病毒包装相关知识汇总

1、病毒包装相关知识汇总应用领域随着分子生物学的理论及技术方法 （特别是重组DNA技术）的迅速发展，人们可以在实验 室构建各种载体、 克隆及分析目标基因， 使疾病深入至分子水平研究， 于是诞生了基因诊断、 基因治疗技术。基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补， 或将正常功能的基因置换的方 法。 从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或 预防疾病的目标的新措施。当代基因治疗研究的热门方法是将外源DNA或 RNA片段导入靶细胞或组织，研究靶基因的上调或抑制情况。 例如，有些异常基因 （癌基因、 病毒基因 ） ，可通过技术引入外源片段将 其抑制；有些基因本身有

2、治疗作用，体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。 而病毒载体已成为当前基因治疗载体研 究的热点。病毒载体的优势：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，感染效率高；2、病毒的宿主范围广，可以感染分裂细胞和非分裂细胞；3、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；4、复杂的装配过程由细胞完成；5、不同的病毒载体具有不同的表达特点；6、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；7、病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产慢病毒包装技术背景：慢病毒（ Lentivirus ）是逆转录病毒的一种， 慢病毒（ Le

3、ntivirus ）载体是以 HIV-1 （人 类免疫缺陷 1 型病毒） 为基础发展起来的病毒载体。 具有感染谱广泛、 可用于感染依靠传统 转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞， 并且在感染后 可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，成为导入外源基因的有力工具。目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰等研究以及活体动物实验中。技术原理：慢病毒载体系统包含了包装、 转染、 稳定整合所需要的遗传信息， 且能提供慢病毒所有 的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。第三代四质粒慢病毒载体系统，相较于前代慢病毒载体，安

4、全性大大提升。其包括如下成分：a. 基因转移 / 表达载体；b.辅助载体。利用表达载体和辅助载体共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装， 包装好的假病毒颗粒 分泌到细胞外的培养基中， 离心取上清液后纯化病毒， 可以直接用于宿主细胞的感染， 目的 基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。技术特点：1直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用。2、可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3、可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4、无需任何转染试剂，操作简便。5、可以根据需要选择多种标记。技术应用：1将过表达质粒/干扰质粒转入

5、难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细 胞；2、将过表达质粒/干扰质粒转入动物组织，以期获得长期表达；3、构建稳定过表达/干扰细胞系，再用 exvivo的方法导入动物体内；4、基因治疗；5、转基因动物；6、基因敲除；7、药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用；8、快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法。技术流程概述：1基因合成及病毒载体构建2、转染及验证3、细胞培养及慢病毒包装4、收获病毒液及病毒纯化5、病毒滴度检测6、感染效果WB或 qPCF评价AaM iJ? mi1*1 CZ2TKI I cnKI .慢病毒包装常用质粒图谱：X14E怙呻 I23M

6、J UWJ risen腺病毒包装技术背景:腺病毒(Ade novirus , AdV)是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、 上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染； 但是应用于基 因治疗研究的腺病毒是安全的， 对人无致病、 致畸、 致癌的潜在危害。 根据 Journal of Gene Medicine 的统计，截至 2006 年，在全球 1192项基因治疗临床试验方案中，有305 项(26%)使用腺病毒载体，首次超过反转录病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道， 所以它所介导的基因治疗可以静脉注射， 还可以通过口服经肠道吸收， 或通过喷雾

7、、 滴注经 呼吸道吸收，使得基因治疗方案易于推广应用。技术原理：腺病毒(Ade novirus )是一种无包膜的双链线性DNA病毒，基因组长约 36 kb，衣壳呈规则的 20 面体结构。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包 括分裂和不分裂的细胞； 除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。 腺病毒适用于在难以转染的 细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因和 in vivo 实验。常用重组腺病毒系统组成： 腺病毒骨架载体 (携带腺病毒主要功能基因) 、穿梭载体(转 移外源基因表达盒到骨架载体上)。目前应用最为广泛的是 AdMax腺病毒载体系统，骨架质 粒和穿梭载体共转染 293 细

8、胞后，在细胞内中通过 Cre/loxP 实现载体重组，进而产生重组 腺病毒。通过裂解细胞收获病毒粒子， 病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。 技术特点1、几乎可以感染所有类型的细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞；2、 可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒；3、 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL；4、腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单；5、感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。技术应用1、应用于体内接种疫苗。 用携带免疫调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应 肿瘤细胞以诱导抗肿瘤免疫反应，

