实验六动物染色体标本的制备与观察

1、安徽大学细胞生物学精品课程实验六 动物染色体标本的制备与观察实验简介：染色体是细胞内遗传物质的载体。骨髓细胞具有丰富的细胞质和高 度的分裂能力，可直接观察到细胞周期中的各个时相。但通常情况下， 中期染色 体在镜下的数量较少，如经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞大多被阻断在有丝分 裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可得到理想的染色体标本, 用以观察中期染色体形态和染色体组型分析等实验。实验学时3 个。一、实验目的1. 初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。2. 了解常用实验动物染色体的数目及特点。二、实验原理染色体的分析往往是选择细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处

2、理后细胞进 入分裂的动物组织。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注 射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气 干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。在动物实验时，可在取材 前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析 是非常有用的。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。因 此骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。三、实验材料（一）材料 昆明种小白鼠若干只。（二）器材 水平离心机、显微镜、刻度离心管（10m1、注射器（1m1、载玻片、烧杯（400m1、100m1、试管架、镊子、剪刀、

3、解剖刀、吸管、擦镜纸。（三）试剂1. 2柠檬酸钠溶液：称取 28g 柠檬酸钠 （柠檬酸三钠， Trisodium citrate，AR 溶解于蒸馏水中。2. 1柠檬酸钠溶液。安徽大学细胞生物学精品课程3. 200 卩/gml 秋水仙素（cochicine4. 姬姆萨（Giemsa原液（P H6.8Giemsa 染料（Giemsa sta in 1g甘油（glycerine, AR 33ml甲醇 （methyl alcohol， AR 45ml将染粉倾入乳钵，加几滴甘油，在乳钵内研磨直到无颗粒为止，此时再将全部 剩余甘油使6065C保温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备 用。5.

4、 0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8Na 2HPO 4. 12H2O 11.81g（或 Na 2HPO 4. 2H2O 5.92gKH 2P04 4.5g溶解于蒸馏水中至 1000m1。6. 姬姆萨（Giemsa应用液（pH6.8取 1ml 姬姆萨原液用 9ml 0.067mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH 6.8 稀释即可。当天临 时配制，一天后失效。7. 甲酸(AR8. 冰醋酸 (Acetic acid glacial,AR90.4KCl(potassiumchloride，AR 溶液四、实验操作1. 秋水仙素处理 动物按4卩gg体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，34h后杀 死动物。

5、2. 取骨髓 取出动物后肢的胫骨和股骨，剪去两端骨骺。将0.61ml 2柠檬酸钠用 1ml 注射器接上 5#针头注入骨髓腔，将骨髓细胞先冲入小培养皿中，取下 注射器针头，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入 10ml 离心管。3. 低渗处理 视骨髓量之多少，加入0.4%KCI溶液810ml，随即将离心管置 37C水浴中低渗10min。4. 固定 1000rgmin 离心 8min 。弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲安徽大学细胞生物学精品课程醇：冰醋酸 (3：1 固定液 5ml ，加固定液时，注意不要冲动细胞团块。加完固 定液后，立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20 min。如此反

6、复固定23次，每次 20min 。5. 滴片 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。在干净、冰冷的载玻片上滴23滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干，在空气干燥 30min 。6. 染色将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1: 10 Giemsa应用液 0.21m1,染色 10min。7. 冲洗 在自来水管下细流水冲洗 15s ，洗去 Giemsa 应用液，用滤纸吸干玻片 标本，置于显微镜观察。五、结果1. 在显微镜下可观察到染色体被 Giemsa 应用液染为紫红色或桃红色。小鼠染 色体数目 2n=40。2. 在低倍镜下可见

7、较多的圆形的间期细胞核。寻找染色体分散良好的中期分裂相，移至视野中央，然后用油镜观察。在油镜下，可见40条清晰的染色体，每条染色体中，还可以见到着丝粒、染色体长臂和短臂等特征。六、注意事项1. 秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。通常情况下，小鼠按4卩g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，34h后处死小鼠，此时观 察中期染色体特征明显。注射时间过短或过长，在镜下可见间期细胞多，而中期染 色体形态少。如果在显微镜下能观察到 50% 80%中期染色体，说明试验操作相当 成功。2. 由于小鼠的股骨较细，因此应细心地剥去皮肤，然后用手术剪剪去两端骨 骺，用装有 2柠檬酸钠溶液的注射器

8、针小心插入骨髓腔将溶液注射完毕，并反复 从两端冲洗将骨髓冲出来，吹洗直至骨腔变白。此外要防止注射针头阻塞。3. 低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗 处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失。低渗处理时间不足，细胞内染色安徽大学细胞生物学精品课程体则易聚集在一起，不能很好伸展开来，观察时无法区分和计数。4. 固定液要现配现用。用固定液固定染色体形态至关重要，固定时间要充分， 应在20 min以上。5. 载玻片要事前要酸液浸泡2448h，自来水反复冲洗后，双蒸水冲洗后，烘 干备用。临用前，用洁净纸包裹置于 4C冰箱中。6. 对于离心过后的沉淀于管底中的沉淀物，要用吸管吸入固定液将细胞轻轻吸 打均匀。尤其最后一步，如