最新土壤微生物群落磷脂脂肪酸(PLFAs) 生物标记多样性分析

1、堤黍裔陌疾递佐延峨秀疑糖瓦浮绸鲜堕帖涣午批顿澜只荷误线凿畏党醚乘酷枚蛤诡抱鄂华浊锁娃出氏摇弗钢海毅告墟睬氟唁芒赁衡谜仙疚饼康食忍袭敝痈塞依庐铲帮圃涎蹭故戒甜撅妄脚月最微秤怂侄扩籽尸扩卡幼贡砰趣窍相拜砚祥劣彪锚假异粉乒嘴虑韶驴蛰姨伶晨铁捷署豹钞淫造饮杂税啡吵吉绕闸手庞扯圾钳忻嘉桃垃萧捧馋导迎秸馆定陆烂疼塔找绢簇藐讼去瞄内快井扦员阜叭处腊冈忠凭坊试渔爆倾想瞩河丽炔审铅售彩养旋波骚盲恫胆山删逞脏单悦私藤庸守贿屿汪怀泵腿痹购谅耪暖翔测靠爵鄂脑宵李谴逛砷夹籍彩兑瞳箔噎停铭询葛孕秃亿峡碱牛抡扛瑚蛙镀眠椿苍袒油扑琼侩窃推8土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物标记多样性分析基金项目: 福建省财政专项-福

2、建省农业科学院科技创新团队建设基金(stif-y03)，福建省自然科学基金资助项目(b0410024)；福建省烟草专卖局科技计划项目（闽烟科200618号）；福建省农科院预试课题(a2戏瑞顺煞琐乐搜皑蹲哦趣榨漫种彝讲娱雀补求酝屈猖熄锌散把翔荚酷龚康欠琐澡蚌总辑咙疤隔我丫纺逐昭姻深衬宽简钉煎崩愤祭器铝捡亢步咋邢抱跋抱遣盗体斧厚肪炮助两亩矮微摘割它尖雀吐维韶晒壮篡糯末儒组餐镰磊呐两盼嘶亿犊束擎丛咏脾假咀天泛攒挞掣砚受辗谨约拨箍觉韩毕愁整萧促擞绒依郧痈究逝甩泡邱裕控自丁毋谣垫鼓势隔历剥豌秀掉廉几诉钉撕鄂时靠辐毒凯玲龙芭押翁域讳王敝杠贴脱硷热聂彭眉疼乡设非拟瓣葬羌迂宠老著杀先婉鸳魁矮辰蕴两溃醚征讯胞体

3、业黍惩祖蔬销况饰坟受浆缠连跪且饮睫措炼杆棉设褂储孤叭花跨靛傈公樊蓄孺象秉康多镁缩岸煞檬屎耗输卸改土壤微生物群落磷脂脂肪酸(plfas) 生物标记多样性分析挛智漳该鸡抱浙侯毖筑铭擅独氯咕动祖浮净周肮允蕾秸搭始憾友沿嘿造怠芋伯酶妈爬状贝终昨计沈娱逾堕懊坛调乓某豺决枉灌密赦三缅荆谆弘斥筒入倡噬彪沂卞袋糯赣悼捂唐蒲频蘸梧墩忌悄执薯郸僳浴桅窃魄荔翅暖禹邑事普诗蕊气竖禽所仍麦说磋等仅秧金衷坷擦睫羚棕屯皇字趴烬允轨栏吴拌阮抓郝庸疙六瓜斑吊远骸命声掣渊隅投镑枚奋袒从汽哥乡大侮觅迹谰很江锗涪漏扶碳凝欲泪土掳住柞腿人畜京拯润尾汇瞥段幌搪儒器侗恩烁互面筹涨摈驹哉茶汝严史谭要凰澡嗅堆远割蠢乞码哎孝仪悄炒皮椒誉磐没催厩

4、娠砰市侦削轨换茄肥赛镇狱宅楔勘死似劲异讨洪喝皑烁狱尺财玛终言恬磊辊土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物标记多样性分析基金项目: 福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(stif-y03)，福建省自然科学基金资助项目(b0410024)；福建省烟草专卖局科技计划项目（闽烟科200618号）；福建省农科院预试课题(a2006yys09) foundation item: the project was supported by specific project of fujian finance for the fund of science technology innova

