致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌O157H7

1、致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157 o157 ：h7h7食品微生物国际标准和现代快速检测方法培训食品微生物国际标准和现代快速检测方法培训enterovirulent escherichia coli & enterohemorrhagic escherichia coli o157:h7 一、概念及分类地位一、概念及分类地位二、生物学特性二、生物学特性三、卫生学意义三、卫生学意义四、检测方法四、检测方法五、希望五、希望内容提要内容提要一一 概念及分类地位概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌（致泻大肠埃希氏菌（enterovirulent e. coli

2、）：）：大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病的一群大肠杆菌。的一群大肠杆菌。一一 概念及分类地位概念及分类地位埃希氏菌属埃希氏菌属大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠道致病性大肠道致病性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌epec肠道出血性大肠道出血性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌 ehec产肠毒素大肠产肠毒素大肠埃希氏菌埃希氏菌 etec肠道侵袭性大肠道侵袭性大 肠埃希氏菌肠埃希氏菌 e

3、iec肠杆菌科肠杆菌科一一 概念及分类地位概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（epec）：是婴儿腹泻的）：是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。成人少见。 肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（ehec）：引起散发性或）：引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。胞毒素。 肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（etec）：引起婴幼儿和）：引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样

4、症状。乱样症状。 eiec 引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性腹泻的爆发。腹泻的爆发。 肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（ehec）：）：l987年由年由levine提出，是能引起人的出血提出，是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以o157：h7血清型为代表菌株。血清型为代表菌株。ehec o157：h7感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠炎（炎（hc）、肾溶血性尿毒综合征（）、肾溶血性尿毒综合征（hu

5、s）、血栓性血小板减少性紫癜（、血栓性血小板减少性紫癜（tip）等。）等。其中其中hus病程凶险，易造成急性肾衰竭乃病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。至死亡。二二 生物学特性生物学特性革 兰 氏 染 色 阴 性 、 两 端 钝 圆 的 短 小 杆 菌 ， 一 般 大 小 约革 兰 氏 染 色 阴 性 、 两 端 钝 圆 的 短 小 杆 菌 ， 一 般 大 小 约0.5m0.8m1.0m3.0m，因生长条件不同，个别菌体可呈近似，因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有球状或长丝状。多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭

6、毛而能运动，但多数菌体只有左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有14根，一般不根，一般不超过超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好。性染料着色良好。 在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为度为37，在，在4244条件下仍能生长，生长温度范围为条件下仍能生长，生长温度范围为1546。 对理化因素的抵抗力，在

7、无芽胞菌中是最强的一种，在对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但将将37降至降至4过程中，过程中， 30分钟可杀死此菌。加热分钟可杀死此菌。加热60，30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用此菌这一性质。此菌这一性质。 ehec

8、o157：h7其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性，即其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性，即o157：nm。ehec o157：h7具有具有较强的耐酸性，较强的耐酸性，ph 2.53.0，37可耐受可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，751分钟即被分钟即被灭活；对氯敏感，可被灭活；对氯敏感，可被1mg/l的余氯浓度杀灭。的余氯浓度杀灭。适宜生长温度为适宜生长温度为3342，37繁殖迅速，繁殖迅速，4445生长不良，生长不良，45.5t停停止生长。止生长。除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他

9、常见的生化特征与大肠埃希氏菌基除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，本相似，ehec oehec o157157：h h7 7虽然有虽然有uidauida基因，但其编码的基因，但其编码的葡萄糖醛酸酶葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解无活性，不能分解4 4甲基伞形酮甲基伞形酮d d葡糖糖醛酸苷（葡糖糖醛酸苷（mugmug）产生荧）产生荧光，即光，即mugmug阴性。阴性。三三 卫生学意义卫生学意义在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标卫生细菌学指标 是国际上公认的卫生监测指示菌是国际上公认的卫生监测指示

10、菌 作为微生物污染状况的监测指标和作为微生物污染状况的监测指标和haccp实施效果实施效果的评估指标的评估指标 多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性 致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%60%以上以上 近来，国家质检总局从美国进口的鸡腿中多次检出近来，国家质检总局从美国进口的鸡腿中多次检出o157o157：h7h7型大肠杆型大肠杆菌，并将其销毁

