时间分辨乙肝应用-潭龙益

1、Time resolved FluoroimmunoassayTime resolved FluoroimmunoassayTRFIATRFIA第二军医大学实验诊断教研室第二军医大学实验诊断教研室长征医院实验诊断科长征医院实验诊断科全军临床免疫中心全军临床免疫中心谭龙益谭龙益 博士博士 qABO血型检测血型检测q细菌鉴定细菌鉴定q肥大氏反应肥大氏反应q琼脂糖扩散试验琼脂糖扩散试验q免疫电泳免疫电泳q放射免疫分析技术放射免疫分析技术 radioimmunoassayradioimmunoassay RIA RIA灵敏度高：达到灵敏度高：达到ng甚至甚至pg水平水平特异性强特异性强重复性高重复性高

2、标本用量少标本用量少极大地推动了临床和科研进步极大地推动了临床和科研进步标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。同位素高度灵敏免疫反应特异性同位素高度灵敏免疫反应特异性w125125I I的半衰期短而导致其试剂有效期短。的半衰期短而导致其试剂有效期短。w标记物标记物125125I I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。成浪费。w操作繁琐，出报告时间长。操作繁琐，出报告时间长。w无法保存备用。无法保存备用。w放射性（放射性（1

3、25125I I），对环境的污染及对身体的危害，），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）尚存几个放免试验室）酶免疫分析法酶免疫分析法enzyneenzyne immunoassay EIA immunoassay EIA 避免了对环境和人体危害。避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。试剂有效期较长。操作简单，不需要特殊设备，容易推广。操作简单，不需要特殊设备，容易推广。 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。曾经一度被认为是取代放免的检测手段。酶的高效催化免疫反应特异性酶的高效催化免疫反应特异性

4、w灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。假阳性。w因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。响，导致稳定性不好。化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法（CLIACLIA） chemiluminescenchemiluminescen immunoassay immunoassay单个样本检测速度快，适合做急诊。单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。灵敏度较高。自动化程度高。自动化程度高。光反应的高度灵敏免疫反应特异光反应的高度灵敏免疫反应特异 发光过程短，样品不能重复检测。发光过程短，样品不能重复检

5、测。 本底较高，易受环境物质干扰。本底较高，易受环境物质干扰。 试剂稳定性较差，需多次定标。试剂稳定性较差，需多次定标。 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。方面能力不足。 非开放性试剂；试剂价格高。非开放性试剂；试剂价格高。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（ECLECL） electrochemiluminescenceelectrochemiluminescence8080年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。电化学免疫反应电化学免疫反应电化学发光底物电化学发光底物- - 三联吡啶钌三联吡啶钌

6、N N羟基琥珀酰胺羟基琥珀酰胺(NHS)(NHS)酯酯电极表面的电化学发光反应电极表面的电化学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。可以作急诊可以作急诊w非开放性试剂系统。非开放性试剂系统。w试剂价格过高。试剂价格过高。免疫荧光测定技术免疫荧光测定技术( (IFA)IFA)Immunofluorescence Immunofluorescence assayassay荧光物质免疫反应荧光物质免疫反应细胞免疫、微生物、自身免疫等细胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高敏感度不高 本底高本底高镧系元素标记技术免疫反应镧系元素标记技术免疫反应一、基本原理固相固

7、相Ab受检受检抗原抗原Eu标记标记抗体抗体ExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitation二、二、TRFIATRFIA的主要特点的主要特点（一）灵敏度高、特异性强（一）灵敏度高、特异性强酶联免疫酶联免疫（精度：（精度：1010-9 -9 mol/L mol/L ）放射免疫放射免疫（精度：（精度：1010-12-12mol/L mol/L ）化学发光化学发光（精度：（精度：1010-15-15mol/L mol/L ） 电化学发光电化学发光（精度：（精度：1010-17-17mol/L

8、 mol/L ）时间分辨荧光时间分辨荧光（精度：（精度：1010-18-18mol/L mol/L ）生物芯片生物芯片试剂试剂 DELFIA Immulite ACS-180AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/mCEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/LTSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/mlFSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/m 0.3-200mU/mlProg0.08-12

9、0nmol/L 无无 0.1-40ng/mlProlactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/mlq以上数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书以上数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书镧系元素：镧系元素：1515种种 EuEu、TbTb、 SmSm、 NdNd、 Dy Dy EuEu螯合物螯合物激发光激发光荧光荧光EuEu螯合物荧光的特点螯合物荧光的特点高强度高强度长寿命长寿命EuEu螯合物螯合物714000714000nsns1 Eu螯合物的荧光衰变时间很长，极大地降低螯合物的荧光衰变时间很长，极大地降低了检测背景。了检测背景。2008004006

