地贫筛查诊断和治疗

1、地中海贫血的筛查、实地中海贫血的筛查、实验诊断技术和治疗验诊断技术和治疗一、地中海贫血的筛查一、地中海贫血的筛查地贫筛查目的：地贫筛查目的： 诊断出所有携带地贫基因者，重型和中间型地贫易诊断，因此最主要的是查出不被重视的轻型地贫和静止型地贫基因携带者。 正常人群地贫筛查步骤：正常人群地贫筛查步骤：首先是血细胞分析首先是血细胞分析 除了静止型 地贫基因携带者（ 地贫 2 ）外， MCV，MCH基本上都低于正常。国际地贫协会认为最广泛使用的地贫截断值： MCV 79fl MCH 3.5%高效液相法色谱法HbA2 4% 地贫与其它血红蛋白病：HbH病可见H区带，血红蛋白病可见相应异常区带。 地贫地贫

2、基因型与基因型与HbA2绝大多数地贫基因突变型的基因携带者HbA2均增高，我国主要的几种突变型（41-42，IVS-654 ，17，71-71）均为的0， HbA2均增高。 地贫1： MCV79fl，MCH 27pg ，HbA2偏低。但 地贫2多无任何提示。 新生儿脐血检测HbBarts可诊断地贫，这是地贫筛查最经济而又简便的方法，在最基础的卫生院都能做到。有疑问可进行基因分析，可检测国内常见的 17 种地贫基因突变，常见的3种地贫基因缺失和常见的4种地贫基因突变。二、地中海贫血诊断实验技术二、地中海贫血诊断实验技术1.红细胞脆性试验（一管法）试剂： 0.32%NaCL缓冲液（以1%NaCL缓

3、 冲液32ml于100ml容器中，加入重蒸馏水至刻度。方法：取0.32%NaCL缓冲液2.5ml于小试管中，吸取全血10ul加入试管中，用吸管吸取溶液来回洗涤3次，再颠倒混匀，5分钟后观察结果。2. 2. 微量血红蛋白电泳微量血红蛋白电泳设备：电泳仪，电泳槽设备：电泳仪，电泳槽试剂：浸醋纤膜用试剂：浸醋纤膜用TrisTris缓冲液，电泳槽用硼酸缓缓冲液，电泳槽用硼酸缓冲液，丽春红染液冲液，丽春红染液溶血液制备：常用四氯化碳溶血法：去血浆溶血液制备：常用四氯化碳溶血法：去血浆生生理盐水洗杂质理盐水洗杂质蒸馏水溶血蒸馏水溶血四氯化碳溶解提四氯化碳溶解提取脂溶性物质取脂溶性物质离心得离心得HbHb液

4、。液。电泳：取膜条，加溶血液于阴极端，然后电泳电泳：取膜条，加溶血液于阴极端，然后电泳20-3020-30分钟。分钟。染色：取出膜条，染色：取出膜条，丽春红染液，染数分钟，然后丽春红染液，染数分钟，然后用用3%3%醋酸溶液洗干净，可观察结果。醋酸溶液洗干净，可观察结果。3.血红蛋白血红蛋白A2测定测定 不连续电泳将不连续电泳将HbA2分离后，分别剪出分离后，分别剪出膜条中的膜条中的HbA和和HbA2区带，分别放入试管区带，分别放入试管中，中， HbA加蒸馏水加蒸馏水20ml， HbA2加加4ml，浸泡浸泡30分钟，不定时摇动，使分钟，不定时摇动，使Hb完全冼脱完全冼脱下来后混匀，用下来后混匀，

5、用721分光光度计以波长分光光度计以波长413nm蒸馏水校正零点，读取光密度蒸馏水校正零点，读取光密度OD值值并计算出结果。并计算出结果。4.抗碱血红蛋白测定抗碱血红蛋白测定设备：设备：721分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗，滤纸。漏斗，滤纸。试剂：试剂：1/12mol/LKOH或或NaOH溶液，酸性半饱溶液，酸性半饱和硫酸铵溶液。和硫酸铵溶液。方法：取两支试管，测定管加入溶血液方法：取两支试管，测定管加入溶血液0.1ml，对照管加入对照管加入0.02ml，于测定管中加入，于测定管中加入KOH1.6ml，摇匀，摇匀，1分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液分钟时

6、立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转，倒转6次，放次，放10分钟，滤取溶液检测，用分钟，滤取溶液检测，用波长波长 540nm 蒸馏水校正零点，分别读取测定管蒸馏水校正零点，分别读取测定管和对照管光密度和对照管光密度OD值，计算出结果。值，计算出结果。5.全自动电泳仪用于Hb电泳及HbA2和HbF测定目前国内使用的主要有 美国生产的Helena 电泳仪、扫描仪和分析系统。 法国生产的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。 国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。6.高效液相色谱仪用于地贫和血红蛋白病的检测国际地贫协会和美国化学学会推荐使用，直接测出HbA2和HbF值，6分钟左右出一个结果，变

7、异系数小，准确可信，操作方便，结果判断简单，既可单个做也可成批大量做，一次可放100个样品。已知血红蛋白病大多可有特别波型，易诊断。7.血细胞分析 平均细胞体积（MCV）-79平均红细胞血红蛋白浓度（MCH）-27pg8.基因分析基因分析 缺失型缺失型地贫地贫 提取提取DNADNAPCRPCR扩增扩增PCRPCR产物电泳分离非缺型产物电泳分离非缺型地贫地贫 地贫和非地贫和非缺失型缺失型地贫地贫 提取提取DNADNAPCRPCR扩增扩增杂交杂交洗膜洗膜显色显色结果分析：结果分析： HbA2高于正常（高于正常（1岁以），岁以），MCV，MCH低于正常为低于正常为地贫，地贫，HbHb正常为携带正常为

