微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量

1、微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量化学与化学工程学院中心实验室 中山大学分析科学研究所，广东510275* 通讯作者，Email:Bgalang摘要 本实验用微波辅助提取三种不同水果中的维生素C，采用高效液相色谱法通过标准曲线定量法，借助紫外可见光分析，在265nm的波长下测定维生素C的吸光度，与标准系列比较，以保留时间来定性、峰面积定量。实验测得：在5-100mg/L范围内，维生素C浓度与峰面积具有很好的线性关系（A=32074c/（mg/L）-34595，R2=0.9999）本实验测得每100g橘子、金桔、苹果中的维生素C含

2、量分别为：29.73mg/100g、33.66mg/100g、2.24mg/100g。该操作方法简单方便，灵敏迅速，准确度比较好。关键词 维生素C 微波辅助提取 高效液相色谱 标准曲线1引言维生素C，又叫L-抗坏血酸，化学式C6H8O6，是一种水溶性维生素。食物中的维生素C被人体小肠上段吸收，一旦吸收，就分布到体内所有的水溶性结构中。正常成人体内的维生素C代谢活性池中约有1500mg维生素C，最高储存峰值为3000mg。正常情况下，维生素C绝大部分在体内经代谢分解成草酸或与硫酸结合生成抗坏血酸-2-硫酸由尿排出；另一部分可直接由尿排出体外。（摘自维生素C的主要作用是提高免疫力，预防癌症、心脏病

3、、中风，保护牙齿和牙龈等。另外，坚持按时服用维生素C还可以使皮肤黑色素沉着减少，从而减少黑斑和雀斑，使皮肤白皙。富含维生素C的食物有花菜、青辣椒、橙子、葡萄汁、西红柿等，可以说，在所有的蔬菜、水果中，维生素C含量都不少。美国专家认为，每人每天维生素C的最佳用量应为200300毫克，最低不少于 60毫克，半杯（大约一百毫升）新鲜橙汁便可满足这个最低量。而中国营养学会建议的膳食参考摄入量（RNI），成年人为100mg/日，可耐受最高摄入量（UL）为1000mg/日。维生素C在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏维生素C时容易导致坏血病。同时，由

4、于维生素C是一种水溶性的抗氧化剂，可参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。维生素C在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中Vc含量在50-300 mg/100 g。详细含量如下：（摘自排名食物质量(g)数量维生素C含量(mg)1樱桃5012粒4502番石榴801个2163红椒801/3个1364黄椒801/3个1205柿子1501个1056青花菜61/4株967草莓1006粒808橘子1301个789芥蓝菜花601/3株7210猕猴桃1001个68维生素C含量的经典测定方法有碘量法武汉大学.分析化学实

5、验室（第三版）北京:高等教育出版社，1997：167-175.、荧光法邵晓芬，张韵慧.谱学与光谱分析，1994.14(2)：125-130. ，随着仪器分析方法的发展，有文献采用邻二氮菲分光光度法间接测定魏玲，吕晓琴，李学琴.邻二氮菲分光光度法间接测定药片中维生素C的含量. 昌吉学院学报，2008，2：110-112. ，也有通过与高锰酸钾反应的分光光度法测定的闰家伟， 黄运瑞.分光光度法测定药片中维生素的含量. 南阳师范学院学报，2005，4(12)：54-55. 。之前课程也采用过库仑滴定法对维生素C药片进行维生素C含量，效果颇佳，快速简便。不过对于库仑滴定法利用的是氧化还原原理，所测结果

6、实际上是体系中的还原性物质的维生素C当量，对于复杂体系中存在的其他还原剂，并没有很好的区分作用，例如在测定苹果汁维生素C含量的时候，苹果汁中存在的亚铁离子会使库仑滴定法结果过高。因此，在含有其他还原性物质的复杂体系中，需要采用更精密的方法，本实验采用的是微博提取高效液相色谱法。样品的预处理是样品分析最为关键的步骤之一，尤其是分析复杂的样品时，样品的预处理是必不可少的。所以，发展快速、高效的样品前处理方法是分析家们一直追求的目标。传统的样品前处理的方法如索氏抽提、超声波萃取等不仅费时，而且溶剂的消耗量大。微波辅助萃取(Microwave Assisted Extraction ，MAE) 具有快

