1)来源于成熟肝细胞的去分化过程 l9j; 2)来源于肝脏干细胞的“成熟受阻”。然而，近年来，越来越多的实验结果证实 肝干细胞是肝癌干细胞的起源fl0-131o而目前，研究证实肝脏干细胞可能有以下两种 来源：一是肝内来源，该观点认为处于休眠状态的少量干细胞存在于正常肝脏组织 内；二是肝外来源，该观点认

7、为肝干细胞不是来源于肝脏，而是来源于肝外其他组 织，如骨髓等。grozdanov等【通过建立solt-farber肝癌模型，证实肝祖细胞/卵圆细胞与 肝癌的发牛发展有密不可分的关系。卵圆细胞主要位于胚胎肝脏或成年肝脏的胆管 末端，具有多向分化的潜能，可以分化为胆管细胞，也可以分化成肝细胞。dumble 等在p53基因敲除小鼠上进行实验，给予缺乏胆碱而补充乙硫氨酪酸的饮食，诱 导并成功分离卵圆细胞，然后进行裸鼠成瘤实验，一段吋间后在裸鼠上形成与肝细 胞肝癌病理类型相似的肿瘤，证明肝癌干细胞由卵圆细胞分化而来，提示卵圆细胞 可能参与肝细胞肝癌的发生发展过程。诸多研究普遍认为：肝干细胞主要存在于成年

8、肝脏的胆管末端hering管中，但oliva等u刀通过相关实验发现肝干细胞存在于肝癌组织中。研究也发现，肝癌细胞 表达的表面标志物可以与肝干细胞表达的相同，这充分提示肝细胞癌来自肝干细胞 z。最近研究证实，epcam是肝干细胞的标志物z-, epcam(+)细胞表现出独特 的特性，其可以促使肝癌细胞的生长和远处转移，进一步提示肝干细胞与肝癌的发 生有着密不可分的关系i。2肝癌干细胞的分子运转机制在正常干细胞中，存在着wnt/ b -catenin , notch , tgf- b /smad和 pi3k/akt/mtor等信号传导途径。它们不仅起到了维持和强化自我更新能力的作用， 同时也发挥着

9、对肿瘤干细胞的调控作用。2. 1 p13k/akt/mtor 信号通路磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, p13k),是一种存在于 细胞质的复合体。akt即为一个pi3k f游的关键蛋白，由480个氨基酸的残基组成, 是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶i。哺乳动物雷帕 霉素靶蛋白(mammalian terget of rapamycin, mtor)是一种分子量 289kda 的丝氨酸/苏氨酸 蛋白激酶，也是该信号通路的下游分子之一。在细胞内存在两种复合体，分别为:mtor与raptor蛋口结合为帕累霉素复合体mtorcl ;mt0r与r

10、ictor蛋口结合为帕 累霉素复合体mtorc2。sarbassov等发现，mtor-rictor复合物可以激活存在于 akt分子中的一系列氨基酸残基，进而激活akt。激活后的磷酸化akt蛋白在胞浆或胞核内，使底物磷酸化，从而促进细胞增殖、发挥抗凋亡及化疗耐受等作用。冃前 来说，很多研究已经证实该通路在肿瘤的发生发展屮起着重要作用，在肺癌、肝癌 中均有所报道f，8j91o2. 2 wnt/ p -eaten i n 信号通路wnt/ b -catenin信号通路拥有诸多生物学功能，可以维持干细胞的分化状态， 参与肿瘤的发生发展，同时能够调控细胞周期，是肿瘤调控途径z-o wnt/ p -cat

11、enin信号通路，在胚胎形成、成体恒态维持中发挥非常关键的作用门叭 此外, 它也参与肝细胞的早期发育过程。通过细胞外wnt配体与frizzled受体的互相结合, 使b -catenin与e-cadherin分离并进入细胞核内，从而调控下游癌基因(c-myc> cyclind及survivin等)的表达。这是wnt/ p -catenin信号通路活化的主要方式。 目前,wnt/p-catenin信号通路的活化在1/3的肝癌中均有发生，特别是在来源于 丙型病毒性肝炎所致的肝癌患者表现更为突出。通过wnt/p-catenin信号通路可 促进啮齿类动物卵圆细胞和06成瘤细胞的激活0,并显著增加e

