第三章色谱分析法(液相)

1、 第第三三章章 色谱分析法色谱分析法高效液相色谱分析高效液相色谱分析3.1 概述（概述（P355）高效液相色谱法对比气相色谱高效液相色谱法对比气相色谱法的法的相同点相同点n基本理论一致：基本理论一致：保留值、分配系数、分保留值、分配系数、分配比、塔板理论、速率理论等配比、塔板理论、速率理论等n定性、定量原理和方法一致定性、定量原理和方法一致n仪器结构和操作技术一致仪器结构和操作技术一致n均可与其他仪器联用，以研究复杂混合均可与其他仪器联用，以研究复杂混合物物高效液相色谱法对比气相色谱高效液相色谱法对比气相色谱法的法的优点优点n对于高沸点对于高沸点（500） 、热稳定性差，、热稳定性差，相对分子

2、质量大（相对分子质量大（M400）的有机物）的有机物（占有机物总数的（占有机物总数的7580%）原则上都原则上都可分离可分离n流动相选择余地广流动相选择余地广n固定相是新型吸附剂，以化学键合固定固定相是新型吸附剂，以化学键合固定相居多相居多n样品的回收比较容易样品的回收比较容易高效液相色谱法对比气相色谱高效液相色谱法对比气相色谱法的法的缺点缺点n仪器原理及结构有差别仪器原理及结构有差别n流动相性质不同，使速率理论参数不同流动相性质不同，使速率理论参数不同n缺少通用型检测器缺少通用型检测器n“柱外效应柱外效应”对柱效率及色谱分离影响对柱效率及色谱分离影响较大较大n流动相价格较高流动相价格较高n流

3、动相有毒流动相有毒高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点n高压：高压：150350105Pan高速高速：n高效：气相色谱高效：气相色谱n约为约为2000塔板塔板/米米 液相色谱液相色谱n约为约为30000塔板塔板/米米n高灵敏度：紫外检测器：高灵敏度：紫外检测器：10-9g 荧光检测器：荧光检测器：10-11g3.2 高效液相色谱的基本理论高效液相色谱的基本理论(P356)n色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论 塔板理论塔板理论 速率理论速率理论速率理论速率理论 式中式中A，B，C为三个常数，其中为三个常数，其中A称为称为涡流涡流扩散项扩散项，B为为分子扩散分子扩散系数，系数，C为为传质阻力

4、传质阻力系数。系数。CuuBAH范弟姆特方程式的简化式范弟姆特方程式的简化式3.2.1 气相色谱的速率理论气相色谱的速率理论涡流扩散示意图涡流扩散示意图 涡流扩散项涡流扩散项ACuuBAH 涡流扩散引起的峰展宽的大小：涡流扩散引起的峰展宽的大小： A = 2dP 式中：式中：为填充不规则因子，它由为填充不规则因子，它由填填料颗粒直径料颗粒直径dP、粒度范围粒度范围和和柱填充状柱填充状况况决定。决定。 对于对于空心毛细管柱，空心毛细管柱，A项为零项为零。 CuuBAH 填料粒径对填料粒径对A项的影响项的影响 筛筛 目目dp(cm)A(cm)20400.040.0810.12501000.150.

5、0330.142004000.0040.00780.09纵向分子扩散使峰展宽纵向分子扩散使峰展宽(a) 柱内谱带构型柱内谱带构型 (b) 相应的响应信号相应的响应信号CuuBAH分子扩散项分子扩散项B/u(纵纵向扩散项向扩散项)CuuBAHn纵向扩散与组分在柱内的纵向扩散与组分在柱内的保留时间保留时间有关有关。nDg为组分在气相中的扩散系数（单位为为组分在气相中的扩散系数（单位为cm2s-1）。）。 Dg 反比于载气密度（相对分反比于载气密度（相对分子质量）的平方根。子质量）的平方根。n Dg随随柱温柱温增高而增加，但反比于增高而增加，但反比于柱压柱压。 CuuBAHn是因载体填充在柱内而引起

6、气体扩散是因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因数（弯曲因子）。路径弯曲的因数（弯曲因子）。n弯曲因子弯曲因子为与为与填充物填充物有关的因素。有关的因素。n若组分通过空心毛细管柱，若组分通过空心毛细管柱，=1；在填；在填充柱中，充柱中，BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系液液-液色谱和液液色谱和液-固色谱常用溶固色谱常用溶剂的极性顺序排列剂的极性顺序排列反相：反相：水水（极性最大极性最大），甲酞胺，），甲酞胺，乙腈乙腈，甲醇甲醇， 乙醇，丙醇，丙酮，二氧六环，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六环，四氢呋喃四氢呋喃正相：甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，正相：甲乙酮，正丁醇

