毕业论文(王瑞君)

1、诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者签名： 签名日期： 年 月 日聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）材料的血液相关安全性评价 摘 要 两亲嵌段共聚物聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）由于其良好的水溶性和生物降解性，已经在生物医学领域引起了巨大的研究兴趣。然而，共聚物mPEG-PCL的血液安全性尚未被详细研究。在任何情况下，引入体内的mPEG-

2、PCL共聚物都将不可避免地接触血液组织，并与血液组织相互作用。因此，对mPEG-PCL与血液主要成分相互作用的研究至关重要。在本次试验中，我们研究了两种mPEG-PCL共聚物的对凝血的功能的影响，对人类红血细胞（红细胞）的形态和裂解的影响，以及对血浆蛋白的纤维蛋白原结构和构象的影响。结果表明，mPEG-PCL共聚物在较高浓度下可以损坏血液凝固功能。而该共聚物对红细胞的形态和裂解的影响并不大。此外，该共聚物只影响纤维蛋白原的微环境，但不影响其构象。这一发现为分子设计和mPEG-PCL共聚物的生物医学应用提供了重要信息。关键词 血液相容性 ；凝血 ；聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL） Bloo

3、d safety evaluation of polyethylene glycol-polycaprolactone (mPEG-PCL) material Abstract: Amphiphilic block copolymer methoxy polyethyleneglycol-polycaprolactone (mPEG-PCL) has attracted enormous interests in the biomedical field, due to its water-solubility and biodegradability. However, the blood

4、safety of mPEG-PCL copolymers has not been investigated in detail. In any case, mPEG-PCL copolymers introduced in vivo would inevitably contact and interact with blood tissue. Therefore, it is critical to investigate the interaction of mPEG-PCL with key blood components. In this study, we studied th

5、e effects of two mPEG-PCL copolymers on blood coagulation function, the morphology and lysis of human red blood cells (RBCs), the structure and conformation of plasma protein fibrinogen. The results show that the mPEG-PCL copolymers at higher concentrations impaired blood clotting function. The copo

6、lymers had little impact on the morphology and lysis of RBCs. The copolymers affected the microenvironment but not conformation of fibrinogen. The findings provide important information for molecular design and the biomedical applications of the mPEG-PCL copolymers. Keywords：hemocompatibility; coagu

7、lation; mPEG-PCL 目 录1 绪论11.1 文献综述11.2 研究框架61.3 术语说明82 实验部分92.1 材料与仪器92.2 活化部分凝血酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）测试92.3 血栓弹力图测试分析（TEG）102.4 mPEG-PCL对红细胞形态的影响102.5 红细胞的溶血实验102.6 荧光发射光谱112.7 圆二色谱113 结果与讨论123.1 mPEG-PCL对凝血功能的影响123.1.1 活化部分凝血酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）测试123.1.2 血栓弹力图（TEG）133.2 MPEG-PCL和红细胞之间的相互作用163.2.1 红细胞

8、形貌观察163.2.2 红细胞体外溶血实验173.3 mPEG-PCL和纤维蛋白原的相互作用183.3.1 荧光光谱183.3.2 圆二色谱19结论20致谢21参考文献22 1 绪论近年来，有生物相容性和生物可降解性的两亲性共聚物，自组装形成的纳米粒子（胶束），在药物输送系统得到了广泛的关注。这类新型的生物材料的在种类和数量上的不断增长，但由于生物高分子会通过各种途径进入人体，并且接触血液，进而有可能会影响血液的正常功能，所以能够进入临到床使用阶段的材料很少。为了生物材料的安全使用，材料的血液相关安全性评价便成为生物材料研究中的首要问题。在通常情况下，医用生物材料与血液相互作用，使各自的功能和

9、性质受到影响，具有优良的血液相容性的材料对血液或血液成分的功能和性质影响在适当范围内，主要表现在：（1）粘附血小板较少，不激活血小板，不发生血栓。（2）不激活凝血系统，促进凝血时间短。（3）无溶血作用。（4）不对其他血液成分产生不利的影响。聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）是近年来发展起来的一种新型智能材料，具有优越的可生物降解性、良好的生物相容性和力学性能，其潜在的应用价值已吸引了国内外众多的研究者，现将一些相关的文献综述如下。1.1 文献综述1.1.1 血液安全性评价研究 生物材料在临床应用前，必须考虑其血液安全性。医用生物材料与血液间接或直接接触，将对血液中血小板、红细胞、白细胞及血