12、pcam+细胞的数 量。令人兴奋的是，如果wnt/p-catenin信号通路的靶点成功干扰rna阻断，那 么就会出现细胞活化能力减弱，并且可以提高肿瘤细胞对放化疗药物的敏感性，最 终有效的降低肿瘤的复发和远处转移国。有报道显示微小rna-181s(mir-181s)家族 存在于肝细胞癌的少量肝癌干细胞中，它可以维持干细胞的状态，但mir-181s如何 发生作用，是否为该信号通路中的靶点之一，仍需要进一步的实验研究】。2.3转化生长因子b (tgf- (3)信号通路转化生长因子3 /smad信号通路参与许多生理和病理过程：如干细胞的自我更 新、多向分化和组织器官的成瘤等等，并在其中发挥着重要的作

13、用。tang等bl相 关实验研究指出在人类进行肝脏移植术后，肝干细胞表达tgf-b信号相关蛋片质: tgf-b ii型受体(tbrtt),以及胚胎肝胞衬蛋白(elf)。而且,tang等推测:当某些 细胞的转化生长因子6 /smad信号通路受损时，常常伴随着激活状态的il-6/stat3 途径，这恰恰与elf+/-小鼠肝脏肿瘤的形成有着不可分割的关系。3肝癌干细胞表面标志物肝癌干细胞是一类特殊的肿瘤细胞。由于其表面拥有特定的标记物，可以在科 学研究中通过某种方法，充分利用肝癌干细胞的表面标记，将其进行分离并筛选。 由于正常肝脏干细胞是肝癌干细胞来源之一，因此，我们可以参照肝干细胞表面的 特异标记

14、物采用某些特殊方法来将肝癌干细胞分离出来ocd133，也称为ac133,是一种分子量大小为120kd的蛋白，它于1997年被 miraglia等在干细胞表面发现。它在多种脏器的干细胞表面上有广泛表达：如胚胎 上皮细胞、肾脏干细胞和前列腺上皮干细胞等f25'261o干细胞标记物cd133目前已广 泛应用于诸多实体肿瘤屮干细胞的研究。yin等01从人肝癌细胞株及人肝癌组织屮, 都观察到少量cd133+细胞的存在，并成功的从人肝癌细胞株smmc-7721中分选出的 cd133+细胞，将该细胞收集并实施裸鼠成瘤实验，较cd133-细胞而言，其具有更强 的致瘤能力。无独有偶，suetsugu等绚

15、在人肝癌细胞株huh-7中也同样分离并证明 了 cd133+细胞的存在，证实cd133是肝癌干细胞的分子标志物之一。cd90 (thy-1),也称为分化抗原簇90,是一分子量大小为25kda的蛋白，也是 细胞粘附分子免疫球蛋白超家族中最小的成员。yang等i通过利用表面标记物分 别分离岀cd90+的细胞和cd90-细胞，然后进行裸鼠成瘤实验，发现cd90+的肝癌细 胞较cd90-的肝癌细胞有明显的致瘤性，且cd90+的细胞数口与其致瘤性能呈正相关 的关系，肿瘤病理证实也符合hcc的诊断。总之，目前有诸多研究证实cd90是肝癌 干细胞（lcscs）的分子标志物之一。cd44是一种细胞表面黏附分子

16、，可参与介导多种信号转导途径。clarke等耳 首次提岀乳腺癌干细胞这一概念。随后他将干细胞从人类乳腺癌组织中分离出来， 并将cd44+的乳腺癌细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，进行裸鼠成瘤实验，证实cd44 是乳腺癌干细胞的标志之一。此外,yang等1进一步将cd90+细胞群分为cd90+ cd44 +和cd90+ cd44- 2个亚群，若应用抗cd44抗体阻断cd44活性，则会出现cd90+ 细胞的致瘤性明显下降，且更有意义的是，致瘤能力的大小与抗体的使用剂量成负 相关的关系。总z,诸多研究亦证实cd44是肝癌干细胞（lcscs）的分子标志物z0上皮细胞黏附分子（epcam），也称为cd326,