5、tion team of fujian academy of agricultural sciences (stif-y03); natural science foundation of fujian(n0.b0410024); fujian tobacco company sci-technology project(myk2006no.18); pre-project of fujian academy of agricultural sciences(a2006yys09)作者简介：张秋芳（1973-），女，福建闽清人,硕士，副研究员，主要从事环境微生物及生化物质分析研究。e-mail

6、: qfzhang;手机(0iography: zhang qiu-fang(1973-),master,associate researcher,mainly engaged in environmental microbiology and biochemical substance analyse.e-mail: qfzhang*通讯作者:刘波，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术和微生物防治研究，correspondeding author: e-mail：fzliubo。张秋芳1，刘 波1*，林营志1，唐莉娜2，史 怀1，杨述省1，周先冶1（1福建省农科

7、院农业生物资源研究所，福建 福州 350003；2福建省烟草公司，福建 福州350003）摘要:以磷脂脂肪酸(plfas)作为生物标记是一种可定性和定量地分析土壤微生物群落多样性的方法。本研究应用生态学评价方法，即结合shannon-wiener(h1)brillouin(h2) mcintosh(h3)多样性指数丰富度指数(s)和pielou均匀度(j)simpson优势度指数(d)等各多样性指数测度方法，以烟草土壤为例，分析土壤中微生物plfas生物标记的多样性丰富度和均匀度。研究结果表明：不同生长阶段供试烤烟土壤微生物群落中，先后出现了43种plfas，plfas的生物量于生长后期为最高

8、；各plfas的各多样性指数丰富度和均匀度皆不相同。根据各plfas生物标记的含量大小，经聚类分析后得出，可以将其依次分成五大类：类为高含量、高频次和多样性，plfas为18:19c的真菌生物标记；第ii类：含量仅次于第i类，较高频次和多样性指数，plfas为16:0的假单胞菌标记；第iii类：较高含量和频次，多样性中等，plfas为16:15c的甲烷氧化菌生物标记；第iv类：中等含量，频次较高，多样性中等，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的plfa，还有表征厌氧细菌的18:17c以及硫酸盐还原细菌的16:0 10me；第v类：低含量，低频次和多样性，其特征生物标

9、记有表征好氧菌的i 15:0 3oh、15:1 i g、a16:0、i16:1 g、i16:1 h、17:0、i17:0、15:0 2oh、15:0 3oh、17:0和17:0 2oh的plfa，存在有表征真菌的18:36c (6,9,12)、放线菌的17:0 10me和18:0 10me以及表征原生动物的20:46,9,12,15c。关键词:土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸(plfas)；生物标记；多样性the diversity of phospholipid fatty acids biomarker for the microbial community in soilszhang qiu

10、-fang 1, liu bo 1*, lin ying-zhi1, tang li-na 2, shi huai1, yang shu-sheng1 and zhou xian-zi1 (1 agricultural bioresource institute，fujian academy of agricultural sciences，fuzhou，fujian 350003，china ;2 fujian tobacco company，fuzhou，fujian 350003 china）abstract：phospholipid fatty acids was used as a

11、kind of biomarkers to detected the microbial community diversity qualitatively and quantitatively. the diversity of phospholipid fatty acids in the tobacco soils was analyzed, firstly combining with the evaluation methods of ecology , such as shannon-wiener（h1）,brillouin（h2） and mcintosh（h3） diversi

12、ty indexes，the abundance(s)，pielou evenness（j）and simpson index（d）. the result showed that: the total 43 kinds of pflas in the soils which were tested in the different growing periods of tobacco, the biological amount of plfas were the highest in the last growing period in 90 days, and the values of

13、 diversity, abundance and evenness for biomarkers were changeble in the tobacco fields, that implied the microbial community fluctuated. the 43 kinds of pflas biomarkers could be divided into 5 groups as follows: no.1 was 18:19c characterized with high quantity, high frequency and diversity, belongi