8、携带者，低于正常为轻型。者，低于正常为轻型。 HbA2不高，不高， MCV，MCH低于正低于正常，有常，有H带为中间型带为中间型地贫（地贫（HbHHbH病），病），不贫血或轻度贫血应高度怀疑不贫血或轻度贫血应高度怀疑地贫地贫1 1（特别是（特别是HbA2较低者），应建议进行基较低者），应建议进行基因分析明确诊断。因分析明确诊断。 三、地中海贫血的治疗三、地中海贫血的治疗 1.重型地贫患者的预期寿命 不输血的患儿期望寿命5岁，患儿常会出现包括不会走路，发生病理性骨折和面部畸形等严重症状，主要致死原因是贫血，肝功能损害，败血症和心衰。 不规则输血患儿期望寿命13-19岁，但生活质量极差，多死于长期

9、贫血导致的心衰、败血症和肝功能损害。 规则高量输血但不用除铁剂期望寿命20岁以上。生活质量明显好于不规则输血，主要死因不再是贫血而是铁负荷过量所致的肝硬化、心衰和内分泌功能失调。 规则高量输血和使用除铁剂可长期存活。 2. 重型地贫患者每月所花费用 按体重20kg计算该患者每月： 输红细胞2单位（240ml）约540元 注射除铁剂得斯芬30支约2100元 合计2640元左右 3 重型地贫推荐的输血方案 维持血红蛋白在100g/L以上 方法：短期内连续多次输血使血红蛋白升至140g/L，然后每月输血一次，输血量为每公斤体重12ml红细胞（包括滤除白细胞红细胞、洗涤红细胞和浓缩红细胞）。 重型地贫

10、儿童，一般每月血红蛋白下降40g/L，而提高10g/L血红蛋白则每月每公斤体重需红细胞3ml，40g/L血红蛋白为12ml。每1单位红细胞有120ml，相当于200ml全血中红细胞。 4.重型地贫的除铁治疗 4.1铁负荷过重导致多器官功能障碍 肝脏：肝纤维化、肝硬化 心脏：心包炎、心率失常、传导阻滞、心衰 垂体：生长发育及性成熟迟缓 胰腺：糖尿病 甲状腺：甲状腺功能低下 甲状旁腺：甲状旁腺功能低下铁储积病4.2骨髓移植重型地贫患者分级及无病生存率危险因素：没有规则应用除铁剂肝大肝纤维化一级：3个危险因素都没有，移植后无病生存率91%二级：有1-2个危险因素，移植后无病生存率77%三级：有3个危

11、险因素，移植后无病生存率53%（重型地贫患者输血和除铁治疗的要求就是不出现上述3个危险因素） 影响地贫造血干细胞移植主要因素：患者除铁或输血不足或用法不当，使患者脏器功能欠佳；输血量过多，排异反应严重；医务人员经验不足。 4.3 除铁剂的治疗指征和剂量剂量 输血10-20次以上，或血清铁蛋白超过1000ng/ml时, 应该开始除铁治疗（但事实上肝组织铁含量与血清铁蛋白含量不相符，前者更准确）。1ml红细胞内含1.16mg铁，每年输1212=144ml/kg红细胞，则每年体内增加167mg/kg铁。 铁蛋白 得斯芬 2000ng/ml 25mg/kg/d； 2000-3000ng/ml 35mg

12、/kg/d； 3000ng/ml 55mg/kg/d。 缓慢皮下注射或静脉注射，时间8h。每周5-7天。 当患者的血清铁蛋白300ng/ml时停止治疗。得斯芬的应用得斯芬的应用 足量并均匀间隔使用除铁剂是最理想的。 当血清铁蛋白5000ng/L时，过量铁将对患者脏器造成致命的损害。应用微量注射泵皮下注射除铁剂擦止痛膏注射部位消毒配置药液皮下注射固定微量泵 5.成份输血中红细胞种类的选择与评价 地贫患者只需要血中的红细胞，红细胞种类主要有滤除白细胞红细胞、洗涤红细胞和浓缩红细胞。 5.1 滤除白细胞红细胞：为红细胞悬液经去白细胞滤器过滤后所得的红细胞。经过滤可将血液中的白细胞、血小板及血清的附属

13、物除去。因此可明显降低与白细胞相关的不良反应和输血相关疾病如非溶血性发热性输血反应，输血相关性移植物抗宿主病，免疫功能下降，细菌性输血反应和亲白细胞病毒如人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒和人细胞白血病淋巴瘤病毒的传染，还有提高机体细胞免疫功能，改善机体免疫状态的作用。地贫患儿需终身输血，应首选滤除白细胞红细胞，特别是预期要做骨髓移植的患儿。 5.2 洗涤红细胞：在严格的无菌条件下，用生理盐水反复离心洗涤红细胞悬液3-6次，尽可能多地移出血液内的白细胞和残余血浆，最后用生理盐水稀释而成，洗涤红细胞去除了99%的血浆蛋白和85%以上的白细胞和血小板，输血反应明显减少。 5.3 浓缩红细胞：浓缩红细胞是全血经离心或自然沉降后，去除大部分血浆而成。浓缩红细胞特点：容量约为全血的一半，可减少人体负荷。因其减少了血浆中的钠、钾、氯和乳酸、枸橼酸钠的含量，也就减少了由血浆引起的发热、过敏反应。 5 5（7 7）岁以上可进行手）岁以上可进行手术术术后术后HbHb可提高可提高20-40g/L20-40g/L中间型效果好于重型中间型效果好于重型HbHHbH病好于病好于地贫地贫应有