17、是一分子量大小为39-42kda的蛋 口，是一种几乎在所有致瘤过程中表达的一种全上皮分化抗原。它在肝脏干细胞和 胚胎干细胞中广泛表达，但在正常成熟肝细胞中没有表达。terris等对325例临 床患者肝癌样木进行相关分析及研究，证实分选出的epcam+细胞，较epcam-细胞而 言，在裸鼠成瘤实验中有显著的致瘤性。综上所述，目前研究证实可以作为肝癌干细胞（lcscs）特异标志物的有：cd133、 cd90、cd44、aldh> epcam和0v6等等，但仍未发现一种特异性分子表面标记物， 从而对肝癌干细胞进行分离。因此，继续寻找特异性强的lcscs标志物是目前研究 的重点，这对于肝癌的研究

18、及治疗具有举足轻重的作用。4肝癌干细胞的分离目前，尽管诸多实验支持肿瘤起源于干细胞这一学说，但要证明肿瘤中存在肿 瘤干细胞，证明不是任何一种细胞都有致瘤性，就必须把肿瘤干细胞分离出来，并 进行培养鉴定。目前，比较通用的分选肿瘤干细胞的方法有:侧群细胞（sp cells） 分选法、荧光活化细胞分选法（facs）和免疫磁性细胞分选法（macs）、细胞球悬 浮培养法（sphere法）。细胞球悬浮培养法利用肿瘤干细胞的牛长特性-具有失巢凋亡抗性犁科研人 员利用低粘附培养器皿培养，并在培养基中加入多种生物因子，如表皮生长因子 （egf）、成纤维细生长因子（fgf）及vitb12等等，这样以来肿瘤干细胞就

19、可以在 体外增殖，一段时间后，在显微镜下面就可以观察到悬浮牛长的细胞球，称为球体。4.1 sp细胞分选法侧群细胞(side population cells, sp细胞)是一种能高表达abcg2的细胞, 它能通过膜转运蛋白abcg2将进入细胞核的荧光染料hoechst33342有效排出。而非 侧群细胞(non side population cells, nsp cells)则不能像 sp 细胞一样，将 h oechst33342排除体外。目前，分选侧群细胞(side population cells, sp细胞) 的表型标志物以及相应的分离方法均较明确，适用范围较广泛，是研究肿瘤干细胞 的有

20、效方法zochiba等珂对4个人肝癌细胞株进行了 sp的分离并检测，得出一半以上的侧群 细胞同时拥有肝细胞和胆管细胞标志物，但非侧群细胞则未见两种标志物的同时表 达。在分别进行的裸鼠成瘤试验中，应用1000个sp细胞，注入免疫缺陷小鼠皮下, 即可导致裸鼠成瘤，而应用6倍sp细胞数量的nsp细胞，结果却不能成瘤，这就证 明sp细胞存在干细胞的特性，在肝癌的发生发展过程中有重要作用。fan等1陶利用 血清饥饿法来分别培养sp细胞和nsp细胞，令人欣喜的是：在sp细胞中，抑制细 胞凋亡的原癌基因bcl-2表达上调；而在nsp细胞，促进细胞凋亡的bax表达上调, 这也恰恰说明sp细胞具有抵制凋亡的能力

21、，对化放疗亦有一定的“耐力” 1361 o shi 等1研究表明，人肝癌标木中，也有侧群细胞的存在，该细胞与肝癌术后复发及远 处传移存在着密切关系。因此有部分学者认为，虽sp细胞不等同于lcscs,但却拥 有干细胞的部分特性，故侧群细胞中存在着部分干细胞。此外，研究者lichtcnaucr 等国1的实验亦表明，sp细胞与lcscs也有不同点，在肿瘤屮，不具备干细胞特性的 侧群细胞也是存在的。总之，由于试剂hoechst33342有细胞毒性，对细胞有一定程 度的损害，这或多或少的会影响我们对sp细胞及nsp细胞的比较。4. 2利用lcscs表面分子进行分选上述sp细胞分选法有某些优点，但仍存在某