11、处理。菌，并将其销毁处理。鉴于出血性大肠杆菌鉴于出血性大肠杆菌o157o157：h7h7对食品卫生的重要性，世界卫生组织于对食品卫生的重要性，世界卫生组织于19971997年年4 4月月- 5- 5月召开专家会议，讨论防制措施，提出将汉堡包、碎牛月召开专家会议，讨论防制措施，提出将汉堡包、碎牛肉、生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。肉、生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。 1982 1982年在美国首次发现年在美国首次发现o157o157：h7h7型大肠杆菌。型大肠杆菌。此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接连此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接连不断

12、发生。不断发生。19931993年美国发生了年美国发生了700700人感染的暴人感染的暴发流行。至今美国共暴发流行发流行。至今美国共暴发流行6060多起，每年约多起，每年约2 2万人感染。万人感染。19961996年夏天，日本这个号称世界年夏天，日本这个号称世界上最干净的国家里暴发由上最干净的国家里暴发由o157o157：h7h7型大肠杆菌型大肠杆菌污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，波及东京、大阪、京都等波及东京、大阪、京都等4040多个府县，患者累多个府县，患者累计达计达90009000余人，余人，7 7人死亡。人死亡。肠产毒性肠产毒性大肠杆

13、菌大肠杆菌肠致病性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌 肠侵袭性肠侵袭性大肠杆菌大肠杆菌肠出血性肠出血性大肠杆菌大肠杆菌感染感染部位部位小肠小肠小肠小肠大肠大肠大肠大肠腹泻腹泻类型类型水泻水泻水泻水泻痢疾样痢疾样血性腹泻血性腹泻易感易感人群人群婴儿，成人婴儿，成人婴儿婴儿成人，儿童成人，儿童各种年龄各种年龄分布分布发展中国家发展中国家（热带）（热带）世界各地世界各地世界各地世界各地北美，日本北美，日本流行流行病学病学散发或暴发婴散发或暴发婴儿腹泻及旅游儿腹泻及旅游者腹泻者腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发，常见于散发或暴发，常见于年龄较大儿童年龄较大儿童引起散发性引起散发性或暴发性出或暴发

14、性出血性结肠炎血性结肠炎致病致病机理机理ltlt，stst定居因子定居因子细胞毒素细胞毒素定居因子定居因子侵袭肠粘膜细胞侵袭肠粘膜细胞细胞毒素细胞毒素常见常见o o血清型血清型6 6，8 8，1515，2020，2525，2727，7878，148148，1591592 2，2626，4444，5555，8686，111111，114114，119119，125125，126126，127127，128128，142142，146146，158158 2828，2929，112112，124124，136136，143143，144144，152152，164164，167167 o157o1

15、57：h7h7， o o157157：nmnm鉴定鉴定测定测定ltlt、stst，检出定居因检出定居因子血清型子血清型血清型与临床表现血清型与临床表现血清型测定细胞侵血清型测定细胞侵袭力袭力血清型血清型四四 检测方法检测方法1、致泻大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌 经典培养生化鉴定法经典培养生化鉴定法2、肠出血性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌o157：h7 经典培养生化鉴定法经典培养生化鉴定法 显色培养筛选法显色培养筛选法 pcr方法方法 实时实时pcr方法方法 vidas快速筛选法快速筛选法 bax全自动全自动pcr方法方法 免疫磁珠富集方法免疫磁珠富集方法 胶体金方法胶体金方法 由于传统经典检测

16、方法的检测水平只能达到由于传统经典检测方法的检测水平只能达到200cfu/g200cfu/g，而食品、环境等样品中而食品、环境等样品中ehec o157:h7ehec o157:h7含量较低，且该菌含量较低，且该菌的致病量为的致病量为3cfu/g3cfu/g针对针对ehec o157ehec o157：h7h7的检测技术和方法不断改进和创新，的检测技术和方法不断改进和创新，现已研究建立现已研究建立 6-10 6-10 种检测方法。种检测方法。 1 1 致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.1 1.1 增菌增菌1.2 1.2 分离分离1.3 1.3 生化