9、可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。2、应用于信号转导，基因转位， coIP ，动物实验，干细胞研究等科研实验。3、可以完成较高难度的克隆构建， 包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建， 在短时间内完成从原始质粒到病毒 DNA的构建工作。4、产生滴度高，非常适于基因治疗。技术流程1 、构建穿梭质粒以含目的基因的质粒为模板，分别在两个酶切位点设计引物，PCR扩增目的基因，双酶切后插入穿梭质粒。2、细胞转染 将取骨架质粒和穿梭质粒转染 293 细胞。3、 将Pac I消化后的腺病毒表达载体转染AD293细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4、将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。5、收集病毒颗粒分装，-8

10、0 C保存。腺病毒包装常用质粒图谱腺相关病毒包装技术背景：腺相关病毒（adeno-associated virus ，AAV），属于微小病毒科（parvovirus），为无包 膜的单链线状DNA病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。AAV的基因组约4800bp， 两个ITR序列和两个开放阅读框。AAV具有多种常见血清型，100多种病毒变种。其中 AAV2是目前应用最广的腺相关病毒，对多数常见细胞均有较好效果。重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒， 由于其安全性好、宿主细胞范 围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点， 被广泛用于体 内实验

11、研究，且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。腺相关病毒载体整合率远低于慢病毒载体， 但其可以以染色体外形式长期 （数月至数年）存在于非分裂细胞中， 从而实现外源基因长期表达。技术原理：常用腺相关病毒载体系统 AAV Helper-Free System ，能产生AAV2血清型病毒而无需辅 助病毒。该系统包含 3个质粒：1个重组表达质粒和 2个辅助质粒。将目的基因克隆至重组 pAAV载体上；将 AAV感染必须的腺病毒基因（E2A E4及VA等）构建至辅助质粒 pHepler 上，将AAV复制基因rep和capsid结构基因cap构建至质粒pAAV-RC上。三质粒共转染表 达腺病毒

12、E1基因细胞，在细胞中进行病毒的包装。通过裂解细胞，离心取得上清液后进一 步浓缩纯化，收集病毒。技术特点：1、安全，AAV不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病治疗；2、 感染范围广，可以用于神经系统、 眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药；2、滴度高，颗粒小，扩散能力强；3、表达稳定，可持续半年以上；4、外源基因定向重组，免疫原性低，极少发生非特异反应和免疫抑制，适合于进行基因治 疗研究。技术流程：1、病毒载体构建2、腺相关病毒包装3、腺相关病毒浓缩与纯化4、病毒滴度检测腺相关病毒包装常用质粒图谱：附1: 12种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性血清型组织亲和性AAV1肌肉，

13、心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3肌肉，肝脏，肺，眼AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6肺，心脏AAV7肌肉，肝脏AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺(肺泡)，肝脏，中枢神经DJ肝脏，视网膜，肺，肾脏DJ/8肝脏，眼，中枢神经，肌肉Rh10肺，心脏，肌肉，中枢神经，肝脏附2:常见的病毒载体及生物学特性比较:随着基因治疗的广泛应用， 科学家们陆续开发出多种病毒载体，用于外源基因导入靶细胞或组织。这些病毒载体各有优点， 其中，慢病毒包装简单、周期短、可稳定表达；腺病毒滴度高、 感染及表达蛋

14、白的能力强；腺相关病毒安全性高、 表达稳定。在实验中，均需根据自己的实 验目的进行实际选择。特将这三种病毒的生物学特性整理如下：慢病毒(Lentivirus)腺相关病毒(AAV腺病毒(Ade no virus )RNAssDNAdsDNA病毒类型包装容量8kb< 5kb8kb包膜有无无颗粒直径90-100 nm20-30 nm60-90nm包膜有无无基因组dsRNAssDNAdsDNA表达起始时间48-72h72-96h24-48h表达持续时间> 2 mon ths> 6 mon ths1 mon th定向低频整合或非整合宿主基因组整合方式随机高频整合非整合亲噬性感染谱广感染

15、谱广感染谱广免疫原性低低高主要缺点随机整合存在引发包装容量小免疫原性低，无致病性肿瘤的可能性主要优点在大部分组织中获得稳疋表达免疫原性强大部分组织都可以获得较咼感染效率附3:如何根据实验目的选择合适的病毒载体项目慢病毒（LV）腺病毒（Ad）腺相关病毒（AAV体内实验静脉注射-+定点注射+细胞回输+-体外实验过表达+-干扰+-MicroRNA+-前沿研究CRISPR/Cas9+-CAR-T+-自噬+-光遗传+-+附4:病毒包装常见问题与解答综合问题1病毒包装的关键是什么？病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统（尽量使用成熟的商业化载体系统）、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转