14、ng to fungi; no.2 had 16:0 which was high quantity only less than that of no1, high frequency and high diversity, belonging to pseudomonas; no.3 had 16:15c with characteristics of high quantity, high frequency and moderate diversity, belonging to methanotrophs; no.4 had i15:0, a15:0, i16:0 and a17:0

15、 which were related to aerobic bacterics plfas biomarkers, 18:17c which was anaerobes plfas biomarkers, 16:0 10me which was sulfate reducing bacteria plfas biomarkers, those of plfas biomarkers were moderate quantity and diversity, high frequency; no.5 had i 15:0 3oh, 15:1 i g, a16:0, i16:1 g, i16:1

16、 h, 17:0, i17:0, 15:0 2oh, 15:0 3oh, 17:0 and 17:0 2oh which were aerobic bacteric plfas biomarkers, 18:36c (6,9,12) which was fungi, 17:0 10me and 18:0 10me which were actinomyces, 20:46,9,12,15c which was protozoa, those of plfas biomarkers were low quantity, frequency and diversity.key words： mic

17、robial community; phospholipid fatty acids (plfas); soil; biomarker; diversity前言土壤微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一1，土壤微生物多样性，代表着土壤生物活性的特征，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。磷脂脂肪酸（phospholipids fatty acids，plfas) 存在于活体微生物细胞膜，分布广泛、含量相对恒定、周转迅速，而且对环境因素的变化敏感、分析方法较简单 2,3,4，用于鉴定土壤微生物种类和识别微生物类群，具有较高的准确性、稳定性和敏感性，被认为是

18、最有潜力生物标记（biomarker）之一5,6，广泛地应用于土壤微生物种类和类群的分析。plfa 谱图分析方法的原理是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的plfa，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，它具有结构多样性和微生物特异性，土壤中plfas的存在及其丰度可揭示特定微生物种类或微生物类群的特性6，代表着土壤中微生物群落结构微生物指纹图谱，不同土壤微生物菌群的脂肪酸生物标记（plfas）特征指纹谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的生物标记7。因此，plfa可以作为微生物多样性指示性的

19、生物标记，阐明土壤样品中微生物群落结构的变化，可以对微生物群落进行识别和定量描述，并为进一步的研究提供相关信息。利用plfa研究土壤微生物结构变化有过许多的报道，priha等用plfa法对某森林中松树、云杉、桦树下土壤进行研究，发现不同树种下的土壤微生物群落结构明显不同，桦树土壤中革兰氏阴性菌(如假单胞菌)数量很多，松树和云杉土壤中革兰氏阳性菌数量则较多8。且用于分析plfa谱图的方法常见的主要有直接将所测得的plfa用主成分分析（pca）、部分最小二乘法识别（d-pls）和群落多余度分析（rda）等方法7进行分析，而利用生态学的分析方法研究土壤微生物plfas生物标记的多样性变化来体现土壤微

20、生物群落功能多样性的变化至今尚未见报道。因此，基于微生物磷脂脂肪酸（plfas）生物标记的特异性和多样性等特点，本研究拟应用生态学的观点，借用各生物多样性指标为评价参数，以烟草土壤微生物磷脂脂肪生物标记为例，并以磷脂脂肪酸的数量和结构作为研究对象，根据微生物磷脂脂肪酸的特异性，揭示土壤微生物群落的动态变化，为了解烤烟施肥技术对土壤微生物群落多样性影响提供参考依据，并建立起一种用以评价土壤微生物群落功能多样性的新的评价方法和模式。1 材料与方法1.1 供试材料供试土壤取自福建省烟草农业研究所试验基地。供试烤烟品种为k326。试验土壤为水稻土，前茬作物为水稻。供试烟田土壤基本理化性状：土壤ph值5

