《蛋白质氨基酸》ppt课件

1、第第4 4章章 蛋白质、氨基酸含量的检测蛋白质、氨基酸含量的检测主要内容主要内容 第一节第一节 蛋白质的定量测定方法蛋白质的定量测定方法 第二节第二节 氨基氮含量的检测方法氨基氮含量的检测方法 第三节第三节 多种氨基酸的分别和测定多种氨基酸的分别和测定 第四节第四节 味精纯度的测定方法味精纯度的测定方法第一节第一节 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定一、蛋白质概略一、蛋白质概略 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由主要由C C、H H、O O、N N、S S五种元素组成。某些蛋白质五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的中还含有微量的 P P、CuCu

2、、FeFe、I I 等。等。 样品中蛋白质含量的测定，主要也是最常用样品中蛋白质含量的测定，主要也是最常用的用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质的用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量。粗蛋白的含量。详细测定方法详细测定方法一凯氏定氮法一凯氏定氮法最常用的，国内外运用普遍最常用的，国内外运用普遍 GB/T5009.52021 GB/T5009.52021 第一法。第一法。二分光光度法二分光光度法GB/T5009.52021 GB/T5009.52021 第二法第二法三电位滴定法三电位滴定法

3、四双缩脲反响四双缩脲反响五杜马斯熄灭法五杜马斯熄灭法(SN/T2115-2021)(SN/T2115-2021) 进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法杜马斯熄灭法杜马斯熄灭法 二二 、 蛋白质含量的定量测定蛋白质含量的定量测定 一些蛋白质的含氮量普通为一些蛋白质的含氮量普通为 15%-17.6%， 有的上下浮动有的上下浮动 可以测出总氮可以测出总氮 N一凯氏定氮法一凯氏定氮法 丹麦化学家丹麦化学家Johan Kieldahl Johan Kieldahl 克达尔克达尔(1849-1900)(1849-1900)研制了今天人所共知的分析研制了今天人所共

4、知的分析有机物中氮含量的凯氏法。于有机物中氮含量的凯氏法。于18831883年提出，年提出，现开展为常量、微量、自动定氮仪法及改现开展为常量、微量、自动定氮仪法及改良凯氏法。只引见前三种。良凯氏法。只引见前三种。16%N= N= N6.25 = 6.25 = 蛋白质含量蛋白质含量 丹麦分析化学家。丹麦分析化学家。18491849年生于亚格普里斯年生于亚格普里斯,1900,1900年年7 7月月1818日卒于齐斯维勒莱厄。日卒于齐斯维勒莱厄。 1873 1873年在哥本哈根大学毕业年在哥本哈根大学毕业后后, ,做过农业中学的教师。做过农业中学的教师。18751875年任卡尔斯堡研讨所化年任卡尔斯

5、堡研讨所化学部担任人学部担任人,1876,1876年任所长年任所长, ,在研讨所任务近在研讨所任务近2020年。他年。他是丹麦皇家科学院院士是丹麦皇家科学院院士,1884,1884年哥本哈根大学授予他声年哥本哈根大学授予他声誉博士学位。他主要研讨发酵化学。誉博士学位。他主要研讨发酵化学。18831883年发明测定年发明测定有机化合物中氮含量的方法有机化合物中氮含量的方法: :他将一定质量的试样与硫他将一定质量的试样与硫酸作用酸作用, ,使试样中的氮全部转变为硫酸铵使试样中的氮全部转变为硫酸铵, ,然后往硫酸然后往硫酸铵溶液中参与碱铵溶液中参与碱, ,再将生成的氨蒸馏到一定体积的规范再将生成的氨

6、蒸馏到一定体积的规范酸溶液中酸溶液中, ,再滴定过量的酸再滴定过量的酸, ,就能测出试样的含氮量。就能测出试样的含氮量。此法普遍用于化学和医学研讨及农业消费和药物工业。此法普遍用于化学和医学研讨及农业消费和药物工业。后人称此法为克氏定氮法。此法所用的仪器是一种梨后人称此法为克氏定氮法。此法所用的仪器是一种梨形长颈烧瓶形长颈烧瓶, ,容量通常约容量通常约300300毫升毫升, ,微量分析用的可以小微量分析用的可以小到到1010毫升毫升, ,后人称这种烧瓶为克氏烧瓶。后人称这种烧瓶为克氏烧瓶。 常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法1. 1. 原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋样品与浓硫酸和催