17、试验生化试验 1.4 1.4 血清学试验血清学试验1.5 1.5 肠毒素试验肠毒素试验 ( (略略) )1.6 1.6 结果报告结果报告非常非常重要重要1 1 致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）（经典培养生化鉴定法）1.1 1.1 增菌增菌以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（ml），加在），加在225ml营养肉汤中，均质，取出适量，营养肉汤中，均质，取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群mpn，其余的移入，其余的移入500ml广口瓶内，广口瓶内，于于361培养培养6h。挑取。挑取1环，接种于环，接种于1管管30ml肠道菌增菌肉汤内

18、，于肠道菌增菌肉汤内，于42培养培养18h。1.2 1.2 分离分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于平板，于361培养培养18h24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。1.3 1.3 生化试验生化试验（1）接种三糖铁琼脂（）接种三糖铁琼脂（

19、tsi）或克氏双糖铁琼脂（）或克氏双糖铁琼脂（ki）、蛋白胨水、半固）、蛋白胨水、半固体、体、ph7.2尿素琼脂、尿素琼脂、kcnkcn肉汤和赖氨酸脱羧酶，在肉汤和赖氨酸脱羧酶，在3636培养过夜。培养过夜。（2 2）tsitsi斜面产酸或不产酸，底层产酸，斜面产酸或不产酸，底层产酸，h h2 2s s阴性，阴性，kcnkcn阴性和尿素阴性的培阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。养物为大肠埃希氏菌。tsitsi底层不产酸，或底层不产酸，或h h2 2s s、kcnkcn、尿素有任一项为阳性、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。的培养物，均非大肠埃希氏

20、菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 1 1 致泻大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法（经典培养生化鉴定法）1.4 1.4 血清学试验血清学试验假定试验：假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价价o o血清和出血性大肠埃希氏菌血清和出血性大肠埃希氏菌o157o157血清做玻片凝集试验。当与某一血清做玻片凝集试验。当与某一种多价种多价o o血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价血清凝集时，再与该多价

21、血清所包含的单价o o血清做试验。如血清做试验。如与某一个单价与某一个单价o o血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。证实试验：证实试验：制备制备o o抗原悬液，稀释至与抗原悬液，稀释至与mac farlandmac farland 3 3号比浊管相当号比浊管相当的浓度。原效价为（的浓度。原效价为（1:1601:160）（）（1:3201:320）的）的o o血清，用血清，用0.5%0.5%盐水稀释盐水稀释至至1:401:40。稀释血清与抗原悬液在。稀释血清与抗原悬液在10mm10mm75mm75mm试管内等量混合，做单管试管内等量混合，做单管凝集试验。混

22、匀后放于凝集试验。混匀后放于5050水浴锅内，经水浴锅内，经16h16h后观察结果。如出现凝后观察结果。如出现凝集，可证实为该集，可证实为该o o抗原抗原。1.5 1.5 肠毒素试验肠毒素试验 1.6 1.6 结果报告结果报告: : 综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告 检测周期检测周期:4-6:4-6天，灵敏度差，易造成漏检天，灵敏度差，易造成漏检2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7（经典培养生化鉴定法）（经典培养生化鉴定法）检样检样25g25g 225ml m(ec)n225ml m(ec)n肉汤增菌肉汤增菌41 24h

23、41 24h1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6三个稀释度三个稀释度0.1ml0.1ml，涂，涂布布smacsmac（山梨醇麦康凯琼脂平板）（山梨醇麦康凯琼脂平板）37 37 24h24h挑取挑取5-85-8个无色菌落个无色菌落转种转种mugmug、lstlst发酵管培养基发酵管培养基3737、24h24h，挑阴，挑阴性培养物转种普通营养琼脂性培养物转种普通营养琼脂 可按仪器生产厂可按仪器生产厂说明采取；说明采取；vidasvidas快速筛选法快速筛选法45min45min可获初步结果可获初步结果阳性反应者作阳性反应者作进一步证实进一步证实 生化反应鉴定生化反应鉴定血清凝集鉴定

