石油脱硫微生物的筛选及特性研究

1、石油脱硫微生物的筛选及特性研究摘要从泰安某加油站采集土壤样品，筛选到一株可以专一性降解二苯并囉 吩(dbt)的菌株，经常规和生理生化鉴定判断为红球菌属(rhodococcus sp.), 命名为yy-5o对dbt的降解产物经分析为二疑基联苯(2-hbp).二苯并囉枫 (dbto2)和硫酸根离子，完全符合“4s"途径。产物用gibb' s试剂结合分光光 度计测试，测算出菌株的脱硫能力。脱硫试验表明，dbt浓度对菌株的脱硫能 力也有影响，dbt浓度过高，会抑制菌株的脱硫能力。一般在54h左右yy5 的酶活性开始降低，在80 h左右完成脱硫。在以正十二烷、正十六烷、液体石 蜡、蔡和

2、柴油为碳源的培养基中生长不旺盛，不能利用上述坯类作唯一碳源和能 源。说明yy5在脱硫过程小不会明显降低燃油的燃烧值。另外试验也表明，有 机氮对菌的脱硫活性有抑制作用。关键词二苯并噬吩；微生物脱硫；筛选；红球菌属；脱硫率硫是地球上广泛分布的元素2，约占地壳总质量的0.052%o硫基本以化 合物的形式存在于各种矿物和化石燃料之屮，少量为单质形式的硫磺。化石燃料 含硫量为0.1%6.0%o目前世界坏境问题严重，各国都在着手研究环境问题的解决方案。其中矿物 燃料燃烧生成硫化物，在大气中形成酸用，污染土壤的同时，也破坏了陆地生物 圈的生态平衡。酸雨作为硫污染之一，对北欧地区的污染最为严重，导致湖泊屮 鱼

3、类和浮游生物死亡，土壤表土营养物质淋溶，生态受到严重损坏。2013年初 因为中国汽汕、柴汕质量不合格，汽车尾气排放污染空气，导致北京，成都等交 通拥挤的城市形成经久不散的大雾，不仅市民的生活出行受到影响，对身体健康 也有一定损害。此外，在石油的炼制过程小，输送管线及相关设备都会受到原油 或憾分油屮硫的腐蚀1。加氢脱硫(hydrodesulfurization hds)法是目前常用的 化学脱硫法，其原理是通过催化过程将有机硫化物转化成h2s气体，该法的缺 点在丁反应要求高(高温高压)、脱除不彻底、成本高，且难以达到现在严格的 污染排放标准。石油生物催化脱硫是利用微生物产生特定的酶选择性地将油品屮

4、含硫化合 物转化为水溶性硫化物，具有高度的选择性，可以脱除hds技术难脱除的残余 有机含硫化合物。而h不需催化剂，不会产生额外污染。低能耗，硫的回收率高。 目前生物脱硫研究技术的机理主要是以二苯并嗥吩(dbt,针状结晶，熔点 99 °c,沸点332333 °c,联苯及苯硫瞇结构)为模型化合物来表征的，在微 生物酶的作用下脱硫。生物催化dbt杂环类姪脱硫有2种氧化形式：c-c键断裂氧化和c-s键断裂 氧化。20世纪70年代初，kodama etc研究生物石油脱硫提!l! dbt生物降解的 “kodamf代谢途径，虽然可从姪屮分离含硫化合物，但有机硫没有从朵环类化 合物屮脱除，

5、反而降低了有价值桂的燃烧值。1989年kibne在研究igts细菌 脱除煤中有机硫时，从理论上提出了生物降解dbt的一种可能的“4s"代谢途径: 二苯并嗥吩中的硫经过4步氧化，反应的硫中间体分别是dbt亚矶，dbt-w, dbt男基磺酸，最终生成2超基联苯(2-hbp)o硫是以so2的形式从冇机物屮 除去的，对坯不发生降解。对不同的菌株，4s途径并不完全相同，被认为有2 种脱硫途径，但共同的特点都是对cs键作用2。口前已经有大量国内外学者 投入研究35。据报道，采用bds可使油品硫含量最终指标低于hds工艺10 倍，如从hds的0.1%降至bds的0.01%的硫含量。目而适合研究石油