10、浆蛋白等成分发生作用，相互作用的结果会导致血栓形成、溶血、补体系统激活及血液中有形成分改变等1。血液安全评价即涉及材料的血液相容性，目前生物相容性评价方法已经很成熟，对各种生物材料进行的生物相容性评价实验很多，也有许多相关文献进行报道。 张明华，郑海燕2综述了抗凝血材料的血液相容性的特点，指出生物材料的血液相容性是指生物材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力和生物材料对血液的溶血现象、血小板功能降低、白细胞暂时性减少、功能下降以及补体激活等血液生理功能的影响。通过文献总结出聚酯类、钛类以及一些其他抗凝血生物材料在与血液接触后，减少血小板和纤维蛋白原的吸附，从而延长凝血时间，抑制血栓的形成。 张安

11、兄等人3的研究总结出通过对材料进行表面改性来提高材料的血液相容性的途径，包括：利用各种物理及化学的方法对材料的表面进行处理；对材料表面进行修饰,形成伪内膜；引入生物活性物质，通过抑制血栓形成的生理活性物质和溶解血栓的纤溶性活化酶固定在材料表面。 胡国栋4在对聚氨酯的血液相容性进行评价时，发现当材料表面吸附的是纤维蛋白原时,就会与血小板形成复合体而黏附在材料表面，加速凝血过程,形成血栓。因此，评价指标主要是研究蛋白的吸附作用，以及血小板的形态变化和黏附量。在测量蛋白吸附时，普遍应用放射性免疫技术，一般使用放射性125I来检测蛋白质吸附量。在评价血小板的形态变化、粘附数量及激活的情况，用到光学显微

12、镜和扫描电镜形态观察法。观察高分子材料与血小板的作用，以及材料表面结构与血小板的关系、血小板的黏附机理和设计抗血栓材料和免疫学等方面，可应用微球柱法。程青,王国斌5在对生物材料血液相容性评价研究进展的综述中，总结出材料血液安全评价方法基本上有三大类,即体外法(Invitro),半体内法(Exvivo)和体内法(In Vivo)。评价基于细胞分子水平，其内容包括血小板，血浆蛋白，内皮细胞，白细胞，细胞因子，粘附因子，组织因子。目前，广泛应用的与血液直接接触或间接接触的生物医用材料已达数百种之多，在临床使用中的安全性问题越来越受到重视。国际标准化组织（ISO）在1992年正式颁布的国际标准ISO1

13、0993-1、ISO10993-4标准中详细地规定了不同用途的医疗器械的血液相容性评价选择试验内容和方法。1997年底，我国也颁布了医疗器械生物学评价系列标准GB /T16886-ISO10993国家标准，明确规定了医用材料和医疗器械的血液相容性评价试验，保证与血液接触的医疗器械在临床使用中的安全性。1.1.2 mPEG-PCL的制备及其性能研究 作为生物材料，首先必须对聚乙二醇-聚己内（mPEG-PCL）进行血液安全的相关评价，方可作进一步的研究和应用。而目前对mPEG-PCL的血液安全性研究的报道较少，更多是关于mPEG-PCL的制备或mPEG-PCL特性的研究。王玮等人6利用封管聚合法，

14、在140下，用异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)作为催化剂聚合72h，之后将产物溶于CHCl3后滴加到无水乙醚中沉淀纯化，重复两次后真空干燥24h得MPEG-PCL两嵌段共聚物。 刘丽波等人7采用O/O乳化-溶剂挥发法，将共聚物溶解在丙酮/二氯甲烷混合溶剂中，然后滴加到液体石蜡中制备PEG-PCL微球。聚合物溶液首先分散在液体石蜡中形成液滴，随着溶剂挥发，逐渐形成聚合物微球。实验表明，聚合物的组成、浓度、热处理、混合溶剂的使用、司盘的用量以及分散相/连续相比例对微球的形成及其质量有重要影响。 此外，刘丽波8为了改良 PCL 的性质，以单甲氧基聚乙二醇（mPEG）引发己内酯(CL)单体开环聚合得到一

15、系列 mPEG-PCL 两亲嵌段共聚物。以 mPEG-PCL 嵌段共聚物为载体材料，5-Fu为模型药物，采用S/O/W乳化溶剂挥发法制备微球，采用mPEG含量低的共聚物为载体制得载药量为 7.93%，包封率为 39.65%的微球。其体外释药在 24 h 内接近 100%。对于高mPEG含量的嵌段共聚物则采用O/O乳化-溶剂挥发法制备微球。沈春花9采用单甲氧基PEG(MPEG)、PEG 和三臂、四臂 PEG 为大分子引发剂，引发-己内酯开环聚合，合成了系列线型和星型嵌段共聚物。线型共聚物和星型共聚物呈核壳结构，接近圆球形，粒径分别在20nm和30nm左右，线型嵌段共聚物的胶束结构比较松散，星型胶