22、些缺点。因此，近年來出现了利用 lcscs表面标志物来分选细胞的方法：分别为macs法和facs法。如前面所述，目 前已发现多种lcscs的分子标志物，有效并高效的利用lcscs表面标志物来分选肝 癌干细胞是重中之重。而facs和macs分选法正是在这一理论基础上发现并实施的。 两者不同点是：facs法屮，分选肿瘤干细胞是利用特异荧光染色的原理；而在macs 法中，分选肿瘤干细胞则是利用磁性标记的抗体与细胞表面抗原相结合的原理。salnikov等别利用免疫荧光双染技术，证实仅通过检测cd 133的表达来鉴定lcscs 的存在是不可靠的，这也恰恰证实cd133仅是肝癌干细胞的表面标志物之一，并非

23、 是其特异性的表面标记物。zhu等4°应用抗cd133单抗和抗cd44单抗双染四种人肝 癌细胞株hepg2、hep3b、huh7和smmc7721,通过流式分选出双阳性表达及双阴性 表达的细胞，双阳性表达的细胞不仅有干细胞的诸多特性，还在体外异种移植试验 中显示出较高的成瘤性，该类细胞对相应的化疗药物具有较强的“忍耐力”。综上所 述，我们可以清楚的得知：上述任何一种分子标志物并不是特异性的，它其他细胞 群中也可以有所表达，因此，我们需要联合多种干细胞表面标志物来进行干细胞的 分选与鉴定。5肝癌肿瘤干细胞的靶向治疗鉴定并分离肿瘤干细胞，对于临床工作起着举足轻重的作用。众所周知，传统 药

24、物可以有效抑制动物模型中肿瘤的生长，但在临床中传统的许多药物却无法有效 抑制肿瘤的生长。这其屮可能是由于传统药物对肿瘤屮的大部分细胞有效，但对肿 瘤干细胞无效，最终导致肿瘤治疗后的复发和远处转移。因此越来越多的学者提出 治疗恶性肿瘤应该针对这一类特殊的细胞一一肿瘤干细胞l4l42jo5.1分子靶向治疗把csc特异的表面分子标志物作为治疗的分子靶，有可能成为今后治疗恶性肿 瘤的新途径。通过抑制或干扰肿瘤干细胞的特异信号通路来治疗肿瘤，是目前人势 所趋。血等丽通过运用aktl的抑制剂，来提高cd133+的肿瘤细胞对化疗药物5- 氟尿卩密碇(5-fu)的敏感性，证明在cd133+肿瘤细胞的耐药过程中

25、，存在着akt/ pkb和bcl-2信号通路的激活。肝癌细胞可能由stat3+、0ct3/44-的肝前体/干细胞分化而来。lin等屮】通过 应用一种stat3的特异抑制剂nsc74859,导致肝癌细胞中tgf-b信号通路的失活, 进而显著抑制肿瘤的生长。因此，il6/stat3有望成为肝癌治疗的靶点之一。在wnt/p-catcnin信号通路中，存在着0v6阳性表达的肝肿瘤干细胞，通过 micro-rna感染细胞可以抑制该信号通路的活性，使0v6阳性表达的肿瘤细胞的数 量减少，同时还可以使0v6阳性表达的肿瘤细胞的耐药性降低。此外，研究证实： wnt/ b -catenin信号通路的激活可以显著

26、提高epcam+肿瘤细胞所占总细胞的比例， 反之，若使该信号通路失活，亦能降低epcam+细胞的活性，降低其成瘤能力。5. 2促分化治疗肿瘤干细胞的白我更新和无限增值能力是其治疗后易复发和转移的主要原因。因 此我们推测促进csc的分化将可能逆转肿瘤的进展，最终起到抑制肿瘤的作用。诱 导分化治疗最成功的的范例就是全反式维甲酸(all-transretinoic acid atra)治 疗急性早幼粒白血病(acute promyebcytic leukemia, apl) 46o那么在肝癌中是 否可以促进lcsc的分化进而起到抑制肿瘤的近展？ r前看来，该项研究尚处于起步 阶段。当前，部分实验结果