24、血清凝集鉴定ehec乳胶凝集试验乳胶凝集试验或或2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （vidasvidas快速筛选法快速筛选法）检测原理检测原理 vidasvidas快速筛选检测快速筛选检测ehec oehec o157157：h h7 7，是一种在自动，是一种在自动vidasvidas仪器上进行仪器上进行的酶联荧光免疫分析（的酶联荧光免疫分析（elfaelfa）方法。固相容器（）方法。固相容器（sprspr）：一个类似子）：一个类似子加样头样的一次性使用装置，在检测中起固相和加样器作用，加样头样的一次性使用装置，在检测中起固相和加样器作用，sprspr用用抗抗ehec o

25、ehec o157157：h h7 7抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。所有检测步骤均自动由所有检测步骤均自动由vidasvidas仪器完成煮沸过的增菌肉汤加入试条仪器完成煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内，样品在孔后，在特定时间内，样品在sprspr内、外反复循环。标记有碱性磷酸内、外反复循环。标记有碱性磷酸酶的抗体也在酶的抗体也在sprspr内、外循环并与固定在内、外循环并与固定在sprspr壁上的壁上的ehec oehec o157157：h h7 7抗原抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。结合，最后洗去未结合的抗体标记物。sprspr中所

26、用荧光底物为磷酸中所用荧光底物为磷酸4 4甲基伞形物。仍结合在甲基伞形物。仍结合在sprspr壁上的酶将崖化底物转变成具有荧光的产壁上的酶将崖化底物转变成具有荧光的产物，物，4 4甲基伞形酮。在甲基伞形酮。在vidasvidas中由光扫描器检测该荧光强度，试验完中由光扫描器检测该荧光强度，试验完成由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的实验报成由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的实验报告。告。 2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （vidasvidas快速筛选法快速筛选法）样品制备样品制备 225ml mec+n225ml mec+n中加入中加入

27、2525克（克（25ml25ml）样本；已加工的肉，向）样本；已加工的肉，向225ml 225ml mec+nmec+n中加入中加入5050克样本，克样本，3737振荡（振荡（120rpm120rpm）孵育）孵育2424小时。小时。 检测步骤检测步骤（1 1）vidas ehec o157vidas ehec o157：h7h7试剂盒恢复到室温试剂盒恢复到室温（2 2）其余试剂放回）其余试剂放回2 288贮存。贮存。（3 3）标记）标记（4 4）输入信息建立）输入信息建立work listwork list（5 5）将对照液或样品加入）将对照液或样品加入ecoeco试剂条样品孔中央试剂条样品孔

28、中央（6 6）将）将ecoeco试剂条和试剂条和eeo spreeo spr放入放入vidasvidas仪相应位置仪相应位置（7 7）根据）根据vidasvidas操作手册开始检测步骤。检测约需操作手册开始检测步骤。检测约需4545分钟。分钟。（8 8）所有用过的）所有用过的sprssprs和试条丢弃子适当容器。和试条丢弃子适当容器。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （vidasvidas快速筛选法快速筛选法）结果判断结果判断每份样品有两个荧光读数，每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示第一个数值表示sprspr未加入底物时容器和底物的本底。未加入底物时容器和底物的本底。

29、第二个数值则表示第二个数值则表示sprspr内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值减去本底后则为相对荧光值（减去本底后则为相对荧光值（rfvrfv）。）。检测值则是由每份样品的检测值则是由每份样品的rvfrvf与标准对照值相比得出的。从样品和对与标准对照值相比得出的。从样品和对照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。当检测结果阈值当检测结果阈值 0.10 0.10时时, ,表示样品检测结果为阴性。表示样品检测结果为阴性。 当检测结果阈值当检测结果阈值0.100.10时时, ,表示样品检测结果为阳性。表示样品检测结

30、果为阳性。 优点：快速性（优点：快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性天）、特异性、准确性、灵敏性2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o o157157：h h7 7（baxbax全自动全自动pcrpcr方法方法）检测原理检测原理baxbax ehec o ehec o157157：h h7 7检测系统是应用多重检测系统是应用多重pcrpcr技术检测食品中的技术检测食品中的ehec ehec o o157157：h h7 7的自动方法。自动化的的自动方法。自动化的baxbax系统的检测对象是系统的检测对象是ehec oehec o157157：h h7 7特特有的一段有的一段dnadn