16、束结构紧凑。实验发现，线型共聚物降解首先发生在 PCL 内核的 EO-CL酯键，随后 EO-CL 键和 CL-CL 键断裂，因此降解速率成两阶段。星型共聚物首先发生在 CL-CL 酯键，随后 EO-CL 键和 CL-CL 键断裂。1.1.3 mPEG-PCL的应用 由于两亲嵌段共聚物mPEG-PCL具有亲水链段和疏水链段，其胶束的疏水链段在水中的聚集力较强，使胶束内核较稳定，为疏水性药物提供了疏水微环境，其能够通过物理包埋、化学结合和静电作用等方式将药物分子吸附到其疏水内核中，形成载药纳米胶束。因此，mPEG-PCL在药物载体方面有不俗的应用潜力，这方面的研究也比较多。魏伟等人10利用实验合成

17、了嵌段聚合物mPEG-PCL，通过酸敏感的顺乌头键将抗癌药物阿霉素连接在PCL的末端制备了具有pH响应性的载药聚合物mPEG-PCL-DOX。实验通过NMR、红外光谱表征了聚合物的结构，通过DLS、TEM、荧光和紫外表征了载药聚合物胶束的性质，利用MTT实验和共聚焦显微镜的结果分别说明载药聚合物胶束具有潜在的细胞毒性，并且能够携带阿霉素进入细胞。刘学军等人11通过可控开环聚合合成了聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物（mPEG-PCL），通过控制加入环己内酯的量来控制聚合物分子量，研究其在水中的自组装行为，并以纳米胶束作为药物（叶酸）载体。实验表明，载药量随叶酸投药量的增大而增大，但同时包封率有所下降

18、；透射电镜下看到的嵌段共聚物在水中自组装成具有核/壳结构的球形胶束，且呈良好的分散状态，药物的载入基本没有改变胶束的结构及形貌，但使粒径增大，这与DLS结果一致；另外，TEM观察到的胶束平均粒径略小于DLS。此外，在相同释药条件下，载药量低的胶束释药速率高，而载药量高的胶束释药速率反而低。除了在药物控制释放、纳米载药制剂等领域的应用之外，王玮等人6在研究聚乙二醇单甲醚/聚己内酯(MPEG-PCL)两嵌段共聚物对高分子材料的生物相容改性过程中，将MPEG-PCL与PVC用溶液共混法制得复合物，对其玻璃化温度和力学性能进行测量。结果表明，MPEG-PCL共聚物加入PVC后起到明显的增塑作用，共混物

19、较纯PVC玻璃化温度降低、模量下降、断裂伸长率明显增加，添加20%的嵌段聚合物可以得到软质PVC产品,MPEG-PCL共聚物可用作PVC的增塑剂。 可见，具有良好生物相容性和可生物降解性，以及优良特性的mPEG-PCL在各方面都与巨大的研究潜力。1.2 研究框架1.2.1 研究目的生物医用材料在药物控释等方面具有广泛的应用。生物医用高分子通过各种途径进入人体，接触血液，进而影响血液的正常功能12。因此，生物医用高分子对血液组织的影响是值得深入研究，这样不仅能够提高生物医用高分子的功效，而且会影响血液循环系统甚至是整个有机体的安全。发展生物医用高分子现实、潜在的临床功能，安全评价至关重要。 聚己

20、内酯(PCL)是一种半结晶性聚合物，是脂肪族聚酯，以其优越的可生物降解性、良好的生物相容性和力学性能13，得到广泛的关注，并获得美国食品药品监督管理局FDA的批准14，可作为医用材料应用于人体。但由于PCL官能团单一，疏水性强，结晶性也强,降解时间较长，使得它在医学应用方面受到一定限制15。在实际应用中，PEG作为亲水基团修饰疏水性高分子，能赋予材料亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性、长循环等新的特性和功能。它能改善PCL结晶性强的缺点，也可以使降解时间缩短16。因此，经甲基化聚乙二醇(mPEG)改性的PCL，作为一种新型材料，可能在药物缓释方面有巨大的发展潜力。1.2.2 研究内容本研

21、究主要通过荧光光谱仪研究材料对纤维蛋白原结构的影响。通过扫描电子显微镜（SEM）和体外溶血实验，研究材料对红细胞膜形态和完整性的影响；通过自动凝血分析仪研究材料对活化部分凝血酶时间（APTT）、 凝血酶原时间（PT）的影响；通过血栓弹力图测试分析（TEG）研究材料对凝血过程的影响；以及材料对纤维蛋白原，血小板的研究。由上述实验过程判断材料与血液的作用，为聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）的生物医用提供重要依据，有助于指导相关材料的设计和合成。 本研究需重点解决的问题是，对实验数据进行整理分析，画出相关图表，观察细胞变化。在此基础之上，做出聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）的血液安全性判