6、脱硫的 菌株有：玫瑰红球菌(rhodococcus rhodochrous )、红串平红球菌(rhodococcus.erythropolis)> 球形诺卡氏菌(nocardia globelula)、嗜热芽他杆菌 (paenibacillus sp.)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium sp.)、戈登氏菌(gordona sp.)、 节杆菌(arthrobacter sp.)、球形芽抱杆菌(b.sphaericus)和枯草芽抱杆菌(bacillus subtilis)等。该文对加油站附近土壤中的脱硫微生物进行筛选，并对其特性进行 研究。1材料与方法1.1试验材料1试验仪器。

7、紫外分光光度计、生物培养箱(lrh2252g)、微生物多用 培养箱(wdp)、超净工作台、无菌条件下g5漏斗真空抽滤。1.1.2试验样品及培养基。样品为采自泰安某加油站土壤2()份。富集培养基: nh4c1 (0.1 g/l), mgc12 (0.48 g/l), kh2po4 (0.32 g/l), cac12-2h2o (0.08 g/l), u油(5g/l),去离子水1 oooml, ph值7.072 灭菌后加无菌曝吩5 mlo分离培养基(g/l)：营养肉汁培养基。摇瓶基本培养基：廿油(10g/l), nh4c1 (5.0 g/l), kh2 po4 (6.3 g/l), k2hpo4

8、(810 g/l), mgc12-6h2o (12g/l),微量元素液 1 ml,维生素液 1 ml, 去离子水1 000 ml, ph值7.07.2,无菌嗥吩5 ml/l培养基(灭菌后分别加入), dbt2正十六烷液，500 mg/l dbt培养基(灭菌后分别加入)。微量元素液： fec13-4h2o (0.5 g/l), znc12 (0.5 g/l), mnc12-4h2o (0.5 g/l), namoo4-2h2o(0.1 g/l), cuc12 (0.05 g/l), coc12 (0.02 g/l), hc1 调节 ph 值至 23。纟隹生素液:泛酸钙(400 mg/l),肌醇(

9、200 mg/l),烟酸(400 mg/l),盐 酸毗多辛(400 mg/l),复合维生素b (15 mg/l),去离子水1 000ml6o 1.2试 验方法1.2.1脱硫菌的富集和分离。从泰安炼油厂等地采集的土壤污染样品，置于 dbt选择培养基中(dbt浓度0.15 mmol/l),在恒温27 °c条件下，100 r/min 振荡富集培养3d。取培养物上清液在相同条件下继续培养3d。取培养物高速离 心10 min,取上清液做gibb' s分析。取反应呈阳性的培养物接种于选择培养基, 27 °c静置培养3d。取生长状态好的单菌落培养物做gibb' s分析，有

10、蓝色物质 生成的即为口的菌株。1.2.2脱硫菌株的鉴定。形态特征：冇弯杆状和杆状2种形态，在牛肉膏 蛋白淼固体培养基上，生长中等，黄油状黄色，菌落平坦，不透明，凸起，有光 泽，不产生水溶性色素，边缘整齐。在营养肉汤培养基屮形成表面膜，培养液则 保持澄清。生理生化特征：按照常用细菌系统鉴定手册7进行鉴定。1.2.3 16s rdna序列分析。以菌株基因组dna为模板，用16s rdna通用 引物扩增得到近全长的16s rdna.pcr产物测序后在national center for biotechnology information (ncbi)使用 clustal w version 118

11、 和 phyl ippackage programme进行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较。1.2.4脱硫试验。准备5个250 ml三角瓶，每个加入50 ml dbt浓度分别 为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l 的基础培养基,室温 27 °c, 180 r/min 振荡 培养。对照为不加dbt的yy-5菌株培养基，1 d后用正己烷萃取剩余的dbt。 4 °c, 8 000 r/min离心20 min,用气相色谱分析dbt百分比。1.2.5菌株的脱硫特性研究。将培养液预处理后，用等体积二氯甲烷萃取， 30 min后8 000 r/min离心。在萃取