16、染控制（24、48小时的细胞及荧光状态判断）、目的基因对病毒包装影响 （基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到 是否能包装成功）。2、病毒载体种类应如何选择？答：稳定长时表达研究选择慢病毒，比如稳转细胞株筛选；病毒使用量大选择腺病毒， 比如老鼠实验；基因治疗选择腺相关病毒。操作难度上慢病毒与腺病毒都差不多，是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。从载体毒性而言，慢病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性， 而腺病毒则有 较大的免疫原性。腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体， 免疫原性较低，而且对受体 伤害较少。从插入目的基因角度考虑，慢病毒最大插入基因长度

17、是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是 3k。（具体可参考附2 :常见的病毒载体及生物学特性比 较）至于具体是选择腺病毒好， 还是慢病毒或别的病毒载体好， 主要还看你的实验目的， 其 次才是看哪那种病毒载体容易做。 金开瑞的研究人员有丰富的病毒研究和使用经验，咨询我们的技术支持团队，您可以获取更多帮助。3、病毒载体对目的基因的长度是否有要求？AAV的总包装容量是 4.7 kb，载体中ITRs （两个ITR共290 bp） +hCM（约750 bp）+polyA（约150 bp）约1200bp,所以如果用AAV包装载体，目的基因长度要求不超过 3.5 kb。 相对应慢病毒

18、目的基因长度不超过5kb，腺病毒载体目的基因长度要求不超过8kb。4、如何选择合适的启动子用于体内动物实验？部分质粒载体的启动子所含GC含量比较高，所以进入动物体内后，细胞会启动表观遗传学信号通路， 对其进行甲基化修饰或者在染色体整合位点进行去乙酰化修饰从而抑制基因 的表达。体外细胞的病毒载体转导偶尔发生类似修饰，但比较罕见。所以，针对体内动物实 验，尤其是利用病毒载体制备转基因或者基因敲除、 RNA 干扰小鼠等，需要选择恰当的启 动子才能表达外源插入片段。 我们拥有丰富的经验， 我们的启动子库可以帮助研究人员选择 合适的启动子用于特定的实验。5、什么时候需要使用诱导表达系统？诱导表达系统无论

19、是对于体外基因功能研究还是体内动物实验，都是非常有用的一套系统，当研究遇到以下情况时，建议使用诱导表达系统：a、所表达基因或者外源片段具有抑制细胞生长、引起细胞毒性等特性；b、需要在特定时间开启或关闭外源片段的表达。6、成功构建诱导表达系统的关键是什么？一个成功的诱导表达系统，需要达到以下效果：a、对于诱导激活系统来说，需要在未激活前保持很低的表达水平，而激活后，能迅速 地高水平并且稳定表达。b、对于诱导关闭系统来说，需要在关闭前可以维持正常的表达水平，而添加诱导关闭 物后，能迅速彻底地关闭基因的表达。而影响诱导表达系统构建成功的因素主要有以下几点：a、诱导表达载体自身调控元件：包括启动子的强

20、弱、启动子对诱导物的响应效果、载 体启动子外其它调控元件对插入片段表达的影响。 解决方案包括使用组合诱导物以达到更佳 效果，改造其它调控元件以减少泄露表达。b、稳定整合位点：由于构建诱导表达系统必须在稳定细胞株中实现，所以，稳定整合位点附近的转录活性对诱导表达系统影响很大。 转录活性过低， 导致诱导激活效果不佳， 转 录活性过高， 导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。因此需要构建多株稳定细胞株，并进行比较，挑取诱导前后均符合预期的一株进行实验。3）稳定整合后拷贝数： 拷贝数过高也会导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有 残留表达。所以建议使用逆转录 （ 包括慢病毒