22、断。 本研究预计通过各项实验数据分析出聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）对纤维蛋白原结构的影响及凝血体系的影响，进而预测其相关血液安全性。1.2.3 创新之处 本课题的研究对象，采用了两种有不同亲疏水链长比例的mPEG-PCL，分别是mPEG2k-PCL2k 和mPEG5k-PCL2k，切入角度主要是考察不同亲疏水比例的两亲性嵌段共聚物对血液主要成分以及细胞的作用有何差别，特别是研究材料亲疏水比例的差别对于血液凝血功能影响的区别，从而对人们设计此类两亲性药物载体起到一定的参考和借鉴作用。1.3 术语说明两亲性嵌段共聚物同一分子中具有亲水链段和疏水链段的聚合物，其能够在水中自组装形成内核疏水

23、!外壳亲水的核壳型胶束。血液相容性(Blood Com-patibility)是血液对外源性物质或材料产生合乎要求的反应。一般是指材料与血液各成分之间的相容性。是生物体的血液对非存在材料产生合乎要求的反应的一种性能。溶血红细胞的完整性受到破坏，从而释放血红蛋白。血栓弹力图（TEG）能动态分析凝血形成和纤维蛋白溶解全过程的曲线图，可完整地反映凝血全过程。细胞毒性实验指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性。2 实验部分2.1 材料与仪器 聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）：济南岱罡，本实验所用的聚乙二醇-聚己内酯有两种规格，分别是mPEG2

24、K-PCL2K和mPEG5K-PCL2K；纤维蛋白原：sigma公司；mPEG-PCL和纤维蛋白原均溶于10 mM PBS （pH7.4）缓冲液中。ELISA试剂盒；CD42，CD62P，凝血酶，HEPES缓冲液；材料的荧光染料（FITC，Alexa，DAPAI）；cck8（日本同仁），NO试剂盒（碧云天），DMEM，FBS（gibco）。 实验中所使用到的血液采集于健康的志愿者体内，收集在含柠檬酸钠小管中（血液与抗凝血剂的体积比为9:1）。贫血小板血浆（PPP）和富血小板血浆（PRP）的制备是通过分别以3000g 和800g 的离心速度离心15 min 得到的。APTT和PT试剂由暨南大学第

25、一附属医院提供。2.2 活化部分凝血酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）测试APTT和PT均用全自动凝血分析仪（STAR Evolution）进行分析。抽取健康人体的新鲜血液，1000g离心5min，取上层血清。在1.5mL离心管中加入270L血清和30L不同浓度的mPEG-PCL溶液（其中混合之前的mPEG-PCL溶液分别为10 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL，与全血混合之后浓度分别变为1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mL），在涡旋振荡仪上混合均匀后进行测试。2.3 血栓弹力图测试分析（TEG） 抽取健康人体的新鲜血液，在含有高岭土的特制管中分别加入9

26、00 L的全血和100 L不同浓度的mPEG-PCL溶液（其中混合之前的mPEG-PCL溶液分别为100 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL，与全血混合之后浓度分别变为10 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL），混匀之后孵育1min以上，再取340L混合液加入含有20LCaCl2的测试杯中，开始测试。2.4 mPEG-PCL对红细胞形态的影响 扫描电镜技术作为用来研究mPEG-PCL对红细胞形态影响的方法。抽取健康人体的新鲜血液，1000g离心5min，取下层红细胞，用PBS缓冲液洗涤分离出来的红细胞23次。在1.5mL离心管中加入1mL 高分子溶液和3050L红细胞，在

27、涡旋振荡仪上混合均匀，恒温37孵育15min。然后1000g离心5min，弃去上清液，加入1 mL4%多聚甲醛的PBS溶液固定至少1h以上。将固定后的红细胞重悬，吸取1020L红细胞悬液均匀地涂在24孔底部，依次用70%，85%，95%，100%的乙醇溶液将红细胞梯度脱水，最后让其在25恒温条件下自然晾干。将铜台用导电胶粘附于固定有红细胞的24孔板底部，取下塑料片，喷金之后即可在电镜下观察红细胞的形态。2.5 红细胞的溶血实验 抽取健康人体的新鲜血液，1000g离心5min，取下层红细胞，用PBS缓冲液配成RBC悬液。取50 L该悬液与1 mL不同浓度的mPEG-PCL溶液分别孵育10min，

28、3h，6h，9h，12h，用PBS缓冲液作为阴性对照，纯水作为阳性对照。之后离心，取200 L上清液于96孔板中，用酶标仪在540 nm读出OD值，最后用公式计算出溶血率。（溶血率=A-B/C-B，A: 样品溶液测试的吸光值；B: 空白值；C: 完全溶血测试的吸光值。）2.6 荧光发射光谱 将不同浓度的mPEG-PCL溶液与0.1 mg/mL的纤维蛋白原溶液等体积混合，室温条件下，设定荧光分光光度计（Hitachi F-7000，日本日立高新技术有限公司）的参数为激发和发射狭缝宽度均为5 nm，激发波长为 ex=280 nm， 扫描速率为1200 nm/min，在300450 nm 范围内测定