7、，醋酸乙酯，乙醚乙醚， 异丙醚，二氯甲烷，异丙醚，二氯甲烷，氯仿氯仿，溴乙烷，溴乙烷，苯苯， 四氯化碳，二硫化碳，四氯化碳，二硫化碳，环己烷环己烷，己烷己烷， 庚烷，煤油（庚烷，煤油（极性最小极性最小）注：为了获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元注：为了获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相。或多元组合的溶剂系统作为流动相。 n各种各种阴离子阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子的滞留次序为：柠檬酸离子SO42-草酸离子草酸离子I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-，所以用柠檬酸离，所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。子洗脱要比用

8、氟离子快。 n各种各种阳离子阳离子的滞留次序大致为的滞留次序大致为:Ba2+Pb2+ Ca2+ Ni2+Cd2+Cu2+Co2+ Zn2+ Mg2+Ag+Cs+Rb+K+ NH4+Na+H+Li+，但差，但差别不及阴离子明显。别不及阴离子明显。 离子交换色谱离子交换色谱3.5 液相色谱法固定相液相色谱法固定相(P361) 3.5.1 固定相的基本要求固定相的基本要求n载体颗粒细小均匀载体颗粒细小均匀n固定液液膜薄固定液液膜薄n填充剂应耐压填充剂应耐压n载体制作重复性好，寿命长，热稳定性载体制作重复性好，寿命长，热稳定性好，耐溶剂，不与样品其化学反应好，耐溶剂，不与样品其化学反应3.5.2 液固

9、色谱固定相液固色谱固定相n全多孔型全多孔型担体担体（porous micro beads support）：氧化硅、氧化铝、硅藻土）：氧化硅、氧化铝、硅藻土制成的直径为制成的直径为100m左右的全多孔型担左右的全多孔型担体。目前粒度为体。目前粒度为510m的全多孔微粒的全多孔微粒担体是使用最广泛的高效填料。担体是使用最广泛的高效填料。 n表层多孔型表层多孔型担体担体：又称薄壳微珠担体：又称薄壳微珠担体（pellicuar micro bsads support）：）：直径为直径为30-40m的实心核（玻璃微珠），的实心核（玻璃微珠），表层上附有一层厚度约为表层上附有一层厚度约为12m的多的多孔

10、表面（多孔硅胶）孔表面（多孔硅胶） 。 微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆n堆积硅珠：堆积硅珠：纳米二氧化硅凝积成纳米二氧化硅凝积成30-40m的堆积硅珠的堆积硅珠3.5.3 液液分配色谱常用固定液液液分配色谱常用固定液n强极性的强极性的，氧二丙腈氧二丙腈n中等极性的聚乙二醇中等极性的聚乙二醇400n弱极性的角鲨烷弱极性的角鲨烷液液-液色谱担体液色谱担体 硅胶、氧化铝、分子筛、聚酞胺等。硅胶、氧化铝、分子筛、聚酞胺等。 仍可分为全多孔型和薄壳型两种，其仍可分为全多孔型和

11、薄壳型两种，其特点特点如液固色谱的固定相如液固色谱的固定相。目前较常使用。目前较常使用的是的是510m的硅胶微粒（全多孔型）。的硅胶微粒（全多孔型）。 n硅氧碳键型（硅氧碳键型（Si-O-C）n硅氧硅碳键型硅氧硅碳键型（Si-O-Si-C) n硅碳键型（硅碳键型（Si-C）n硅氮键型（硅氮键型（Si-N）3.5.4 化学键合固定相化学键合固定相多多时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-

12、苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点 n表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；n无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；n可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；用于多种色谱类型及样品的分析；n有利于有利于梯度洗提梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。馏

13、分的收集。 3.5.5 离子交换色谱法固定相离子交换色谱法固定相 n薄膜型离子交换树脂：以薄壳玻珠为担薄膜型离子交换树脂：以薄壳玻珠为担体，在它的表面涂约体，在它的表面涂约 1 的离子交换树的离子交换树脂而成。脂而成。n离子交换键合固定相：用化学反应将离离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。子交换基团键合在惰性担体表面。3.5.6 排阻色谱法固定相排阻色谱法固定相 n软质凝胶软质凝胶n半硬质凝胶半硬质凝胶n硬质凝胶硬质凝胶 3.6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪(P363) 五个部分：五个部分： 高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统 色谱柱色谱柱 检测系统检测系统