10、00荧光强度荧光强度激发激发短寿命荧光短寿命荧光白蛋白白蛋白 4.1ns球蛋白球蛋白 3.0nsFITC 4.5ns测量时间测量时间新循环新循环1000次循环次循环/s2 stokes2 stokes位移大位移大, ,激发光谱与发射光谱无重叠激发光谱与发射光谱无重叠, ,很容易排除散射光对发射光谱的影响很容易排除散射光对发射光谱的影响. .stokesstokes位移位移: :最大激发波长至最大发射波长最大激发波长至最大发射波长 之间的距离之间的距离激发光激发光发射光发射光Eu螯合物荧光光谱螯合物荧光光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度273nm异硫氰酸荧光素发射光谱异硫氰

11、酸荧光素发射光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度发射光发射光激发光激发光50nmEu螯合物荧光光谱螯合物荧光光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度异硫氰酸荧光素发射光谱异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度3 3 激发光谱带较宽、可增加激发能，提高灵敏度激发光谱带较宽、可增加激发能，提高灵敏度4 4 发射光谱很窄，发射光谱很窄，50%50%的发射光谱宽度的发射光谱宽度10nm10nm，利用利用6156155 5范围的滤光片，只允许此波段内范围的滤光片，只允许此波段内发射光通过并被检测，排除其它波长的荧光，发射光通过并被检

12、测，排除其它波长的荧光，一方面降低了背景，另一方面使能量消耗减一方面降低了背景，另一方面使能量消耗减少，提高提高检测灵敏度。少，提高提高检测灵敏度。异硫氰酸荧光素发射光谱异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度Eu螯合物荧光光谱螯合物荧光光谱300600400500波长波长nm荧光强度荧光强度5 Eu5 Eu螯合物有相对高的比活性螯合物有相对高的比活性比活性：单位时间内，每个标记分子的可探比活性：单位时间内，每个标记分子的可探 测事件的数目测事件的数目 荧光物质相对比活性很高荧光物质相对比活性很高 原因：在测定原因：在测定时，荧光物质可反复被激活。时，荧光物质

13、可反复被激活。基态基态激发态激发态激发光激发光跃迁跃迁发射荧光发射荧光常用标记物的相对比活性常用标记物的相对比活性125125I I标记物标记物 1 1个个可探测事件可探测事件/s/7.5/s/7.5* *10106 6分子分子化学发光标记物化学发光标记物 1 1个个可探测事件可探测事件/s/s/标记分子标记分子荧光标记物荧光标记物 很多个很多个可探测事件可探测事件/s/s/标记分子标记分子（二）线性范围宽（二）线性范围宽标准曲线稳定，试剂保质期长标准曲线稳定，试剂保质期长0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFS

14、HN=6时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标线定标（三）重复性好（三）重复性好 同一标本连续同一标本连续2020次检测，次检测，CVCV值值22。 同一批（同一批（1010个）标本连续个）标本连续3 3天检测，其天检测，其CVCV值值=2.9%=2.9%。 检测后反应板连续检测后反应板连续3 3天重复阅读，天重复阅读，CV 1CV 1TRFIATRFIA检测检测HBsAgHBsAg的重复性的重复性6003007002001000- 50100时间延迟（时间延迟（微秒

15、）微秒）强度强度发射光波长（纳米）发射光波长（纳米）500利用不同波长和不同时间检测，利用不同波长和不同时间检测， 在同一孔中可测量多个镧系元素的量在同一孔中可测量多个镧系元素的量（四）同一标本孔同时检测多个项目（四）同一标本孔同时检测多个项目技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离发射荧光与激发荧光分离零本底、高特异性零本底、高特异性解离解离- -增强增强荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围更宽线性范围更宽重复性更好重复性更好原子标记原子标记 标记位点多，

16、可达标记位点多，可达2020个个 对标记物结构及活性影响小对标记物结构及活性影响小 无衰变无衰变 受环境影响小受环境影响小高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标同一批次只需两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个同一试剂盒可同时测多个项目项目三、应用三、应用w内分泌科检查内分泌科检查n甲状腺系列甲状腺系列： TSHTSH，Ultra TSHUltra TSH，T3T3，T4T4，n FT3FT3，FT4FT4，TBGTBG，TGTGn糖尿病系列糖尿病系列： Insul

17、inInsulin， C-PeptieC-Peptien生长激素类生长激素类： hGHhGHn其他其他： CortisolCortisolw妇产科检查妇产科检查nFSHFSH，LHLH，HCGHCG，ProlactinE2ProlactinE2，E3E3，TestoTesto，ProgProg，SHBGSHBGw肿瘤科检查肿瘤科检查AFP CEA PSA hTGAFP CEA PSA hTG，-2 Micro -2 Micro NSE PAP NSE PAP PSAPSA（Free/TotalFree/Total） PSA EQMPSA EQMCA-50 CA-125 CA-199 CA-50