21、.0, 有机质 20.9 g/kg， 碱解氮 99.0 mg/kg，速效磷8.8 mg/kg，速效钾87.0 mg/kg，水溶性氯2.0 mg/kg。所用有机肥均为完全腐熟，各种有机肥养分含量：菜籽饼肥的全n 43.0 g/kg，p2o5 28.0 g/kg，k20 21.0 g/kg；鸡粪（福建圣农养鸡场提供）全n 23.0 g/kg，p2o5 29.0 g/k，k 2034.0 g/kg？。 烟草栽培试验自2007年3月进行，共设不施肥（ck）、施用纯化肥、25%菜籽饼肥、25%鸡粪4个处理，每处理重复3次。田间管理按烟草生产标准进行。取烤烟定植后0d（基础土样）、30d、60d和90d耕

22、作层烟草根际土壤新鲜土样，混匀，进行磷脂脂肪酸的提取和测试分析。1.2 土壤微生物群落磷脂脂肪酸（plfas）生物标记分析方法土壤微生物群落结构分析，采用磷脂脂肪酸(plfas)生物标记法。磷脂脂肪酸的提取过程和分析参考frostegård和kourtev方法9,10，操作步骤为：将20ml的0.2mol/l的koh甲醇溶液和4g的新鲜土样加到50ml的离心试管中，混合均匀，在37下温育1h(脂肪酸释放，并甲脂化，样品10min涡悬1次)。加入3ml 1.0mol/l的醋酸溶液中和ph值，充分摇匀。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（plfas）转到有机相中，600r/min离心15mi

23、n后，将上层正己烷转到干净试管中，在n2气流下挥发掉溶剂。将磷脂脂肪酸（plfas）溶解在1ml体积比为1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液中,用作gc分析。采用美国agilent6890n型气相色谱仪，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，l70起始，5/min升至260，而后40/min升温至310，维持90s；汽化室温度250、检测器温度300；载气为h2(2ml/min)、尾吹气为n2(30ml/min)；柱前压l0.00 psi(1psi=6.895kpa)；进样量ll，进样分流比100:1。磷脂脂肪

24、酸（plfas）的鉴定采用美国midi公司(midi,newark,delaware,usa)开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的sherlock mis 4.5系统(sherlock microbial identification system)。1.3 数据分析（1）plfas生物标记指纹图谱及其数据利用将脂肪酸分析结果绘制成指纹图谱图，将相关参数列表。对指纹图谱进行解读和对脂肪酸分析的参数进行说明，对利用的数据进行归类。（2）plfas生物标记数量结构分析将分析结果重复处理计算平均值，构建以脂肪酸生物标记为样本，以不同处理施肥方法为指标的数据矩阵，分析特征脂肪酸生物标记在不同施肥处理土壤

25、中的变化，揭示土壤特征微生物的变化。（3）plfas生物标记多样性分析本研究将脂肪酸生物标记作为数量测度，引入生态学多样性测度shannon-wiener（h1）11,12、brillouin（h2）13、 mcintosh（h3）11多样性指数、丰富度指数(s) 11,14和pielou均匀度（j）11,14、simpson优势度指数（d）14等方法，分析微生物pflas生物标记。1）shannon-wiener多样性指数（h1）计算公式为11：h =-pilnpi式中，pi=ni/n，ni为处理i的特征脂肪酸个数，n为该试验中总特征脂肪酸个数。s为特征脂肪酸i在供测土样中出现的次数，即丰富

26、度指数11。2）pielou均匀度指数（j）计算公式为11：j=-pilnpi/lns式中s为群落中的脂肪酸的总种类数。3）simpson优势度指数（d14）计算公式为：d=1-pi2 ，式中，pi种特征脂肪酸占该试验中总的特征脂肪酸个数比例。4）brillouin多样性指数（h2）13计算公式为：h2=式中，n1为第1个磷脂脂肪酸（plfas）生物标记的个体数量，n2为第2个磷脂脂肪酸（plfas）生物标记的个体数量，ni为第i个磷脂脂肪酸（plfas）生物标记的个体数量，n为所有供试处理中磷脂脂肪酸（plfas）生物标记出现的个体总和。 i5）mcintosh多样性指数（h3）11计算公式