14、 记录仪记录仪3.6.1 贮液器及流动相贮液器及流动相n贮液器：耐腐蚀，能密封。贮液器：耐腐蚀，能密封。 常用不锈钢、聚四氟乙烯、玻常用不锈钢、聚四氟乙烯、玻 璃等。璃等。n流动相（溶剂）：过流动相（溶剂）：过0.45m微孔滤膜，微孔滤膜， 脱气（加热、抽真脱气（加热、抽真 空、吹氮、超声波）空、吹氮、超声波）3.6.2 输液泵（高压泵）输液泵（高压泵） 按性质可分为恒流泵和恒压泵两类按性质可分为恒流泵和恒压泵两类 ：n往复式柱塞泵往复式柱塞泵（reciprocating piston pump） 100 次次/min特点：不受整个色谱体系中其余部分阻特点：不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变

15、化的影响，力稍有变化的影响，连续供给恒定体连续供给恒定体积的流动相积的流动相。可调节流量。可调节流量。很适用于很适用于梯度洗提梯度洗提。不足之处是输出有脉冲波。不足之处是输出有脉冲波动。动。n气动放大泵（气动放大泵（pneumatio pressure intensifier） 特点：不适用于频繁更换流动相的选特点：不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的试验，也不便于梯度洗提择合适溶剂的试验，也不便于梯度洗提（需要用两台泵）。但它能供给无脉冲（需要用两台泵）。但它能供给无脉冲的、稳定流量的输出。的、稳定流量的输出。 3.6.3 洗脱方式洗脱方式 n等度洗脱等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂

16、洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）泵）n梯度洗脱梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）类和比例，即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）3.6.4 进样装置进样装置 n注射器隔膜进样注射器隔膜进样高分子有机硅胶垫高分子有机硅胶垫进样室进样室n注射器隔断式停流进样注射器隔断式停流进样 优点：优点：可以任意改变进样体积，注射快速，可以任意改变进样体积，注射快速，不

17、易造成峰扩张不易造成峰扩张缺点：缺点：无法测定保留时间，重现性较差，无法测定保留时间，重现性较差，试液容易渗漏试液容易渗漏GC系统压力较小，可以系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期）n高压定量进样阀高压定量进样阀 ：六通进样阀六通进样阀 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 定量定量（）（）（）（） 样样品品环环n高压定量进样阀高压定量进样阀 ： 优点：优点：不必停泵，进样量的可变范围大，不必停泵，进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化耐高压，易于自动化 缺点：缺点

18、：容易造成色谱峰扩张容易造成色谱峰扩张3.6.5 色谱柱色谱柱 n常用内壁抛光过的不锈钢制成常用内壁抛光过的不锈钢制成n标准柱型：内径为标准柱型：内径为4.6mm或或3.9mm，长为，长为15cm30cm的直形不锈钢柱。的直形不锈钢柱。 n液相色谱填充柱的填充方法：干法和湿法两液相色谱填充柱的填充方法：干法和湿法两种种n颗粒直径大于颗粒直径大于20m的可用干法填充的可用干法填充n颗粒直径颗粒直径10m以下的采用湿法装柱以下的采用湿法装柱n湿法装柱柱效可达湿法装柱柱效可达3万塔板万塔板/米米3.6.6 检测器检测器 n示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive

19、index detector ） 原理：利用折光率的差别进行检测，是原理：利用折光率的差别进行检测，是通通用型检测器用型检测器 缺点：灵敏度低，温度要求严格缺点：灵敏度低，温度要求严格通用性通用性检测器检测器n紫外光度检测器紫外光度检测器（ultraviolet photometric detector） ： 常用型检测器常用型检测器，检测限可达，检测限可达10-9gmL-1 优点优点：这种检测器对温度和流速不敏感，：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度洗提适宜于梯度洗提 缺点缺点：不能用于对紫外：不能用于对紫外-可见光完全不吸可见光完全不吸收的试样的检测收的试样的检测常用性常用性检测器检

20、测器 光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（photo-diode array detector）是紫外可见光度检测器的）是紫外可见光度检测器的一个重要进展。一个重要进展。n荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector） 优点优点：一般情况下，荧光检测器比紫外：一般情况下，荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高光度检测器的灵敏度要高2个数量级个数量级 缺点缺点：其线性范围约为：其线性范围约为103 只能分析自身发光的物质只能分析自身发光的物质 n电导检测器电导检测器（ electrical conductivity detector ）：）：离子色谱法中使用最广泛的离子色谱法中使用最广泛的检测器检测器。 原理原理：根据物质在某些介质中电离后所：根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。产生电导变化来测定电离物质含量。 缺点缺点：受温度的影响较大，严格