18、 CA-125 CA-199 CA-153CA-153* * CA-724 CA-724* * CY-211 CY-211* *w遗传科检查遗传科检查n产前筛查产前筛查： hAFPhAFP/ / HCG HCG ，PAPPAPAPPAn新生儿筛查新生儿筛查：Neo-TSHNeo-TSH，Neo-T4Neo-T4，Neo-IRTNeo-IRT， n Neo-17a-OH ProgNeo-17a-OH Prog，PKUPKUn核酸探针及基因杂交检测，多标记定量核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCRPCR检测。检测。w肝炎系列肝炎系列n甲肝，乙肝，丙肝甲肝，乙肝，丙肝w血液科检测血液科检测n贫血检

19、查贫血检查：FerritinFerritin，VitVit B12 B12，Folic acidFolic acidn白血病：白血病：免疫细胞分型等免疫细胞分型等w细胞学检查细胞学检查n细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目化学分析等多种检测项目n酶类检测及细胞受体检测（包括酶类检测及细胞受体检测（包括MHCMHC，HLAHLA等等多种检测）多种检测）w科研工具科研工具n单标记检测，双标记检测，三标记检测，四单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测标记检测时间分辨荧光免疫测定技术时间分辨荧光免疫测定技术在病毒性肝炎诊断和疗效监测

20、中的应用在病毒性肝炎诊断和疗效监测中的应用病毒性肝炎的种类病毒性肝炎的种类Hepatitis A Virus Hepatitis B VirusHepatitis C VirusHepatitis D VirusHepatitis E VirusHepatitis G VirusTTVHepatitis Gvirus (HGV) Science. 1996 Jan 26;271(5248):505-8. An RNA virus, hepatitis G virus (HGV), from the plasma of a patient with chronic hepatitis. enti

21、re genome (9392 nucleotides)encoding a polyprotein of 2873 amino acids. qHGV was associated with acute and chronic hepatitis. The virus is transfusion-transmissible. It has a global distribution present within the volunteer blood donor population.19962003各年度HGV相关论文数量统计05010015020012345678年度篇数9699 00

22、01 02039798 HGVand GBV-C were two isolates of the same virus. The HGV/GBV-C genome sequence and organization are closely r e l a t e d t o h e p a t i t i s C v i r u s .qinfection is common and frequently persists in humans, qinfection has not been found to be associated with any known disease stat

23、e. (acute or chronic hepatitis) qgrow in lymphocytes , not in hepatocytes, Recent studies suggest : GBV-C infection in HIV-positive people is associated with prolonged survival. coinfection of human lymphocytes with GBV-C and HIV lead to decreased HIV replication. HGV may provide novel approaches fo

24、r treating HIV and AIDS.TT virus (TTV) found in 1997 from a hepatitis patient without virus markers. However, the real impact of TTV on liver diseases remains uncertain to date. Due to the lack of suitable cell systems to support the growth of TTV, the biology of TTV is still obscure.HBsAgHBcAgHBV D

25、NAPolymerase一、一、HBV的主要生物学性状的主要生物学性状HBV感染感染 病毒在体内大量复制病毒在体内大量复制 免疫反应免疫反应 病毒核酸进入血液病毒核酸进入血液 释放病毒蛋白释放病毒蛋白(Ag) 分子生物学方法分子生物学方法 刺激机体产生抗体刺激机体产生抗体 核酸定性或定量核酸定性或定量 血清学方法血清学方法 病毒抗原或抗体病毒抗原或抗体 临床诊断和疗效观察临床诊断和疗效观察二、二、HBV感染诊断的主要实验室指标感染诊断的主要实验室指标血清免疫学检测的临床意义血清免疫学检测的临床意义1 HBV感染诊断的主要指标感染诊断的主要指标2 判断机体对判断机体对HBV的免疫状况主要指标的免

26、疫状况主要指标3 判断病程的主要指标判断病程的主要指标 Acute Hepatitis B DNA4-12周周1-2周周2周周3月月36月月潜伏潜伏期期急性急性早期早期潜伏潜伏后期后期急急性性期期康复期痊愈痊愈标标志志物物相相对对浓浓度度有传染性有传染性可能有传可能有传染性染性有 免有 免疫 力疫 力血清血清学转学转换期换期 HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBc IgMAnti-HBeAnti-HBsChronic HBV Infection潜伏期潜伏期(4-12周周)急性感染急性感染(6个月个月)慢性感染慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBc IgMHBeAgAn