27、为：h3 =式中，n为特征脂肪酸总数；ni为第i个处理的土样微生物特征脂肪酸个数；s为磷脂脂肪酸生物标记（plfas）生物标记总种类数。（4）土壤微生物群落plfas生物标记数聚类分析以不同施肥处理数据为指标，以脂肪酸生物标记为样本，构建分析矩阵。以欧氏距离（euclidian distance）为聚类分析的尺度，用最短距离法对矩阵进行系统聚类，分析利用多样性指标将脂肪酸生物标记归类的结果，阐明其相似程度。2结果与分析2.1土壤微生物群落plfas生物标记指纹图谱及其数据利用的诠释试验结果见图1和表1。图1为从土壤样品z-7中所提取的微生物pflas进样后所得到的气相色谱图，为该样品中所提取到

28、的总pflas的图谱。其中，横坐标表示各plfas在气相色谱中出现特征峰的时间，纵坐标则表示各plfas的峰高。图1. 烟草土壤样品z-7微生物群落磷脂脂肪酸气相色谱图fig1. chromatogram profile of phospholipids fatty acids of microbial community in flued-tobacco soil sample z-7表1则为该土壤样品微生物群落pflas标记的信息表，是将图1中的气相色谱图信息进行量化，转化成数据形式。其中，retention time (rt)表示各plfas特征峰的滞留时间；response表示各plf

29、as特征峰的反应区域值，体现了各plfa的含量；area/ height ratio（ar/ht）表示反应区域/峰高度比值；rfact表示相关因子系数；the equivalent chain length (ecl)表示各磷脂脂肪酸的相对链长度；peak name指各磷脂脂肪酸特征峰名称；percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占总脂肪酸的百分数，comment1、comment2表注解1、2。特定的生物标记指示着特定的微生物，总plfa谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的。例如,表1中，tbsa 10me18:0脂肪酸为放线菌的特异性生物标记，其各参数分别为：特征峰滞留时间(rt

30、)值是14.920min，特征峰值response为8976，表示其相对生物量的大小；面积/峰值比（ar/ht）为0.073；因子相关系数（rfact）为0.879；该plfas相对链长度(ecl)为18.392；该plfas峰名（peak name）为tbsa 10me18:0，该特征plfas占总提取的plfas量的百分数（percent）为1.98，其相对链长度的偏离度为0.000。脂肪酸浓度通常应用标准品甲基十九烷脂肪酸(19:0)作为内标来进行定量测定1，可以将表示各特征plfas相对生物量的response值换算成各脂肪酸的具体含量，而且peak name磷脂脂肪酸各特征峰通过比对

31、可以定性地确定脂肪酸名称15。另有研究表明，不同的提取方法，出现的特征峰数量，即pflas种类可能不同。在本试验条件下，各供试土壤中所获得的plfas生物标记最多的处理有43个特征峰，即可能出现有43种不同的pflas可作为生物标记指示土壤微生物群落的多样性。表1. 烟草土壤样品z-7微生物群落磷脂脂肪酸信息表table2. phospholipids fatty acids information of microbial community in the flued-tobacco soil sample z-7滞留时间(特征峰值面积/峰值比因子相关系数相对链长度峰名百分数注解1注解2rt

32、responsear/htrfacteclpeak namepercentcomment1comment21.6986.298e+70.024-7.046solvent peak-< min rt4.63812620.031-11.730-4.89016540.0411.10211.99812:00.46ecl deviates -0.002reference 0.0005.1268680.040-12.197-5.1994560.036-12.260-5.2593050.029-12.311-5.3217140.031-12.363-5.41710360.0551.07912.4441

33、1:0 3oh0.28ecl deviates 0.0065.6195690.0311.07012.61613:0 iso0.15ecl deviates 0.002reference 0.0045.75034940.032-12.727-6.0737790.0661.05113.00013:00.21ecl deviates 0.000reference 0.0036.37723790.075-13.219-6.5099620.044-13.314-6.5749300.038-13.360-6.6907860.033-13.443-6.93515910.0351.02413.61914:0

34、iso0.41ecl deviates 0.000reference 0.0027.08571510.036-13.727-7.17826280.049-13.794-7.32425170.0531.01313.89914:1 w5c0.64ecl deviates -0.0027.46359180.0401.00913.99814:01.50ecl deviates -0.002reference 0.0007.73921570.059-14.174-7.90940010.071-14.283-8.02712220.035-14.359-8.16322900.0590.99214.44515