7、化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用用H3BO3H3BO3吸收后再以规范盐酸溶液滴定。根吸收后再以规范盐酸溶液滴定。根据规范酸耗费量可以计算出蛋白质的含量。据规范酸耗费量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的规范也可以用过量的规范H2SO4H2SO4或规范盐酸溶液或规范盐酸溶液吸收后再以规范吸收后再以规范NaOHNaOH溶液滴定过量的酸。溶液滴定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸馏

8、、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定、消化、消化 总反响式：总反响式：1 1加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340 340，参与硫酸钾之后可以提高，参与硫酸钾之后可以提高至至400400以上。也可参与硫酸钠，氯化钾等提以上。也可参与硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2CH22COOH+13H2SO4 NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸一定要用浓硫酸98%2 2 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化作为催化剂。还可以作消化终点指示剂做蒸馏时碱性指示

9、剂。还可以终点指示剂做蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞均有毒，价钱贵、硒粉、二加氧化汞、汞均有毒，价钱贵、硒粉、二氧化钛。氧化钛。3 3加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有如双氧水、次氯酸钾等加速有机机 物氧化速度。物氧化速度。右图为消化安右图为消化安装装、蒸馏、蒸馏 消化液消化液 + 400g/L氢氢氧化钠加氧化钠加热蒸馏，热蒸馏，放出氨气。放出氨气。、 吸收与滴定吸收与滴定1用用20g/L硼酸吸收，用盐酸规范溶液硼酸吸收，用盐酸规范溶液滴定，指示剂用混合指示剂甲基红滴定，指示剂用混合指示剂甲基红溴甲酚绿混合指示剂或亚甲基蓝溴甲酚绿混合指示剂或亚甲基蓝甲甲基红。基红。 指示剂指示

10、剂 紫红色紫红色 亮绿色亮绿色 暗暗灰色灰色 酸酸 碱碱 酸酸 2NH3 + 4H3BO3 =NH42B4O7 + 5H2ONH42B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3或或2用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 规范溶液规范溶液吸收，再用吸收，再用 NaOH 规范溶液滴定过剩的规范溶液滴定过剩的酸液。酸液。吸收吸收 滴定滴定结果计算：结果计算：蛋白质蛋白质%= 100 留意：留意：F氮换算为蛋白质的系数，普通为氮换算为蛋白质的系数，普通为 6.25，玉米、高粱为，玉米、高粱为6.24，大豆及其制品为，大豆及其制品为5.71，大，大麦为麦为5.83。 阐

11、明：阐明： 整个消化过程要在通风橱进展。整个消化过程要在通风橱进展。消化时不要用强火，应坚持和缓沸腾，以免粘贴在消化时不要用强火，应坚持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而呵斥氮损失。消化不完全而呵斥氮损失。 消化时，作空白实验。消化时，作空白实验。FmcVV014.0)(0 消化时应留意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应留意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。化完全。当样品消化液不易廓清透明时，可将凯氏烧瓶当样品消化液不

12、易廓清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，参与冷却，参与3030过氧化氢过氧化氢 2-3 mL 2-3 mL 后再继续加后再继续加热消化。热消化。普通消化至呈透明后，继续消化普通消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可，分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延伸消化时间。有机物如脯氨酸等时，需适当延伸消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。多时，呈较深绿色。 蒸馏安装不能漏气。蒸馏安装不能漏气

13、。 蒸馏前假设加碱量缺乏，消化液呈蓝色不生成蒸馏前假设加碱量缺乏，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再添加氢氧化钠用量。氢氧化铜沉淀，此时需再添加氢氧化钠用量。 蒸馏终了后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏终了后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸1 1分钟后关掉热源否那么能够呵斥吸分钟后关掉热源否那么能够呵斥吸收液倒吸。收液倒吸。 硼酸吸收液的温度不能超越硼酸吸收液的温度不能超越4040。 混合指示剂在混合指示剂在pH5.2pH5.2时为紫红色，时为紫红色， pH5.4 pH5.4时为时为暗灰色，暗灰色， pH5.6 pH5.6时为亮绿色，时为亮绿色， 变色点为变色点为pH

14、5.4pH5.4，指示剂变色范围很窄，灵敏度高。指示剂变色范围很窄，灵敏度高。微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：参与硼酸量由参与硼酸量由50 ml 10 ml,50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,0.1 mol/L 0.01 mol/L ,常量法全量蒸馏，微量法少部分蒸馏。常量法全量蒸馏，微量法少部分蒸馏。微量法用微量滴定管滴定。微量法用微量滴定管滴定。3 3、蒸馏安装以下图、蒸馏安装以下图 。 问题：用微量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量问题：用微