29、mPEG5K-PCL2K和mPEG2K-PCL2K作用下纤维蛋白原的荧光光谱。2.7 圆二色谱圆二色谱仪（英国应用光物理公司）用来测定mPEG-PCL作用下纤维蛋白原二级结构的变化。将不同浓度的mPEG-PCL的PBS溶液与浓度为0.4 mg/mL的纤维蛋白原溶液等体积混匀（纤维蛋白原终浓度为0.2 mg/mL），以浓度为0.2 mg/mL纯的纤维蛋白原溶液为对照，在氮气吹扫190260 nm 波长范围内扫描，样品池为1 cm 石英池。所有圆二色谱图谱呈现的都是三次扫描后平均摩尔椭圆率（）减去同一浓度下mPEG-PCL本身的平均摩尔椭圆率。3 结果与讨论3.1 mPEG-PCL对凝血功能的影响

30、3.1.1 活化部分凝血酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）测试凝血级联系统包含三种途径：内源性、外源性和共同途径17，由生物材料所致的凝血通常是由于内源性凝血因子XII的激活，这通常由APTT测定18,19。ATTP是在血浆中通过添加一种部分促凝血酶原激酶试剂和CaCl2后形成纤维蛋白凝血块所需的时间，评价的是内源性凝血途径和共同凝血途径的性能。PT是在血浆中添加一种组织促凝血酶原激酶试剂后形成纤维蛋白凝块所需要的时间，评价的是外源性凝血和共同凝血途径的性能20,21。这里，在mPEG-PCL共聚物的存在下血浆凝血首先被ATTP和PT测得，如图3-1。图3-1 mPEG2k-PCL2k和

31、mPEG5k-PCL2k对APTT和PT的影响（PBS为对照）：（a）不同浓度mPEG2k-PCL2k与血浆的APTT和PT和（b）不同浓度mPEG5k-PCL2k与血浆的APTT和PT。如图3-1（a）所示，在mPEG2k-PCL2k的存在下，的APTT和PT值与PBS对照并没有显著不同。结果表明，在血浆凝血在0.1-10 mg/ml的mPEG2k-PCL2k中并未受到影响。如图3-1（b）所示，在mPEG5k-PCL2k的存在下，APTT值比PBS对照明显要高。这表明，内源血浆凝血功能在0.1-10 mg/ mL的mPEG5k-PCL2k的存在下会受到损害。在0.1和1 mg/ml的mPE

32、G5k-PCL2k存在下，PT值与PBS对照无显著差异，而在10 mg/ml的mPEG5k-PCL2k存在下，PT值比PBS对照明显要低。这表明，外源血浆凝血功能在10 mg/ml的mPEG5k-PCL2k存在下会被激活。从图3-1所示的MPEG-PCL的对血液凝血的影响，APTT和PT结果表明，血浆凝血功能在0.1-10 mg/ml的mPEG2k-PCL2k存在下并未受到影响。然而，内源血浆凝血功能在的0.1-10 mg/ml的mPEG5k-PCL2存在下会受到损害，外源血浆凝血功能在10 mg/ml的mPEG5k-PCL2k存在下会受到激活。3.1.2 血栓弹力图（TEG） TEG是反映血

33、块的形成过程和强度变化的以时间为函数的测试分析方法，是一种能动态分析凝血形成和纤维蛋白溶解全过程的曲线图，可以完整地反映凝血全过程。 TEG记录一个整体和动态凝血过程，然后提供比试验APTT和PT更详细的信息。TEG测试在凝血过程中可以提供四个基本参数：（1）反应时间R引发凝血到形成纤维蛋白所需的时间，主要受凝血因子、的影响；（2）凝血时间K血块动态形成的过程，主要受凝血因子活性、凝血酶、纤维蛋白原和血小板数量的影响；（3）角纤维蛋白交联的速度，主要受纤维蛋白原、凝血酶和血小板数量的影响；（4）血栓MA血块最大强度，反映了血小板的功能及纤维蛋白原的浓度，主要取决于血小板数量和部分功能状态22。