27、显示：某些诱导剂如二甲基亚砚、丁酸钠可以诱导 hnscs (hepatocyte normal stem cell, hnscs)定向分化为肝细胞；地塞米松等药物 可以促进肝干细胞向胆管上皮细胞分化随着研究的不断进展，诸多研究学者发 现gata-6, hnf4a、tgf等因子均可以诱导肝干细胞的分化，促进肝脏的发育，并 在其过程中发挥了重要的作用。肝细胞核因子4a (|nf4a )是肝脏生成中的一个 必须转录因子。科研人员成功在肝癌细胞株hep3b和hepg2中过表达hnf4 a ,结果 惊喜的发现hnf4a可以促进肝癌细胞分化成为成熟的肝细胞，并且明显的减少了干 细胞的特性，cd133+和c

28、d90+细胞在总细胞中的比例也明显降低。此外，过表达iwf4 a可以使肝癌细胞的成瘤性降低皿】。而在我国，第二军医大学附属长征医院谢渭芬 教授及其课题组，利用hnf4 a诱导分化肝癌细胞，使肝癌细胞转变成正常的肝细胞。 首次提出肝细胞核因子可诱导肝癌细胞的转化，从而达到治疗治疗的目的，这意味 着发病率及死亡率极高的肝癌，有可能遇到了 “克星”。6肝癌干细胞研究展望肿瘤干细胞理论仍然是全世界范围内炙手可热的话题之一，目前已经有了部分 研究成果，但关于肝癌干细胞，尚有许多问题需要进一步研究探索：(1)肝癌干细胞 的特异标记物仍未找到。如果科研工作者有幸成功找到肝癌干细胞特异性表面标志 物，那么我们

29、可以依照此标志物从肿瘤细胞中分离岀肝癌干细胞，就会给肝癌干细 胞的研究学者及肝癌患者带来福音。(2)正确有效分离并鉴定肝癌干细胞的方法仍未 确定。目前大多数的研究学者，通过釆用分离的相关细胞种植到免疫缺陷小鼠颈部, 进而依据细胞成瘤实验，来判断其是否为肿瘤干细胞。但此方法却忽略了人与鼠种 属类别的差异，或许今后应用人源化小鼠代替裸鼠，来进行相关实验。(3)肝干细胞、 肝癌细胞和肝癌干细胞三者之间的关仍未明了。这需要今后相关实骑去一探究竟。(4)肝癌干细胞的信号转导途径仍未研究透彻。探寻治疗肝癌干细胞的特异性分子 靶，进而为肝癌根治提供新的药物。总而言之，我们深信，对肝癌干细胞研究的热 情和成果

30、一定会引发我们对肝癌新的认识，从而为肝癌的治疗开拓一个新的方向引言原发性肝癌是r前最常见的恶性肿瘤2,其发病率和致死率长期维持在较高 水平山。当前，手术切除和肝脏移植仍然是全世界最主要和最有效的治疗方法。 尽管在外科手术领域我们取得了较大的进步，但由于肿瘤术后复发和转移，术后患 者生存期依旧不尽人意。因此，寻找新的靶点来预防及治疗肝癌就显得非常重要 并意义深远。1971年，friend等通过实验证实：试剂二甲基亚飒(dmso)可以诱导分化 小鼠红白血病细胞(mel)o即在dmso的作用下，血红蛋白的合成明显增多，该 现象证实了其具有体外诱导分化的能力，开创了诱导分化肿瘤细胞的先河。肿瘤的 诱导

31、分化治疗(differentiation therapy)是指在一定诱导分化剂的作用下，恶性肿瘤 细胞分化成为具有正常功能的成熟细胞，并促进恶性肿瘤细胞的凋亡过程及阻滞恶 性肿瘤细胞的增殖过程，从而达到治愈肿瘤的目的。大多数恶性肿瘤丧失了正常的 分化能力却处于低分化或去分化状态是其理论基础，正因如此，可使恶性肿瘤细胞 具有被诱导剂诱导分化的能力。冃前，诱导分化治疗最成功的的典范就是全反式维 甲酸(alltnmswtinoic acid atra)治疗急性早幼粒白血病(acute promyebcytic leukemia, apl)，其在临床工作中取得了良好的效果，从而推动了诱导分化治疗 在相