7、速、高效、省溶剂、环境友好等优点。微波技术开始主要是用于无机分析的样品预处理即微波消化，从1986 年起微波能开始应用到有机分析中的样品预处理李核，李攻科，张展霞.微波辅助萃取技术的进展.1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd.即微波辅助萃取。十几年来，MAE技术在有机分析中得到了广泛的应用。本实验采用MAE技术来萃取水果中的维生素C。MAE是指利用微波能强化溶剂萃取效率，即利用微波加热来加速溶剂对固体样品中目标萃取物(主要是有机化合物) 的萃取过程。微波具有波动性、高频特性以及热特性或非热特性(生物效应) 等特点 5。MAE具有以下优

8、点：1、快速高效：样品及溶剂中的偶极分子在高频微波能的作用下，以109/s 圈的速度变换其正、负极，产生偶极涡流、离子传导和高频率摩擦，从而在短时间内产生大量的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂、离子迁移等加速了溶剂分子对样品基体的渗透，待分析成分很快溶剂化，使微波萃取时间显著缩短。2、加热均匀：微波加热是透入物料内部的能量被物料吸收转换成热能对物料加热，形成独特的物料受热方式，整个物料被加热，无温度梯度，即微波加热具有均匀性的优点。3、微波加热具有选择性：微波对介电性质不同的物料呈现出选择性的加热特点，介电常数及介质损耗小的物料，对微波的入射可以说是“透明”的。溶质和溶剂的极性越大，对微波能

9、的吸收越大，升温越快，促进了萃取速度。而对于不吸收微波的非极性溶剂，微波几乎不起加热作用。所以，在选择萃取剂时一定要考虑到溶剂的极性，以达到最佳效果。4、生物效应（非热效应)：由于大多数生物体内含有极性水分子，在微波场的作用下引起强烈的极性震荡，从而导致细胞分子间氢键松弛，细胞膜结构电击穿破裂，加速了溶剂分子对基体的渗透和待提取成分的溶剂化。因此，利用MAE 从生物基体萃取待分析的成分时，能提高萃取效率。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相

10、色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点胡琴，黄庆华主编.分析化学.第354页.科学出版社，2009年.： 1、高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 2、高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 3

11、、高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在L数量级。 4、应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 5、分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物

12、质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测定杂质总量时，须采用峰面积法。 测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱硅胶图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外可为该品种项下主成分保留时间的倍数。 当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法魏福祥主编.仪器分析及应用.第194页.中国石化出版社，2007年。在

13、测定前，先按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。 测定供试品中杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积法，即内标法刘立行主编.仪器分析（第二版）.第71页. 中国石化出版社，2008年附录：思考题（1）标准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？ 答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后直接从标准工作曲线

14、上读出含量，适合于不同样品的分析。标准曲线法的缺点是：需要配制各浓度的标准溶液并准确测定；每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差；标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成有差别，因此必将给测量带来一定的误差。液相色谱法中常用的定性方法有：直接利用标准物质对照定性(用已知物质直接和未知样品对照定性是液相色谱定性分析中最简便、可行的定性方法。在一定的色谱条件下,各种物质均有确定不变的保留时间,故保留时间可作为定性指标)、与其它仪器结合进行定性（液相色谱法对未知物直接进行定性

15、有一定难度,而某些仪器,如质谱、红外光谱、核磁共振等是鉴定未知物结构的有效工具。通过将色谱与质谱等联用,互相取长补短,使较复杂的混合物先经色谱分离成单个组分后,再通过组分特定碎片离子组成的质谱图对其进行准确定性。常见的联用仪器有色谱-质谱联用仪,色谱- 红外联用仪等）、组分保留时间结合光谱图定性（配备有光电二极管阵列检测器的液相色谱仪,可利用色谱保留时间规律及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。配备紫外光度检测器的液相色谱仪也可获得分离组分的紫外吸收光谱。当试样组分通过流通池时,短时间中断液流,进行快速扫描,以得到紫外吸收光谱特征吸收曲线,但是该光谱特征吸收曲线不能完整输出,只能为定性分析提供信