34、超出正常范围中，R减小意味着凝血因子的活性增强，k和减小表明纤维蛋白原聚合的活性增强，MA升高表明血小板聚集增加，反之亦然。 TEG已被广泛用于评估血液安全和血液接触生物材料23。这个实验中，mPEG-PCL共聚物对血液凝血的影响可通过TEG测定进一步研究。如图3-2和表3-1分别为TEG迹线和四个参数。图3-2 在不同浓度的mPEG2k-PCL2k（a）和mPEG5k-PCL2k的（b）的存在下全血凝固TEG扫描图。 如图3-2所示，在所有浓度（除10 mg/ml）的共聚物的存在下，TEG轨迹与PBS对照显示出类似的形状。表3-1 全血与不同聚合物溶液的凝血动力学值Polymer solut

35、ionsR (min)K (min) (deg)MA(mm)Normal range51013537250-70PBS control6.82.557.157.7mPEG2k-PCL2k0.01 mg/mL5.22.261.357.10.1 mg/mL4.81.765.860.91 mg/mL4.81.864.255.410 mg/mL3.5N/A42.26.3mPEG5k-PCL2k0.01 mg/mL6.42.358.458.90.1 mg/mL5.22.161.859.31 mg/mL4.21.864.758.410 mg/mL2.72.359.944.0通过TEG测试分析仪提供的数据，

36、与正常范围相比，代表高于正常范围，代表低于正常范围The sign indicates a low value compared with the normal range provided by the TEG analyzer.如表3-1所示，与由分析器提供的正常范围进行比较，0.01mg/ml的mPEG2k-PCL2k并未造成四个参数的异常。0.1和1mg/ml的mPEG2k-PCL2k引起R值轻微下降，超出正常范围。与正常范围相比，10mg/ml的mPEG2k-PCL2k会引起四个参数的异常。同时，从表3-1可知，与正常范围相比，0.01和0.1mg/ml的mPEG5k-PCL2k未造

37、成四个参数的异常。1mg/ ml的mPEG5k-PCL2k引起R值的轻微下降，超出正常范围。与正常范围相比，10mg/ml的mPEG5k-PCL2k会引起R和MA的异常。TEG结果表明，0.01mg/ml的mPEG2k-PCL2k似乎是一个安全的浓度，0.1和1mg/ml的mPEG2k-PCL2k可以略微提高凝血因子的活性，而10mg/ml的mPEG2k-PCL2k可促进凝血因子的活性，但会损害的纤维蛋白原聚合和血小板聚集的活性。另一方面，TEG结果表明0.1mg/ml的mPEG5k-PCL2k似乎是一个安全浓度，1mg / mL的mPEG5k-PCL2k可以略微提高凝血因子的活性，而10mg

38、/ml的mPEG5k-PCL2k可促进凝血因子的活性，但会损害血小板聚集的活性。相比之下，在相同浓度下，mPEG2k-PCL2k比mPEG5k-PCL2k对全血凝固过程的影响更大。3.2 MPEG-PCL和红细胞之间的相互作用3.2.1 红细胞形貌观察对于体内施用的任何国外的生物材料，当生物材料直接或间接接触进入血液组织，它们将不可避免地与红细胞相互作用。红细胞是在哺乳动物的血液中最丰富的组成部分之一，其在全血中的体积分数通常是约40-50。正常红细胞有双凹面圆盘形状，但是当与外来物质相互作用时会轻易改变24。如图3-3所示，在这项试验中，研究了在不同浓度的mPEG-PCL方案中红细胞的形态。

39、图3-3 在不同浓度的mPEG-PCL溶液或PBS中红细胞的形态与对照组相比，当暴露在10mg/ml以上的mPEG2k-PCL2k或mPEG5k-PCL2k时，所有的红细胞既不聚集也不经历明显的形态变化。从如图3-3中的红细胞形态观察结果，红细胞与共聚物的相互作用没有足够强大到改变正常红细胞形态。如之前的报道，红细胞与聚合物的相互作用主要是由聚阳离子和负红细胞表面之间的静电吸引，或者通过两亲聚合物的疏水性基团和红细胞膜的脂质双层之间的疏水相互作用25。此外，刘等人报道明显形态的改变的红细胞通过吸附两亲聚合物到红细胞膜上的诱导，通过与红细胞脂质双分子层疏水相互作用26。在这个研究中，共聚物的疏水

40、PCL链段可能会倾向于相互缠结而不是伸入红细胞脂双层。3.2.2 红细胞体外溶血实验溶血实验是通过测量释放的细胞内的血红蛋白，来评价生物材料对红细胞膜的损坏程度及完整性。在体外溶血实验已被广泛应用于研究生物医学材料的生物相容性。通常，溶血低于5的比例不认为是显著的红细胞裂解，反之亦然24。在这项研究中，如图3-4（b）和（c）,溶血实验在不同浓度下的mPEG2k-PCL2k或mPEG5k-PCL2k中进行。图3-4 mPEG2k-PCL2k（b）和mPEG5k-PCL2k（c）溶液10min-12内诱导红细胞溶血。 结果表明，在共聚物的存在下可达12小时下，该溶血数据均低于3。红细胞的溶血实验