21、）载体获得单拷贝细胞稳定株。7、如何使用病毒液去感染靶细胞？不同的重组病毒载体， 不同的细胞， 以及动物体内组织细胞侵染， 其具体的操作步骤都 有所不同。所以建议研究人员依据具体的实验选择不同的操作步骤。8、病毒可以高效感染任何靶细胞吗？理论上， 现有的病毒载体可以在任何条件下高效感染任何靶细胞。 其依据是， 病毒载体 高效感染细胞主要受三个参数影响：细胞特性： 分裂和非分裂细胞、 体内所处环境是否存在血脑屏障等阻碍。 现有的病毒载 体，综合起来， 既可以侵染分裂细胞，也可以侵染非分裂细胞，而且还可以突破血脑屏障高 效侵染脑神经细胞。细胞种类： 不同组织细胞。 虽然不同载体对不同组织细胞的侵染

22、有倾向性， 但通过改造 病毒载体决定病毒表面糖蛋白的序列， 即使针对同一类病毒， 也可以获得最高达数百种不同 侵染特性的载体系列，从而可以满足不同细胞类型的侵染需求。病毒载体的滴度。 除不同类病毒其滴度会不同外，病毒载体的滴度还受包装片段的特 性影响， 包括插入片段的毒性和大小。 外源片段的毒性可以通过使用诱导调控系统或者改造 病毒包装细胞系来减轻毒性影响， 而插入片段的大小的影响可以通过选择对外源片段具不同 容纳能力的病毒载体来避免。金开瑞拥有庞大的病毒载体库， 可以最广程度地覆盖各种组织细胞， 同时可以覆盖不同 特性的细胞， 还拥有各种诱导表达系统和经过改造的病毒包装细胞系可以包装具有细胞

23、毒性 的外源插入片段。9、如何才能用重组病毒载体在细胞上做出满意的结果？ 病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面： 病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同， 尽量选择转导 效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。 良好的细胞状态。 最好在细胞状态最佳时感染病毒。 特别是不要在消化细胞后不久就感染， 因为此时细 胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。 适当的转导 MO（I 病毒基因组数 /细胞的比），一般可用 105 上下做倍比稀释。 适当的转导体积，如 24孔板可用200ul , 6孔板0.5ml。 转

24、导时间为1-2h，每25分钟晃动培养板混匀一次。（转导时，最好换用无血清培养基，因为血清对病毒的感染有些许不利影响） 可加合适辅助药物刺激，增强表达。 适当表达检测时间， 如是分泌蛋白可每 24h 连续取培养上清检测。 通常蛋白表达量在 几百纳克至几微克 /ml 水平。10、如何才能用病毒载体在动物体内做出满意的结果？ 病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面： 选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。 选择适当的靶器官： 同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择

25、转导效率高的靶器官。 转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。 转导病毒量：根据经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。 检测时间： 根据经验不同基因的表达高峰时间是不同的， 一般在 2 周可检测到基因表 达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上的时间。11、用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？是的， 病毒纯化很有必要。 因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、 大量的病毒外壳和 penton 蛋白（细胞毒素） 、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿 主强烈的免疫反应。 另外， 纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、 使病毒 悬浮于适于体内注射的缓冲液

26、中等。12、病毒可以浓缩或稀释吗？方法如何？可以浓缩： 对于一般实验室用户， 可以采用高速离心办法浓缩。 目前市面上的病毒浓缩 纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用 300K 以 下的浓缩 离心管 （PALL 公 司产品 ）进行 浓缩。一 般来说 浓缩后的滴度 以不超 过 3X 1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释： 在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求， 常规的动物试验 用等渗溶液即可，如 PBS生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。13、病毒一定要浓缩么？病毒一般可以收两次， 可以在 48 h 和 72 h 各

27、收一次。 如果你不想麻烦浓缩病毒的话， 也可以不浓缩， 直接将收集的病毒上清作为要感染的细胞的培养基， 但是可能效果会不太好。 并且一般收病毒时， 培养基的营养已经损耗了很多， 那样直接培养感染细胞会损害细胞， 所 以建议还是进行浓缩后再感染。14、VP， PFU， IFU 的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？VP：病毒颗粒（viral particle ），是"活”（有感染性）和"死”（无感染性）的腺 病毒颗粒的总量。 在体内实验中， 它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的 腺病毒颗粒总量。测定方法是 OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过

28、此方法测定VP/ml值。PFU空斑形成单位（plaque formation unit ），是有感染性的"活”的腺病毒的总 量，即腺病毒得活性单位。 测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后， 感染 293细胞 并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中 PFU/ml 值。IU :感染单位（infectiousunit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产 品要用于人体实验， 按中国生物制品质量要求， 该比值应该在 33以下。用于普通实验研究， 该比值要求可以适当放