16、息或据此选择最佳检测波长）；液相色谱法中常用的定量方法有：面积归一化法、主成分自身对照法、内标法、外标法。（2）如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？答：首先要知道这个化合物的化学结构、pKa值、极性、溶解性、稳定性（避光或低温保存）等化学物理常数，然后选择合适的样品处理方法，使样品有较好的萃取回收率和较少的干扰成分存在；而对于分离分析，如果使用紫外检测器，在这之前应先做个化合物的吸收波长扫描，以找出其最大吸收波长，然后依据峰形和化合物的pKa值进行水相的pH值调节，以找到最佳的流动相体系（保证了最大响应、最少干扰、最好的分离），再进行反相色谱实验，调整流动相中有机相的比例

17、，以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。然后改用不同的色谱柱，改变温度和流动相pH值，优化筛选溶剂的配比组成。（3）微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？ 答：样品及溶剂中的偶极分子在高频微波能的作用下,以109/s 圈的速度变换其正、负极,产生偶极涡流、离子传导和高频率摩擦,从而在短时间内产生大量的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂、离子迁移等加速了溶剂分子对样品基体的渗透,待分析成分很快溶剂化,使微波萃取时间显著缩短。（4）试比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点。答：液相色谱的优点有：1、气相色谱不适用于不挥发物质和对热不稳定物质，而液相色谱却不受样品的挥发性和热稳定性

18、的限制。有些样品因为难以汽化而不能通过柱子，热不稳定的物质受热会发生分解，也不适用于气相色谱法。这使气相色谱法的使用范围受到了限制。另一方面，液相色谱却不受样品的挥发性和热稳定性的限制。所以液相色谱非常适合于分离生物、医药有关的大分子和离子型化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定的化合物。2、对于很难分离的样品，用液相色谱常比用气相色谱容易完成分离，主要有以下三个方面的原因：液相色谱中，由于流动相也影响分离过程，这就对分离的控制和改善提供了额外的因素。而气相色谱中的载气一般不影响分配，也就是说，在液相色谱中，有两个相与样品分子发生选择性的相互作用；液相色谱中具有独特效能的柱填料

19、（固定相）的种类较多，这样就使固定相的选择余地更大，从而增加了分离的可能性；液相色谱使用较低的分离温度，分子间的相互作用在低温时更为有效，因此降低温度一般会提高色谱分离效率。3、和气相色谱相比，液相色谱对样品的回收比较容易，而且是定量的，样品的各个组分很容易被分离出来。因此，在很多场合，液相色谱不仅作为一种分析方法，而且可以作为一种分离手段，用以提纯和制备具有中等纯度的单一物质。在气相色谱中所分离出的各样品组分虽也可以回收，但一般都不太方便，而且定量性差。气相色谱法的优点有：1、分离效率高，分离速度快，操作简便。由于气体粘度小，用其作为流动相时样品组分在两相之间可很快进行分配：气体通过盛有固定

20、相管柱的阻力小，因此分离速度快。一根长1-2m的色谱柱，一般可有几千个理论塔板，对于长柱，甚至有一百多万个理论塔板，这样就可使一些分配系数很接近的、难以分离的物质，经过多次分配平衡，得到分离。2、样品用量少，检测灵敏度高。由于样品是在气态下分离和在气体中进行检测的，有许多高灵敏度的检测器可供使用，虽样品用量少也能检测出来。气相色谱可以检测出10-11-10-13g的物质。3、选择性好。可选择对样品组分有不同作用力的液体、固体作为固定相，在适当操作温度下，使组分的分配系数有较大差异，从而将物理、化学性质相近的组分分离开。取供试品，按各品种项下规定的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录

21、色谱图I；再配制含有内标物质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图。记录的时间除另有规定外，应为该品种项下规定的内标峰保留时间的倍数，色谱图上内标峰高应为记录仪满标度的30%以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。 如果色谱图中没有与色谱图上内标峰保留时间相同的杂质峰，则色谱图中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积（溶剂峰不计在内）。如果色谱图中有与色谱图上内标物质峰保留时间相同的杂质峰，应将色谱图上的内标物质峰面积减去色谱图中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面积；色谱图中各杂质峰总面积加色谱图中此杂峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。 按各