41、进一步证明，红细胞膜与共聚物的相互作用不足以破坏细胞膜的完整性，这是与上述结果是一致的。总之，mPEG-PCL共聚物没有对红细胞不存在可检测出的破坏作用。3.3 mPEG-PCL和纤维蛋白原的相互作用3.3.1 荧光光谱在血液凝固过程中，凝血酶由纤维蛋白原转变成为血纤维蛋白，这是血块形成的基本标志。纤维蛋白原是一种由两个相同的亚基组成的高分子糖蛋白，每个亚基含有三个肽链，例如，A, B, and 。每个纤维蛋白原单体都有72 个内源性荧光色氨酸残基，其中11 个在 链上，14 个在 链上，11 个在 链上27。适当的结构和纤维蛋白原的构象对维持其正常的生物功能至关重要。因此，研究与外来生物材料

42、接触的纤维蛋白原的变化很有必要。荧光光谱提供与生物材料相互作用后，蛋白质结构变化的综合信息。由色氨酸残基支配的固有荧光可用于监测纤维蛋白原分子的构象变化。色氨酸残基的微环境周围的微小变化可通过内源荧光的变化进行监测28。如图3-5所示，在mPEG-PCL共聚物的存在下，纯纤维蛋白原和血纤维蛋白原的荧光光谱。图3-5 纤维蛋白原（FIB）在mPEG-PCL的不存在和存在下的荧光光谱（a）,（c），mPEG-PCL浓度和荧光强度之间的关系（b）,（d） 纯血纤维蛋白原分子在280 nm波长激发，在max 342nm波长发射荧光。在342 nm处的荧光峰并没有调整，但随着增加共聚物浓度会降低强度。荧

43、光光谱的结果表明，在mPEG-PCL共聚物的存在下，色氨酸分子的微环境会改变，导致纤维蛋白原的荧光淬灭29。与此相反，mPEG5k-PCL2k引发的纤维蛋白原的荧光淬灭比由mPEG2k-PCL2k引发的浓度低。3.3.2 圆二色谱在这个实验中，利用圆二色谱对mPEG-PCL共聚物对纤维蛋白原的构象的影响进行了进一步分析。圆二色谱是定量和定性分析二级结构（既是-螺旋、-折叠和无规卷曲结构）和蛋白质的折叠特性的好方法30。如图3-6所示，在共聚物的存在下纤维蛋白原的圆二色谱。纯血纤维蛋白原的圆二色谱在208和222nm显示两个负峰，这表示该蛋白质的螺旋结构的。椭圆率在208和222nm并没有经历明

44、显的规律改变。图3-6 纤维蛋白原（FIB）在不存在mPEG-PCL和存在于不同浓度的mPEG2k-PCL2k（a）和mPEG5k-PCL2k（b）的圆二色谱圆二色谱表明，共聚物的存在并不明显地改变纤维蛋白原的构象。普遍认为，疏水性相互作用，静电吸引，氢键和/或其它力是生物材料和蛋白质之间的最显著相互作用力31。结果表明，纤维蛋白原和共聚物之间的相互作用力没有强到足以改变纤维蛋白原的构象。从该光谱的结果，共聚物的存在改变了局部微环境，但不影响纤维蛋白原的整体构象。结论有生物相容性和生物可降解性的两亲性共聚物mPEG-PCL，分子内存在一定比例的亲水基团和疏水基团。本文中，我们研究了两种不同分子

45、量的mPEG-PCL对纤维蛋白原结构和凝血功能的影响。研究发现，不同分子量的mPEG-PCL和纤维蛋白原能形成复合物是在一定程度上取决于mPEG-PCL的分子量和浓度的。将不同分子量mPEG-PCL存在情况与对照相比，比较其APTT、PT值，可以得出：低分子量mPEG-PCL的存在对血浆凝血功能没有明显的影响，高分子量mPEG-PCL的存在会损害内源血浆凝血功能，且高浓度时会激活外源血浆凝血功能。在全血的凝血过程中，不同分子量的mPEG-PCL，浓度越高，越会导致部分TEG参数反常。mPEG-PCL材料对红细胞膜及红细胞的形态及聚集均无明显的影响。在mPEG-PCL共聚物的存在下，色氨酸分子的