32、关研究方面的进展。在肿瘤的发生及发展过程中，分化的细胞失去特有的结构和功能，转变为具有 未分化细胞的特性，此过程称为去分化过程。近期研究表明去分化状态在肿瘤的发 牛发展及浸润转移等方面发挥着至关重要的作用。随着对去分化研究的不断拓展 及深入，通过诱导肝癌细胞分化为正常肝脏细胞，是当前治疗肝细胞肝癌的大势所 趋。转化生长因子p /smad信号通路参与许多生理和病理过程：如干细胞的自我更 新、多向分化和组织器官的成瘤等等，并在其中发挥着重要的作用。tang等相关 实验研究指岀在人类进行肝脏移植术后，肝干细胞表达tgf-p信号相关蛋白质： tgf-b ii型受体(tbrii),以及胚胎肝胞衬蛋白(e

33、lf)。而且，tang等推测:当某些 细胞的转化生长因子p /smad信号通路受损时，常常伴随着激活状态的ti-6/stat3 途径，这恰恰与elf+/小鼠肝脏肿瘤的形成有着不可分割的关系。elf (embryonic liver fodrin)基因是由 lopa mishra 于凶 1999 年在小鼠胚胎 肝组织cdna文库中发现的分子量为200-kd的新b血影蛋口，近年来也被称为b 2血影蛋白(p2sp)o elf (p2sp)是tgf- 3 /smad信号通路的关键衔接分子，参与 smad2/3/4的结合和参与核内转运过程，而不影响smad 1/5/8和smadd的结合和转 运9，在胃癌

34、、肺癌、肝癌、结肠癌等恶性肿瘤中发挥抑制肿瘤进展的重要作用 根据我们实验小组前期的实验成果和fl前世界上肝癌方面的研究进展，我们 推测，elf ( 3 2sp),参与肝干细胞和肝癌干细胞的分化。这为将来利用elf ( 3 2sp)诱导分化肝癌治疗提供理论基础，为肝癌的诱导分化治疗提供新的靶点，为改 善肝癌患者的预后提供理论基础。本课题分为四大部分，分别为elf及相关基因在肝脏中的表达(动物标本、病 人标本)；肝癌细胞(huh7,snu398,hepg2等)实验；肝癌干细胞实验；细胞信 号通路。而我硕士阶段所完成的是第一部分，通过建立大鼠肝癌的动物模型，研究 肝癌发生和进展过程中elf与肝细胞分

35、化的相关作用，为将来利用elf (b2sp) 诱导分化肝癌的治疗提供一个理论基础，进而为肝癌的诱导分化治疗提供一个新的 靶点。第三章讨论二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, den)诱导的大鼠肝癌模型在致病过程及 基因表达变化两个方面被认为与肝炎肝硬化引起的人类肝癌发病过程存在很多相似 之处，且该动物模型已经被广泛应用于肝癌发病机理的研究l,6j7,o我们实验成功复 制了大鼠肝癌模型，通过检测不同阶段病变肝脏elf (b2sp)和其它相关分子的表 达，发现在这一 “正常肝脏肝硕化肝癌”发生发展过程中，elf (b2sp)的表达 与肝细胞的分化有关，即肝细胞的分化程度越差，elf

36、的表达越低。肿瘤的发生是多因素，多阶段的演化，由环境和遗传因素引起的细胞表型发生 改变：抵抗细胞死亡、抑制细胞凋亡、无限的自我复制能力、强大的组织浸润和转 移能力及细胞能量代谢异常等“叫在此过程中，分化的细胞失去正常的结构和功 能，转变为具有未分化细胞的特性，该过程称为去分化。目前，相关研究表明去分 化在肿瘤发生发展及浸润转移方面发挥着重要的作用。通过临床病理研究证实， 原发性肝癌其细胞分化程度明显降低。王红阳教授实验组在den诱导的大鼠肝硬化. 肝癌模型中证实，随着肝硬化肝癌的进展，肝脏特异性功能基因白蛋白、葡萄糖-6- 磷酸(g-6-p)的表达明显下降，而肝干细胞表面分子ck19、ck8的