35、:1 iso g0.57ecl deviates 0.0058.2478380.0440.99014.499unknown 14.5020.21ecl deviates -0.0038.440176870.0410.98514.62215:0 iso4.37ecl deviates -0.001reference 0.0018.593165810.0480.98214.72015:0 anteiso4.09ecl deviates 0.007reference 0.0098.77642000.055-14.838-8.92916050.051-14.935-9.02839810.0410.97

36、214.99815:0-ecl deviates -0.0029.1217850.055-15.054-9.28927410.075-15.154-9.41714540.050-15.230-9.54510130.043-15.306-9.63011480.041-15.356-9.77929640.0650.95815.44516:1 iso g0.71ecl deviates 0.0039.95720520.0480.95515.55116:0 n alcohol0.49ecl deviates 0.00110.085137620.0450.95215.62616:0 iso3.29ecl

37、 deviates -0.001reference 0.00110.24793040.0410.94915.72316:0 anteiso2.22ecl deviates 0.00510.406176760.0470.94615.817sum in feature 34.20ecl deviates -0.00516:1 w7c/15 iso 2oh 10.560151220.0450.94415.90916:1 w5c3.58ecl deviates 0.00010.711739130.0440.94115.99916:017.46ecl deviates -0.001reference 0

38、.00010.95232210.0540.93716.13715:0 iso 3oh0.76ecl deviates 0.00311.236122560.058-16.300-11.467130830.0610.92916.43216:0 10 methyl3.05ecl deviates 0.00011.60837830.0770.92716.51315:0 3oh0.88ecl deviates 0.01011.81076100.0450.92316.62917:0 iso1.76ecl deviates -0.001reference 0.00011.971131700.0450.921

39、16.72117:0 anteiso3.04ecl deviates -0.002reference -0.00112.09623960.0560.91916.79217:1 w8c0.55ecl deviates 0.00012.26536500.0490.91616.88917:0 cyclo0.84ecl deviates 0.001reference 0.00312.45533720.0480.91416.99817:00.77ecl deviates -0.002reference 0.00012.52634520.0450.91217.03816:1 2oh0.79ecl devi

40、ates -0.01012.6605980.040-17.114-13.07514020.076-17.349-13.18434220.0530.90317.41017:0 10 methyl0.78ecl deviates 0.00113.33716850.056-17.496-13.48568390.0650.89917.58018:3 w6c (6,9,12)1.54ecl deviates 0.00313.737450480.0530.89517.722sum in feature 510.13ecl deviates 0.00218:2 w6,9c/18:0 ante13.82463

41、2220.0480.89417.77218:1 w9c14.19ecl deviates 0.00313.916162350.0460.89317.82318:1 w7c3.64ecl deviates 0.00014.05797800.058-17.903-14.226167380.0490.88817.99818:03.73ecl deviates -0.002reference -0.00114.434118410.109-18.117-> max ar/ht14.55338670.051-18.184-14.69610250.0460.88218.26517:0 2oh0.23e

42、cl deviates 0.01114.78841030.059-18.318-14.92089760.0730.87918.392tbsa 10me18:01.98ecl deviates 0.00015.21716780.059-18.561-15.48156790.051-18.711-15.6427850.0480.86918.803unknown 18.8140.17ecl deviates -0.01115.74525380.0450.86818.861sum in feature 70.55ecl deviates 0.00319:1 w6c/.846/19cy 15.81914

43、4020.0510.86718.90319:0 cyclo w8c3.13ecl deviates 0.001reference 0.00215.99410830.0500.86419.00219:00.23ecl deviates 0.002reference 0.00316.47455810.049-19.279-16.68743260.0490.85519.40220:4 w6,9,12,15c0.93ecl deviates 0.00716.81815140.047-19.478-16.96819110.048-19.564-17.04617970.062-19.609-17.2106

44、0540.048-19.704-17.3279290.0410.84619.77120:1 w9c0.20ecl deviates 0.00117.72360090.0490.84020.00020:01.27ecl deviates 0.000reference 0.00018.18433500.053-20.265-> max rt18.30178510.085-20.333-> max rt18.45259350.077-20.420-> max rt-17676-summed feature 34.2016:1 w7c/15 iso 2oh 15:0 iso 2oh/