46、微环境会改变，高分子量mPEG-PCL导致纤维蛋白原的荧光淬灭比低分子所需的浓度低。此外，mPEG-PCL共聚物的存在虽然改变了局部微环境，但不影响纤维蛋白原的整体构象。本研究中获知的信息对于mPEG-PCL或其他生物材料分子量的设计和在体内的生物功能具有重要的指导意义，本实验也将为其应用于生物材料和组织工程等生物医学领域提供了实验依据。致谢首先，感谢我的导师薛巍老师，他无私的关爱和严谨的治学态度，是我学习的榜样，是我不断进取的动力，谢谢他的细心教导。其次，感谢刘宗华老师和生物医学工程系药物载体实验室测试分析中心的师兄师姐，尤其是胡倩师姐，耐心、细心的指导我，在我实验中提供帮助，在论文撰写过程

47、中提供了非常多的宝贵建议和资料。再次，感谢生物医学工程系药物载体实验室测试分析中心为我提供了一个优异的实验环境和一系列先进的仪器设备。最后，感谢在大学这四年的学习中教过我的所有生物医学工程系的老师们，谢谢他们传授给了我知识和悉心的培养。由于本人水平限制，论文中难免有错误和遗漏的地方，恳请各位老师批评指正。参考文献 1刘欣,史弘道医用生物材料血液相容性评价研究概况透析与人工器官，2003,1（1）:41-442张明华，郑海燕抗凝血生物材料的血液相容性中国组织工程研究，2013，17(8)：1505-15123张安兄，吕德龙，钟伟，程为庄，杜强国生物材料的血液相容性上海生物医学工程，2004，25

48、(3)：53-584胡国栋聚氨酯的血液相容性评价国外医学生物医学工程分册，2002，25(6)：271-2845程青,王国斌生物材料血液相容性评价研究进展上海生物医学工程，2001，22(3)：31-336王玮，张弢，潘美玉，戴佶mPEG-PCL两嵌段共聚物的合成及对PVC的增塑作用高分子材料科学与工程，2009，25(1)：28-307刘丽波，陆轶业，刘黎，王少兵，郭圣荣O/O乳化-溶剂挥发法制备mPEG-PCL微球的形成过程及影响因素上海交通大学学报，2008，1(1)：160-1648刘丽波PCL 及 mPEG-PCL 嵌段共聚物微球的研究：硕士学位论文上海：上海交通大学，20099沈春

49、花PEG-PCL 共聚物纳米粒降解行为及其用作药物载体的研究：硕士学位论文上海：上海交通大学，200810魏伟，邓吉喆，李方实，王碧，蔡林涛pH响应型mPEG-PCL嵌段共聚物胶束用作药物运输精细化工，2013，30(3)：253-28011刘学军，许博，翟翠萍，袁金芳，高青雨生物可降解两亲性嵌段共聚物胶束的制备及其对叶酸的控制释放胶体与聚合物，2010，28(3)：99-10212Liu Z, Jiao Y, Wang T, Zhang Y, Xue W. Interactions between solubilized polymer molecules and blood compone

50、nts. J Control Release. 2012;160:14-24.13Sun Hong-fan, Mei Lin, Song Cun-xian, et al. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant J.Biomaterials, 2006, 27(9): 1735-1740.14Rohner D, Hutmacher D W, See P,et al. Individually CAD-CAM technique designed, bioresorbable 3-dimensi

51、onal polycaprolactone framework for experimental reconstruction of craniofacial defects in the pigJ. Mund Kiefer Gesichtschir, 2002, 6(3): 162 -167.15孙磊,甘志华,徐莘香等.人工合成生物降解可吸收材料细胞免疫学及致突变实验研究J.中华实验外科杂志,1999, 16(2): 169 -170.16王典,尹华月,鲁传华.药用高分子材料亲水性修饰的研究进展J.高分子通报,2013(2): 39-45.17Kainthan RK, Janzen J, K

52、izhakkedathu JN, Devine DV, Brooks DE. Hydrophobically derivatized hyperbranched polyglycerol as a human serum albumin substitute. Biomaterials 2008;29:1693-1704.18Fischer D, von Harpe A, Kunath K, Petersen H, Li YX, Kissel T. Copolymers of ethylene imine and N-(2-hydroxyethyl)-ethylene imine as too

53、ls to study effects of polymer structure on physicochemical and biological properties of DNA complexes. Bioconjugate Chemistry 2002;13:1124-1133.19 Kainthan RK, Gnanamani M, Ganguli M, Ghosh T, Brooks DE, Maiti S, Kizhakkedathu JN. Blood compatibility of novel water soluble hyperbranched polyglycero

54、l-based multivalent cationic polymers and their interaction with DNA. Biomaterials 2006;27:5377-5390.20 Kainthan RK, Janzen J, Levin E, Devine DV, Brooks DE. Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol. Biomacromolecules 2006;7:703-709.21 Meng S, Liu ZJ, Shen L, Guo Z, Chou LSL, Zhong W, Du QG, Ge J. The effect of a layer-by-layer chitosan-heparin coating on the endothelialization and coagulatio