29、宽。15、感染细胞最佳 MOI的测定？MOI（ Multiplicity of Infection ，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如HeLa、 293 细胞， MOI=1 时， 80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MO（I 比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒， 比如 Lenti-EGFP ）。16、重组病毒产品如何运输和保存？ 病毒产品一般采取干冰运输。避免重组病毒反复冻融，

30、请酌情分装后于-80 C保存，建议不要在-20 C下长期保存。在 我们提供的保存液中， 病毒产品-80 C保存期为半年。 建议保存612个月以上的样品，进行 实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的 病毒一时用不完，滴度足够高时，4C可保存12周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4 C 放置 1 周，滴度会有 45 倍的下降。17、所提供这些病毒产品的安全性如何？使用病毒载体的危险性主要有以下几个考虑因素：a、是否能重组产生致病性病毒；b、是否具备复制能力；c、是否能整合，并导致癌基因激活或者抑癌基因失活；d、免疫原性。金开瑞所使用的病毒载体， 全部经过

31、改造， 去除了致病性元件和复制功能区， 因此重组 产生功能性病毒的概率极低。 一部分病毒 （腺病毒和腺相关病毒载体 ） ，其整合几率低， 因此 安全性高。同时，针对部分具备整合能力的病毒载体（慢病毒载体），还去除了其3' LTR内的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。 因此，这些病毒载体用于体外和动物实验，对 使用者而言都具有极高的安全性。有的病毒载体， 比如腺相关病毒载体，即使用于人体，也 被认为是安全性非常高的一类基因治疗载体。 尽管如此， 我们建议， 使用病毒载体进行细胞 或动物实验时，需要遵循标准废弃病毒载体操作流程。18、如何保证病毒包装实验室安全？病毒载体已经被全世界许多

32、实验室应用， 没有出现过任何意外， 但仍具有潜在的产生复 制型病毒（RCL和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！所有操作均应尽量在 BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避 免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip 头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细 玻璃吸管和解剖刀。 每次实验后， 立即清理所有接触过病毒的器具， 均应高压消毒再进行下 一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。

33、装盛病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚， 并标注“危险品”字样。 尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染 病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示。关于慢病毒1、慢病毒载体的特点及应用范围？慢病毒载体是有包膜的 RNA病毒，可以感染分裂和非分裂细胞（而逆转录病毒只能感染 有丝分裂活性的细胞） ，在感染宿主细胞后不能自我复制。以水泡口炎病毒（VesicularStomatitis Virus ）包膜G蛋白VSV-G替换野生型包膜蛋白，使重组慢病毒感染范围覆盖了 各种传代和原代的肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞，以及干细胞、T细胞等。2、金开瑞生物的重组慢病

34、毒使用何种系统？金开瑞生物使用第三代慢病毒包装系统，包括 3 个辅助质粒、 1 个用于插入目的基因的 转移质粒，三个毒粒组装必须的基因（Pol，Gag, Rev）被分开装载于不同的质粒上，包装5'过程中必须 4质粒共转才能成功出毒，最大限度降低了重组概率。同时三代转移质粒的 和3' LTR都删除缺失了野生型的 U3,成为不能自我复制的自灭活（ SIN）载体。3、慢病毒载体生物安全性如何？重组慢病毒载体已经删除了所有野生型毒性基因，感染细胞后只表达装载的目的基因， 不表达任何野生型病毒的 基因，自 灭活序列修饰使其不能复制，包膜糖蛋白做了 pseudotyped替换为VSV-G因

35、此三代包装系统的改造保证了慢病毒载体的生物安全性，目 前未有致瘤报道。4、影响慢病毒产量的因素有哪些？包装过程中，慢病毒的产量随着插入片段的增大而呈指数下降，一般当目的基因2k时即会可见显著的出毒效率降低，当接近 4k 时，其出毒量会低至可以使用的下限、或几乎 不出毒。插入序列的GC含量70%寸，产量会受到影响。 一些对包装细胞有毒性的基因，也会导致难以产毒。5、慢病毒载体可以容纳多大的插入基因？整个慢病毒基因组在 5 '和3' LTR之间的最大容纳能力约 9k,由于转移载体中各种表 达原件的存在，载体的实际装载极限在4k左右。一般3.5k的基因已无法作产量保证。6、该如何选择