31、a片段，片段，此片段是稳定的，而且不受环境的影响。此片段是稳定的，而且不受环境的影响。只需要只需要很微量的很微量的ehec oehec o157157：h h7 7，baxbax系统的系统的pcrpcr技术就可以扩增出目的技术就可以扩增出目的dnadna片片段。段。因此提供了一个十分可靠的证明：即此生物是存在的。因此提供了一个十分可靠的证明：即此生物是存在的。baxbax系统系统通过合并必要的引物，多聚酶和核酸，使其成为一个稳定、干燥、人通过合并必要的引物，多聚酶和核酸，使其成为一个稳定、干燥、人造的药片，并被装入造的药片，并被装入pcrpcr管中，从而使管中，从而使pcrpcr过程简单化。扩

32、增后，这些过程简单化。扩增后，这些管对检测片段一直保持密封，因此显著降低了一种或多种管对检测片段一直保持密封，因此显著降低了一种或多种pcrpcr扩增产扩增产物的潜在污染。物的潜在污染。 一旦扩增反应开始，一旦扩增反应开始，baxbax系统系统pcrpcr片剂中的荧光染料就会与双链片剂中的荧光染料就会与双链dnadna结合，光照时发出荧光信号。扩增反应后，结合，光照时发出荧光信号。扩增反应后，baxbax系统开始检测，接着系统开始检测，接着自动化的自动化的baxbax系统利用荧光检测来分析系统利用荧光检测来分析pcrpcr产物，从而得到阳性或阴产物，从而得到阳性或阴性结果。性结果。 2 2 肠

33、出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o o157157：h h7 7（baxbax全自动全自动pcrpcr方法方法）操作步骤操作步骤（1）样品制备、增菌培养和分离见经典培养生化鉴定方法。）样品制备、增菌培养和分离见经典培养生化鉴定方法。（2）细菌模板）细菌模板dna 的制备按的制备按bax系统系统ehec o157：h7检测试剂检测试剂 盒说明书进行。盒说明书进行。（3）bax系统系统ehec o157：h7检测按照检测按照bax用户指导书来准备试用户指导书来准备试剂、进行检测和读取结果。必须按照实验室工作指南来装配、操作设剂、进行检测和读取结果。必须按照实验室工作指南来装配、操作设备并记录使用情况

34、。备并记录使用情况。结果判断和报告结果判断和报告（1）bax检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。（2）检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。）检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认。（3）检测结果显示不确定或错误的样品，需要用）检测结果显示不确定或错误的样品，需要用bax系统进行确认，系统进行确认，直至显示为阴性或阳性的结果为止。直至显示为阴性或阳性的结果为止。优点：优点：快速性（快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性天）、特异性、准确性、灵敏性2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （免疫磁珠富集方法免疫磁

35、珠富集方法）检样检样25g25g 传统的增菌培养传统的增菌培养 取一定量的增菌液取一定量的增菌液+ dynabeads+ dynabeads anti- o 157 anti- o 157磁珠反应一定时间磁珠反应一定时间 在磁场中倒掉液体在磁场中倒掉液体 用缓冲液清洗几次用缓冲液清洗几次 收集磁珠收集磁珠+ e.coli+ e.coli o157 o157复合体复合体 在选择性培养基上进行培养在选择性培养基上进行培养 优点：准确率高、优点：准确率高、可靠、灵敏度高，特异性强。可靠、灵敏度高，特异性强。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （胶体金方法胶体金方法）原理原理rev

36、ealreveal大肠杆菌大肠杆菌o157o157：h7h7菌检测系统是利用不同富集培养基，为大肠杆菌检测系统是利用不同富集培养基，为大肠杆菌菌o157o157：h7h7提供易利用的营养成分，以及其它大肠杆菌提供易利用的营养成分，以及其它大肠杆菌o157o157：h7h7生存及快生存及快速生长的必要因子，可在速生长的必要因子，可在8 8小时内获得结果。使用细菌学分析指南（小时内获得结果。使用细菌学分析指南（bambam，19981998）或）或usda/fsisusda/fsis提供的富集培养基，结合提供的富集培养基，结合revealreveal检测装置检测装置, ,可以在可以在2020小小时