37、表达则逐渐增强; 此外，该实验组在人肝癌组织和癌旁组织中证实：癌旁组织中片蛋片、g-6-p和果 糖二磷酸醛缩酶(aldob)的表达明显高于肝癌组织【。这正提示肝细胞肝癌存在 去分化状态。目前针对去分化治疗的相关研究不断增多并逐步深入。通过诱导分化这一措施 来治疗肝细胞肝癌己逐步出现在临床相关实验中。naiki等通过感染人肝癌细胞株 实验证实，过表达hnf4a可以上调肝脏功能基因的表达,这些数据表明过表达hnf4 a可以通过某种途径逆转肝癌细胞的去分化状态2°； lazarevich等发现使大鼠过表 达hnf4 a ,可以提高肿瘤的状态，促进细胞分化，最终导致肿瘤的侵袭能力降低* 尹川

38、等将表达hnf4 a基因的腺病毒导入肝癌细胞，得出该过程可以使肝细胞功能基 因的表达上调，使肝癌肿瘤干细胞标志物cd133和cd90的表达下降，进而抑制肿瘤细 胞的增殖qi。总之，上调hnf4a的表达可以诱导肝癌细胞向肝细胞分化，进而逆 转其去分化状态。转化生长因子 b (transforming growth factor p , tgf p )超家族包括 tgfbs、活 化素(activins), nodal,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,bmps), 生长和分化因子(growth and differentiation factors,gdfs)

39、和 anti-mullerian 激素 (anti-mullerian hormone,amh) 23,.tgf 3 超家族分子通过 ii 型/i 型 tgfb 受体激 活受体调节型 smad 蛋白(receptoregulated_smads,rsmad);磷酸化 r-smad 和 co-smad(smad4)形成复合体，导入细胞核内，启动靶基因转录，发挥生物学效应厂4。 tgfb信号通路参与许多生理和病理过程©,近年来研究证实，转化生长因子b超 家族在分化调控中发挥着重要的作用l2671onodal/activin与胚胎干细胞的自我更新、 分化和多功能调控密切相关；bmps和gd

40、f对于成体组织稳态、成体干细胞的分化 是必需的24'27j； bmp信号通路的界常阻断细胞的分化和成熟过程，有助于肿瘤的形 成巩 以上表明，tgfb超家族分子，尤其是细胞外分子，调控干细胞的自我更新 和分化成熟的过程。elf (embryonic liver fodrin)是b血影蛋白的一种，近年来也被称为b 2血 影蛋白(b2sp)。elf ( 3 2sp)参与细胞内信号的转导途径，elf蛋白一端与活化 的tgf-b1受体结合，另一端与smad3蛋口结合，作为配体蛋口促进smad3与tgf-b1 受体结合，对tgf-bl/smad信号转导途径发挥正性调节作用【沧划。此外，目前诸多 研

41、究也发现该通路与肝癌的发牛有着密不可分的关系。我们课题组在开展nsfc青年 基金时发现，肝硬化时，肝干细胞激活，通过检测肝干细胞标志物cytokeratin 19 (ck19)和核抗原ki67,证明再生的肝细胞來自于肝干细胞的分化。通过研究ck19 和eif在四氯化碳小鼠肝炎模型中的变化，我们得岀在肝干细胞分化形成的肝细胞 中，elf (b2sp)的表达明显下调，这就提示elf (b2sp)参与肝硬化时肝干细胞 的活化和其向成熟肝细胞的分化。在elf (b2sp)基因敲除小鼠中，tgfb信号 缺失造成分化调控异常，肝癌干细胞激活且自我更新能力增强，汇管区的肝干细胞 激活，促进肝细胞再生，这就提

42、示elf (p2sp)在肝干细胞向成熟的肝细胞分化中 发挥重要作用。以上表明elf (p2sp)参与肝干细胞和肝癌干细胞的分化过程。 这为将来利用elf ( b 2sp)诱导分化肝癌治疗提供理论基础，为肝癌的诱导分化治 疗提供新的靶点。在我们的动物实验中，我们发现：elf ( 3 2sp)在肝细胞中的表达随着肝癌的 进展逐渐下降，而在肝硬化的纤维间隔中表达明显升高。这就造成elf (b2sp)在 肝硕化组织中的表达高于止常肝脏组织和肝癌组织，而在肝细胞和肝癌细胞中elf (b 2sp)表达下降。众所周知，肝硬化的病理基础是肝星状细胞(hepatic stellate cel 1 s, hsc)增生、活化进而使肝细胞外基质(extracel lular matrix, ecm)过度纤 维