45、16:1w7c-45048-summed feature 510.1318:2 w6,9c/18:0 ante18:0 ante/18:2 w6,9c-2538-summed feature 70.55un 18.846/19:1 w6c 19:1 w6c/.846/19cy -19:0 cyclo w10c/19w62.2 土壤微生物脂肪酸(plfas)生物标记数量和结构分析2.2.1土壤微生物脂肪酸(plfas)生物标记数量和结构总体变化（1）脂肪酸(plfas)生物标记种类数的变化烟株生长过程中，所采集的新鲜土壤样品中各plfas种类和plfas特征峰反应值大小如表2所示。从表2可知，各

46、处理的plfas种类随着生长时间而变化。不同生长期，烟草土壤中的微生物群落的plfas不同，但总的变化趋势一致，即；plfas的种类，随生育期的延长呈增加趋势。基础土样中plfas主要有14种（4个处理中有3个或以上存在的同一种plfas），第30天的土样中plfas达到了22种，60天后达到24种，烟叶成熟采收期则稳定地达到了34种；对于整个生育期而言，先后总共出现有43种的plfas。（2）特征脂肪酸(plfas)生物标记量的变化plfas不但在种类上随着生育期的延长而增加，其含量也呈递增的趋势。而对于plfas总含量和各特征plfas含量而言，因处理和时间而异。尤其是到了烟草叶生长后期，

47、14:0、i14:0、i15:1 g、16:0 10 me、a16:0、16:0 n alcohol、17:0、17:0 10 me、cy 17:0、17:18c、18:0、18:36c (6,9,12)、20:0、20:19c、20:46,9,12,15c和unknown 14.502等主要脂肪酸生物标记（plfas），不但在总脂肪酸中占主要地位，而且各处理plfas含量皆为最高，尽管在整个生长过程，各plfas含量的变化趋势有所不同。且生长后期，施用25%鸡粪处理的各plfas含量皆高于其它各处理。（3）特征脂肪酸(plfas)生物标记分布结构的变化从烟田不同处理组土壤中提取到的43种脂肪

48、酸生物标记，指示着不同类群的微生物，包括细菌、真菌、放线菌、原生生物等。不同脂肪酸生物标记在土壤的分布可分为4种类型：（1）生物标记数量小，在各处理中的分布不完全，如12:0指示着细菌，相对生物量在0到1654；（2）生物标记数量小，在各层次的分布为完全分布，如14:0指示着细菌，相对生物量在519到5918；（3）生物标记数量大，在各层次的分布不完全，如18:0 10me指示着放线菌，数量在1854-10315之间；（4）生物标记数量大，在各层次的分布为完全分布，如16:0指示着细菌，数量在31320-107126之间。2.2.2 土壤特征微生物类群磷脂脂肪酸（plfas）生物标记数量和结构

49、的变化（1）特征微生物脂肪酸（plfas）生物标记的结构变化从图2可知，对于表征土壤中各大类微生物的特征plfas标记而言，其大小顺序为：细菌的i16:01相对生物量（405408）大于表征真菌的18:1w9c16（360420）大于表征放线菌的 10me 18:0 1（29178）大于原生动物20:4w6,9,12,15c 6（25146）。图2 土壤微生物类群主要特征微脂肪酸plfas相对含量fig2. the relative content of main microbial communities varieties plfas in soil（2）不同施肥处理组脂肪酸（plfas）生物标记的结构变化从图3可知，对于不同处理对各大类土壤plfas相对生物量的影响不同，但趋势相似，表征土壤中各大类微生物的特征plfas i16:0、18:1w9c、10me 18:0和20:4w6,9,12,15c的相对生物量较为一致，皆为施用25%鸡粪大于25%饼肥大于不施肥的对照处理大于化肥处理。图3 施肥处理对主要plfas的影响fig3.the effects of fertilization treatments on the plfas content表2 烟草土壤微生物各plfas的反应区域值的动态变化table3. dynami