36、转移载体？根据实验应用需求，主要从启动子、荧光 / 抗性标签等角度选择载体所携带的原件。过 表达目的序列（包括编码基因、非编码RNA时通常选择CMV启动子，某些情况可能使用 EF1a 启动子；进行 shRNA干扰时通常选择 U6启动子。后续进行稳转株筛选时，需携带如Puro的抗性筛选基因。携带 GFP、 mCherry 等荧光蛋白便于直观监测病毒感染效率，但在后续的 免疫荧光、流式细胞术等实验中，可能会由于波长范围干扰而带来不便，例如GFP同FITC互相干扰。另外当目的基因较大时，携带不必要的荧光或筛选元件会进一步降低出毒效率。7、慢病毒感染后多长时间可见目的基因表达？通常慢病毒介导的目的基因

37、表达通常在 72h 左右达到高峰， 大多数后续检测可在此阶段 进行。对于代谢快速的细胞在 24h即可看到荧光蛋白等较高表达的产物， 代谢较慢的细胞可 能需要 72-96h 。8、我以前用过慢病毒感染造血细胞，但是表达不理想，你们有没有好的解决办法？答：影响慢病毒载体介导的目的蛋白表达的因素主要是病毒的感染能力和特定的启动子 在该细胞中的强度。VSV-G介导的慢病毒载体对造血系统的细胞的感染能力并不合适，除了 常规用的VSV-G外，我们公司还拥有其它 8种病毒包膜蛋白库， 我们会根据客户的需要选择 特定的包膜蛋白， 或者是利用特定的启动子， 从而使目的基因能在特定的细胞中得以高表达。9、你们提供

38、的慢病毒的滴度是如何测定的？这个测定方法如何？我拿到病毒后需要自己测 滴度吗？我们是在293T细胞株中对纯化的慢病毒进行滴度测定的。常用有4种方法进行慢病毒滴度测定，分别是： 通过 ELISA 对病毒颗粒中的 p24 蛋白进行检测； 通过定量PCF对病毒颗粒的RNA进行检查； 通过定量PCM整合到基因组 DNA中的病毒序列进行检测； 通过FACS对荧光蛋白的表达水平进行检测。我们用基因组DNA定量PCR勺方法和荧光法进行慢病毒滴度的检测。前两种方法并不能区分病毒颗粒是否有活性， 因此测定所得的滴度往往比后两种方法高一至两个数量级。 后两 种方法确定的是有效的病毒滴度， 因此更有意义。 由于并非

39、所有的病毒载体中都含有荧光蛋 白，此外，荧光蛋白的表达有时候还受启动子及表达的目的基因影响， 因此通过整合到基因 组中的病毒序列进行检测是最佳方法。关于腺病毒1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如 AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装 的外源片断要求小于 8 kb。而对于只有 E1缺失或E3缺失的载体，比如 Kit A、Kit B等, 外源片断要求小于 5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验（ 体外试

40、验 ） 和动物试验（ 体内试验 ）两部分， 不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。 根据经验， 完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3X 1012 VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性， 关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。 纯化过程只是去掉有缺陷 的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程， 如果扩增的病毒滴度高， 那么纯化后就 会更高的。4、 克隆到转移载体的基因中的5'和3' UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5'要避免在 mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG前面可以加一小段（

41、6-9bp ）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak 序列（GCCGCCACCATG）5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是最简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。Ad5 能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等， 感染效率较低。6、腺病毒载体在体外实验（ in vitro ）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献 报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。2）在细胞处于对数生长期时感

42、染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因 为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。3） 选择适当的转导 MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.11000范围内进 行试验 （ 10 倍比稀释 ）。4） 感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24 孔板可用 200ul ， 6孔板 1ml。5）感染时间为 90 分钟，每 15 分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h 后就能检测到目的基因的表达， 48 小时表达达到较高水平。7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？是的，病毒纯化是很

43、必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒 fiber 和 penton 蛋白（细胞毒素） 、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内， 会引起宿主强烈的免疫反应。 另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、 使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。8、如果我的实验中需要将重组腺病毒注射入动物体内， 如果贵公司提供的纯化产品比较浓， 需要如何稀释病毒产品，有特殊要求吗？在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求， 常规的动物试验用等渗溶液 即可，如PBS生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒 在28C保存时间越短越好。9、小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何？大部分文献显示，腺病毒用量范围在108-10IU/ 只小鼠。根据经验，小鼠肌注腺病毒后，34 天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。10、 腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少？根据经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1X 1011v.p./只；裸鼠和 SCID鼠可能更敏感一些。 肌注方式的