12、液中加入无水硫酸钠脱水并干燥。用kd浓 缩器吹高纯氮浓缩，50 °c水浴，gc-ms分析。dbt浓度对菌株yy5脱硫率 的影响。dbt脱硫试验步骤：取50 ml基础培养基5个，加入dbt使浓度分别 为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l,室温 27 °c。200 r/min 振荡培养。菌株 yy5 的专一酶将dbt脱硫后，经“4s”途径的代谢终产物为2-hbp,与gibb' s试剂 反应生成蓝色靛酚衍主物，该衍主物在610 nm存在最大吸收峰。菌体离心后， 取上清液与gibb' s试剂反应，再用722e分光光度计测定od610,通过吸光度

13、值与2-hbp的浓度的标准曲线算出培养液中2-hbp的浓度，以测算菌株的脱硫 能力。碳、氮源对菌株生长脱硫的影响。一是菌株生长曲线的测定：取该菌株 培养物测出其最大吸光度。取生长3 d后的菌株分别接种在10个三角瓶屮，室 温摇床培养。每隔5 h取一瓶稀释10倍。测定最大吸光波长的吸光度。画出生 长曲线，吋间为横坐标，吸光度为纵坐标。二是在50 ml基木培养基屮，分别 加入1%的正十二烷、正十六烷、液体石蜡、蔡、柴油、甘油、葡萄糖、蔗糖、 可溶性淀粉、醋酸钠为碳源，接种量2ml,室温27 °c, 120 r/min摇床培养3 d 后，取样分析。三是在摇瓶基本培养基中，分别加入牛肉膏、酵

14、母膏、蛋白豚、 氯化钱、硫酸镀和磷酸二氢钱作氮源，接种量2ml, 30 °c, 120 r/min摇床培养 48 ho2结果与分析2生理生化特征对菌株yy5进行生理生化鉴定，革兰氏染色阳性，水解淀粉酶阳性，氧化 酶阴性，葡萄糖阳性，亮氨酸阳性，甘露糖阳性，麦芽糖阳性，谷氨酸阳性，乙 醇阳性。2.2 16s rdna 鉴定在 national center for biotechnology information (ncbi)使用 blastn 程序 比对，对给出的序列使用vector nti软件制作进化树，yy5和红球菌位于同一 个分支上，所以初步鉴定yy-5为红球菌属。2.3筛选

15、菌株的脱硫效杲观察及产物分析在试验过程中观察到，dbt在筛选到的脱硫菌作用下，逐渐变为可溶性物 质，后来部分形成了白色的沉淀。一般在80 h左右基木完成降解反应。由gc-ms 分析得出3个保留时间分别为21.04、23.25、24.64 min。对应的组分进行离子扫 描分析,对应的保留时间为23.25、24.64、21.04 min。由此得出3个分子量170、 184、216o可以推定，分子量为184的化合物是dbt,分子量为170的是2-hbp, 分子量为216的是二苯并bwo将培养液离心后取上清液，加入二氯化钞!，生成 了白色沉淀，再加稀硝酸，沉淀不溶解。说明此降解反应述牛成了硫酸根离子。 综合产物说明，此菌株脱硫过程完全符合“4s途径二2.4 dbt浓度对脱硫率的影响从脱硫试验可以看出：dbt浓度过高反而抑制了菌株的生长，进而抑制脱 硫率。如图1所示，从脱硫率测定的试验中，吸光度即反映出菌株的生长曲线。 dbt浓度反映菌株脱硫量。在菌株对数期和稳定期，对dbt的降解速度最快。 过了稳定期后，dbt的降解越来越缓慢，在55 h后基本停止。2.5碳、氮源的影响按照惯例，液体石蜡代表有支链的饱和烷桂，止十二烷