15、量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量时，测定结果比实践值偏低，试分析其能够的缘由？时，测定结果比实践值偏低，试分析其能够的缘由？ 运用实例：运用实例： 1 1、酱油中全氮含量的测定、酱油中全氮含量的测定 2 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定 GB/T GB/T 21704-202121704-2021 3 3、麦芽中库尔巴哈值、麦芽中库尔巴哈值; ;蛋白质区分蛋白质区分 1 1库尔巴哈值：制麦过程中蛋白质的溶解度，库尔巴哈值：制麦过程中蛋白质的溶解度，用可溶性氮占总氮的比值表示。用可溶性氮占总氮的比值表示。 2 2啤酒中蛋白质区分啤酒中蛋白质区分自动凯氏定氮法自

16、动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围、原理及适用范围: : 同前同前 2 2、特点：、特点：1 1消化安装用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红消化安装用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。2 2快速：一次可同时消化快速：一次可同时消化8-248-24个样品。个样品。3 3自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示安装。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示安装。可计算总氮百分含量并记录，几分钟完成几分钟完成1 1个样。个样。 福斯2300北京福德泰和科技北京福德泰和科技产品称号：产品称号： 凯氏定氮仪凯氏定氮仪 二分光光度法乙酰丙酮

17、比色法二分光光度法乙酰丙酮比色法 1 1、原理、原理 1 1样品消化样品消化 硫酸铵。硫酸铵。 2 2在在pH4.8pH4.8的乙酸钠的乙酸钠- -乙酸缓冲溶液中，乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反响生成黄色的铵与乙酰丙酮和甲醛反响生成黄色的3,5-3,5-二乙二乙酰酰-2,6-2,6-二甲基二甲基-1,4-1,4-二氢化吡啶化合物。二氢化吡啶化合物。 3 3在波长在波长400nm400nm处测定吸光度，与规范处测定吸光度，与规范系列比较定量。系列比较定量。 4 4结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2 2、方法特点、方法特点 1 1操作简便操作简便 2 2

18、适宜大批量样品蛋白质的测定适宜大批量样品蛋白质的测定三电位滴定法三电位滴定法 1 1、原理、原理 1 1样品消化样品消化 硫酸铵。硫酸铵。 2 2中和样品至中和样品至pH8.2pH8.2。 3 34 NH4 + +6HCHO (CH2)6N4+2H+ 4 NH4 + +6HCHO (CH2)6N4+2H+ +6H2O +6H2O 4 42H+ +OH- H2O2H+ +OH- H2O 2 2、方法特点、方法特点四双缩脲法四双缩脲法 传统的凯氏定氮法运用范围广，传统的凯氏定氮法运用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。时间，有环境污染。 新开发

19、的：双缩脲法由农业部于新开发的：双缩脲法由农业部于2021.10.202021.10.20发布并实施发布并实施 适宜于乳与乳制品中蛋白质含适宜于乳与乳制品中蛋白质含量的测定。量的测定。 1.1.原理原理脲尿素脲尿素NH2CONH2 NH2CONH2 加热至加热至150160150160时，时，两分子缩合成双缩脲。两分子缩合成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反响叫双缩脲反响。缩二脲反响种反响叫双缩脲反响。缩二脲反响蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH CONH 与双缩脲构造与双缩脲构造类似。在同样条件下也有呈色反响，

20、在一定条件下，类似。在同样条件下也有呈色反响，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。来测其吸光度，确定含量。540nm540nmNH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH22.2.运用运用 NY/T NY/T 1678-20211678-2021五五 杜马斯熄灭法杜马斯熄灭法 1 1、原理、原理 待测样本在纯氧待测样本在纯氧99.99%99.99%环境中高温环境中高温熄灭，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成熄灭，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被复原剂复原成氮气。

21、最后，用氮的氧化物后被复原剂复原成氮气。最后，用TCDTCD检测器检测氮气含量，计算蛋白质含量。检测器检测氮气含量，计算蛋白质含量。 2 2、特点：杜马斯熄灭法不仅可以在、特点：杜马斯熄灭法不仅可以在4 46 6分钟分钟内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测定出凯氏法所不能测定的硝态氮。还能减少对定出凯氏法所不能测定的硝态氮。还能减少对环境的污染以及对人类安康的危害。环境的污染以及对人类安康的危害。 第二节第二节 氨基氮含量的检测方法氨基氮含量的检测方法一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法 1. 1.原理：氨基酸本身既有碱性原理：氨基酸本身既有碱性 NH2 N