22、品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），从而计算出含量。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的维生素C，采用高效液相色谱进行分析，以维生素C标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中维生素C的峰面积，由标准曲线计算其浓度。2 材料与方法2.1仪器与试剂高效液相色谱仪：LC-20AT；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或DikmaC18柱 (250 mm&#

23、215;4.6 mm， I.D.5 m)；进样柱：白云x进样柱。气相色谱条件：汽化温度为200；检测器温度为250；载气（N2）总量为40 mL.min-1，分流比为30：1；氢气和空气流量分别为30 mL.min-1和300mL.min-1；程序升温：初始温度40，保持2min，升温速率为20min-1并升至150；进样量0.51L。试剂：乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；橘子、金桔、苹果等水果样品。实验用水为超纯水。 维生素C标准溶液：快速准确称取0.025 g 维生素C，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得

24、到100 mg/L标准溶液备用，现用现配。色谱条件：流动相：3%的乙腈0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速1mL/min；柱温30，紫外检测波长265 nm；进样量10L。2.2实验过程1、按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。2、样品准备：准确称取切碎的水果样品（质量在5.0g附近，记录准确质量），以1 mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为600 W，萃取时间为10 min，萃取温度设定为50，平行萃取两次。萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。3、定性分析：分别取10L 50 mg/L的维生素C标准溶液和供试品溶液，进HP

25、LC分析。根据保留时间定性分析水果中的维生素C。4、标准曲线绘制：分别配制5，20，50，80，100 mg/L的维生素C样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析。以维生素C色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。5、定量分析：供试品溶液经0.45m微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。记录其维生素C的色谱峰面积，根据标准曲线计算蔬果样品中维生素C的含量，结果以mg/100 g表示。3 讨论与结论3.1实验结果标准溶液的量记录：表一 标准溶液的HPLC色谱数据标准溶液浓度c /( mg·L-1)5205080100峰面积A139341591488156810325309853175985保留时间/m

26、in2.7942.8352.7682.8002.7783.2标准曲线的绘制根据峰面积对浓度作图：Figure 1 浓度与峰面积直线图由图所得峰面积（A）对标溶液浓度c的标准曲线方程为：A=32074c/(mg·L-1)-34595；相关系数R2=0.9999。3.3 样品提取液的测量结果记录分别以橘子、金桔、苹果三种水果的提取液为样品进行HPLC色谱分析，所得HPLC的色谱数据和色谱图如下：表二 样品的质量及HPLC色谱数据样品橘子金桔苹果样品质量m/g5.185.135.00保留时间t/min2.8322.8092.874峰高49345110501306峰面积A4592945193

27、531215Figure 2 橘子中维生素C的HPLC色谱图Figure 3 金桔中维生素C的HPLC色谱图Figure 4 苹果中维生素C的HPLC色谱图3.4水果中Vc含量的计算将测得的各种样品中维生素C色谱峰的峰面积代入3.2所绘制的标准曲线方程A=32074c/(mg·L-1)-34595，从而求出各种样品中的维生素C浓度；再根据提取液的体积（100ml）和样品质量，求出所测水果中的维生素C含量，结果记录如下表。表三.样品的数据处理表样品橘子金桔苹果样品质量m/g5.185.135.00峰面积A4592945193531215提取液中的Vc浓度c/(mg·L-1)15.4017.271.12水果中的Vc含量mg/100g29.7333.662.243.5实验误差分析实验过程中，可能出现的误差分两类：1、系统误差：高效液相色谱仪，微波萃取仪，量筒等的仪器误差；实验操作个人因感官和运动器官的反应或习惯不同而产生的误差；2、偶然误差：在定容量取和称量过程中的读数误差。 3.6实验结果分析标准曲线分析：通过紫外可见范围内全波长的扫描，发现265nm处为维生素C最大吸收峰，实测维生素C标准溶液响应时间均在2.802±0.034s的范围之内，最大相对误差仅为1.