27、ti-HBeDNA3 HBV3 HBV血清学标志物与血清学标志物与HBV DNAHBV DNA的关系的关系血清学标志物：血清学标志物： 反映机体对病毒的免疫状况，病程，反映机体对病毒的免疫状况，病程， 判断病情。判断病情。 不能完全反映病毒在体内复制状况。不能完全反映病毒在体内复制状况。HBVDNAHBVDNA 反映病毒在体内复制水平，观察药物疗效，反映病毒在体内复制水平，观察药物疗效， 部分部分“ “ 小三阳小三阳”及低水平病毒复制时出现阴性。及低水平病毒复制时出现阴性。 不能反映机体的免疫状况和病情不能反映机体的免疫状况和病情三、三、 时间分辨荧光检测时间分辨荧光检测 HBsAgHBsAg

28、与其它方法的比较与其它方法的比较TRFIATRFIA与与Elecsys Elecsys Systems 2010Systems 2010检测检测 HBsAgHBsAg定性结果比较定性结果比较TRFIATRFIA阳性阳性阴性阴性合计合计阳性阳性60060阴性阴性04040总数总数6040100ElecsysElecsys Systems 2010 Systems 2010灵敏度灵敏度40（040）100100灵敏性灵敏性60（060）100100两者符合率两者符合率 100与与 EIA EIA 检测检测 HBsAgHBsAg定性结果比较定性结果比较TRFIATRFIAEIAEIA阳性阳性阴性阴性

29、合计合计阳性阳性59160阴性阴性04040总数总数5941100与与Elecsys Elecsys Systems 2010Systems 2010检测检测 HBsAgHBsAg定量结果比较定量结果比较ElecsysElecsys Systems 2010 Systems 2010 检测检测 HBsAgHBsAg（COICOI）与）与TRFIATRFIA检测检测HBsAgHBsAg（ngng/L/L）的相关性）的相关性0.9870.987TRFIATRFIA在乙肝在乙肝“两对半两对半”定量检测应用定量检测应用 一、一、 极大地提高了检测的灵敏度极大地提高了检测的灵敏度 TRFIA 检测Hbs

30、Ag灵敏度可达0.2ng/ml，而酶标（ELISA）检测HbsAg灵敏度是2ng/ml，也就是说只有血清中的HbsAg达到2ng/ml酶标才会呈阳性。1缩短急性乙肝缩短急性乙肝HBsAg 检测检测“窗口期窗口期” 2如病毒发生变异后，表达量较低，常规如病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而测不出抗原，而TRFIA定量具有极高定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出HbsAg和抗和抗-Hbs。 3 可发现低浓度可发现低浓度HbsAg携带者。携带者。 特别是一些群体如医护工作者、病人家属等，由于特别是一些群体如医护工作者、病人家属等，由

31、于长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝，长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，可能呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，可能呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。二、二、 动态观察疗效和病情监测。动态观察疗效和病情监测。 疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的变化的过程，变化的过程，TRFIA定量检测乙肝定量检测乙肝“两对半两对半”各项各项标志

32、物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据，指导治疗。作出合理的解释提供依据，指导治疗。1定量分析定量分析HbsAg和抗和抗-Hbs的浓度变化，可以预见的浓度变化，可以预见急性乙肝是否处于恢复期。急性乙肝是否处于恢复期。 如如HbsAg浓度降低，抗浓度降低，抗-Hbs的浓度逐渐升高，的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，可说明病情正往恢复期发展。反之，HbsAg浓度处浓度处于较高水平或上升趋势，而抗于较高水平或上升趋势，而抗-Hbs一

33、直处于较底水一直处于较底水平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。2定量分析定量分析HbeAg和抗和抗-Hbe的浓度变化，可以反的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。映病情变化和治疗效果。 明确检测明确检测HbeAg向抗向抗-Hbe转换的时期，即表转换的时期，即表现为现为HbeAg浓度下降和抗浓度下降和抗-Hbe浓度升高的过程。浓度升高的过程。 高浓度的高浓度的HbeAg还可间接提示病毒处于高复还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。制状态，具有较高的传染性。 高浓度的抗高浓度的抗-Hbe一方面提示病情的好转，而一方面提示病情的好转，而在某些时候（如肝功

34、能指标很差）可能与肝坏死、在某些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。肝硬化、肝癌有关。3抗抗-Hbc浓度的高低可以反映病毒感染的状浓度的高低可以反映病毒感染的状态。态。 乙肝急性感染常常呈现高浓度的抗乙肝急性感染常常呈现高浓度的抗-Hbc，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓持续高浓度。度。 低浓度的抗低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。一般为恢复期或既往感染。 4 有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈进行性变化。定，活动性往往呈进行性变化。q三、三、 血清血清HBV-DNA荧光定量荧光定量PCR测定可以直接测定可以直接反映病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不反映病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。病毒状态。HBV-DNA阴性并不完全代表体内阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结已被清除，结合合“两对半两对半”各项指标