22、H2，又有又有 酸性酸性 COOH COOH ，成中性内盐，成中性内盐，参与甲醛溶液后，与参与甲醛溶液后，与 NH2 NH2 结结合，碱性消逝，再用强碱来滴合，碱性消逝，再用强碱来滴定定 COOH COOH 基。基。 2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氨基氮量，特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氨基氮量，其发酵过程中氨基氮量减少情况等适于游离氨基其发酵过程中氨基氮量减少情况等适于游离氨基酸的测定酸的测定 。3 3、运用实例、运用实例 酿造酱油酿造酱油GB18186-2000 GB18186-2000 氨基氮含量的测定氨基氮含量的测定 1 1试剂试剂 a) a) 甲醛溶液：甲醛溶液：373

23、74040； b) 0.05mol/L b) 0.05mol/L氢氧化钠规范滴定溶液氢氧化钠规范滴定溶液 2 2分析步骤分析步骤 汲取汲取5.0mL5.0mL样品，置于样品，置于100mL100mL容量瓶中，加水至刻度，容量瓶中，加水至刻度，混匀后汲取混匀后汲取20.0mL20.0mL，置于，置于200mL200mL烧杯中，加水烧杯中，加水60mL60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠规范溶液水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠规范溶液c(NaOH)=0.05mol/Lc(NaOH)=0.05mol/L滴定至酸度计指示滴定至酸度计指示pHpH8.28.2记下耗费氢氧化钠规范滴定溶液记下耗费氢氧化钠规

24、范滴定溶液0.05mol/L0.05mol/L的毫升数，可计算总酸含量的毫升数，可计算总酸含量 。 参与参与10.0mL10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠规范滴甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠规范滴定溶液定溶液0.05mol/L0.05mol/L继续滴定至继续滴定至pHpH9.2, 9.2, 记下耗记下耗费氢氧化钠规范滴定溶液费氢氧化钠规范滴定溶液0.05mol/L0.05mol/L的毫升数。的毫升数。 同时取同时取80mL80mL水，先用氢氧化钠溶液水，先用氢氧化钠溶液0.05mol/L0.05mol/L调理调理pHpH为为8.28.2，再参与，再参与10.0mL10.0mL甲醛溶液，用氢

25、氧化甲醛溶液，用氢氧化钠规范滴定溶液钠规范滴定溶液0.05mol/L0.05mol/L滴定至滴定至pH=9.2pH=9.2，同，同时做试剂空白实验。时做试剂空白实验。 二、茚三酮比色法二、茚三酮比色法 1 1、 原理：茚三酮与样品中的原理：茚三酮与样品中的-氨基氮反氨基氮反响，得到复原茚三酮，再与氨和未复原的茚三响，得到复原茚三酮，再与氨和未复原的茚三酮反响，生成蓝紫色络合物，其颜色深浅与酮反响，生成蓝紫色络合物，其颜色深浅与-氨基氮含量成正比。在氨基氮含量成正比。在570nm570nm下，测定吸光下，测定吸光度，计算样品中的度，计算样品中的-氨基氮含量。氨基氮含量。 2 2、操作过程、操作过

26、程1 1取取7 7支试管并编号，于支试管并编号，于0 0号试管中参与蒸馏号试管中参与蒸馏水水2.00 mL2.00 mL，于，于1 1、2 2、3 3号试管中分别参与样液号试管中分别参与样液2.00 mL2.00 mL，4 4、5 5、6 6号试管中分别参与甘氨酸规号试管中分别参与甘氨酸规范运用液范运用液2.00 mL2.00 mL。2 27 7支试管中各参与发色剂支试管中各参与发色剂1.00 mL1.00 mL，混匀，混匀，盖塞，将试管放入沸水浴中，准确加热盖塞，将试管放入沸水浴中，准确加热16min16min，3 3在在2020水浴中冷却水浴中冷却20min20min。再各参与碘酸钾。再各

27、参与碘酸钾稀释溶液稀释溶液5.00 mL5.00 mL，充分摇匀。，充分摇匀。4 4用空白液管调理仪器零点，于用空白液管调理仪器零点，于570nm570nm波长下，波长下，丈量吸光度。丈量吸光度。 3 3、计算、计算 4 4、运用、运用 啤酒消费中：麦汁、麦芽中啤酒消费中：麦汁、麦芽中-氨氨基氮的测定基氮的测定 第三节第三节 多种氨基酸的分别和测定多种氨基酸的分别和测定 一、氨基酸自动分析仪法一、氨基酸自动分析仪法 原理：原理： 1 1、运用阳离子交换树脂聚苯乙、运用阳离子交换树脂聚苯乙烯经交联再磺化在色谱柱进展分别；烯经交联再磺化在色谱柱进展分别； 2 2、洗脱下来的氨基酸可用茚三酮、洗脱下来的