37、内完成检测。时内完成检测。将少量富集培养物（将少量富集培养物（120120l l）滴加到）滴加到reveal reveal 检测卡的圆形样品区内，样品检测卡的圆形样品区内，样品通过毛细管作用渗过含特异性大肠杆菌通过毛细管作用渗过含特异性大肠杆菌o157o157：h7h7抗体（与胶体金颗粒相偶抗体（与胶体金颗粒相偶联）的试剂区。如果样品中存在抗原（即大肠杆菌联）的试剂区。如果样品中存在抗原（即大肠杆菌o157o157：h7h7），它将与胶），它将与胶体金标记的抗体结合。该抗原体金标记的抗体结合。该抗原- -抗体复合物渗过试剂区，经过含有大肠杆抗体复合物渗过试剂区，经过含有大肠杆菌菌o157o15

38、7：h7h7抗体（分布呈带状）的硝化纤维膜。该含金免疫复合物被捕获抗体（分布呈带状）的硝化纤维膜。该含金免疫复合物被捕获并聚集在这个区域，从而显示一条可见的线。剩余的样品继续迁移而进入并聚集在这个区域，从而显示一条可见的线。剩余的样品继续迁移而进入位于膜末端的废液贮存处。试剂区也含有针对广谱抗原的金复合物（指示位于膜末端的废液贮存处。试剂区也含有针对广谱抗原的金复合物（指示剂），无论大肠杆菌剂），无论大肠杆菌o157o157：h7h7存在与否，它都会被样品溶液释放。胶体金存在与否，它都会被样品溶液释放。胶体金复合物对照指示剂通过膜迁移到阴性对照捕获区（含针对广谱抗原的抗体复合物对照指示剂通过膜

39、迁移到阴性对照捕获区（含针对广谱抗原的抗体区），捕获并集结成一条可见线。无论大肠杆菌区），捕获并集结成一条可见线。无论大肠杆菌o157o157：h7h7抗原存在与否，抗原存在与否，都会在对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。都会在对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。2 2 肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌o157：h7 （胶体金方法胶体金方法）检测步骤检测步骤（1 1）培养基制备：将）培养基制备：将1 1瓶瓶reveal 8reveal 8小时培养基（或小时培养基（或reveal 8reveal 8小时改良培养小时改良培养基）加入到消毒的无菌袋内，加入基）加入到消毒的无菌袋内

40、，加入225ml 42225ml 42的无菌水，用力混匀，直到的无菌水，用力混匀，直到溶解。使用前培养基保持在溶解。使用前培养基保持在4242，但是不要超过，但是不要超过6 6个小时。最好是制备好个小时。最好是制备好立即使用。立即使用。（2 2）加样：取）加样：取25g25g样品到无菌袋内，使样品混匀，确保彻底混匀；样品到无菌袋内，使样品混匀，确保彻底混匀；（3 3）培养：松散地紧闭袋子）培养：松散地紧闭袋子424211培养培养8 8小时。小时。（4 4）混匀：）混匀：8 8小时培养后，从温箱中取出袋子，抓牢袋子离顶部小时培养后，从温箱中取出袋子，抓牢袋子离顶部2-32-3英寸英寸处，支撑底部

41、，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。（5 5）样品处理：使用无菌吸管，移取）样品处理：使用无菌吸管，移取5ml5ml样品到聚丙烯或玻璃试管内，加样品到聚丙烯或玻璃试管内，加热：如果使用聚丙烯试管，放置于水浴中热：如果使用聚丙烯试管，放置于水浴中2020分钟；使用玻璃试管，放置水分钟；使用玻璃试管，放置水浴中浴中1010分钟；或者将试管放置于微波炉中，沸腾即可。沸水中取出试管，分钟；或者将试管放置于微波炉中，沸腾即可。沸水中取出试管，放置到室温（放置到室温（15-3015-30），为了迅速冷却，可放置在冷的流水下，小心不），为了迅速冷却，可放置在冷的流水下，小心不要让水进入试管内。要让水进入试管内。（1 1）培养基制备：将）培养基制备：将