基因工程实验课件

1、基因工程实验1 基因工程大实验基因工程大实验e.coli 感受态细胞的制备、质粒感受态细胞的制备、质粒dna的转化、的转化、提取与酶切鉴定提取与酶切鉴定基因工程实验2 一、一、 实验目的和要求实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒受态细胞和质粒dna转化受体菌细胞的原理与技术；转化受体菌细胞的原理与技术；2、了解质粒、了解质粒dna的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒胞中分离、提取质粒dna的方法；的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳、掌握限制性内

2、切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、dna转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。用。基因工程实验3 二、实验原理二、实验原理 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源收外源dna的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转

3、化的受体菌细胞一般是限制方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统修饰系统（restriction-modification）缺陷的变异株，以防止对导入的）缺陷的变异株，以防止对导入的外源外源dna的切割，用符号的切割，用符号r-m-表示。其基本原理是：细菌处表示。其基本原理是：细菌处于于0的的cacl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒发生变化，转化混合物中的质粒dna形成抗形成抗dnase的羟基的羟基-钙钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经磷酸复合物黏附于细胞表面，经过过42短时间的热激处理，短时间的热激处理，基因工程

4、实验4 促进细胞吸收促进细胞吸收dna复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。子。 2、碱裂解法小量制备质粒、碱裂解法小量制备质粒dna：碱裂解法是基于线性大：碱裂解法是基于线性大分子染色体分子染色体dna与小分子环形质粒与小分子环形质粒dna的变性、复性的差异的变性、复性的差异达到分离目的的，在达到分离目的的，在ph12.012.6的碱性环境中，线型染色体的碱性环境中，线型染色体dna和环型质粒和环型质粒dna氢键会发生断裂，双链解开而变性，但氢

5、键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒质粒dna由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将其互补链不完全分离；当将ph值调节到中性并在高盐浓度下，值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体已分开的染色体dna互补链不能复性而交联形成不溶的网状互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体结构，通过离心，大部分染色体dna、不稳定的大分子、不稳定的大分子rna和蛋白和蛋白基因工程实验5 质质-sds复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒环状的质粒dn

6、a在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒质粒dna。 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链识别双链dna分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的dna水解酶，是体外剪水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。基因工程实验6 处的处的dna。类限制性内切酶在识别位点上切割，类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下

7、来。故然后从底物上解离下来。故类和类和限制酶在基因工程中基本限制酶在基因工程中基本不用，不用，ii类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如ecor i识识别与切割序列为别与切割序列为5gaattc3 3cttaag5 (2) 、识别的核苷酸数目大多数为、识别的核苷酸数目大多数为46个，少数识别个，少数识别813个；个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：产生的是具有凸出

8、的粘性末端：基因工程实验7 (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如为同裂酶或异源同工酶，如hpa ii与与msp i；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对dna切割后可切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如bamh i与与bgl ii。基因工程实验8 影响核酸限制性内切酶活性的因素：影响核酸限制性内切酶活性的因素： dnadna的纯度；的纯度； dnadna的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反应的温度；酶切消化反

9、应的温度； dnadna的分子结构；的分子结构； 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的缓冲液的 phph值。值。 4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子；而生理条件下，核酸分子的糖的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数

10、量的双链磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链dna几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，dna分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的象。分子量较小的dna分子，比分子量较大的分子，比分子量较大的dna分子，具有较紧密的构分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环dna分子或线分子或线性性dna分子要快。直接用低浓度的分子要快。直接用

11、低浓度的eb进行染色，可确定进行染色，可确定dna在胶中的位置。在胶中的位置。 基因工程实验9 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电泳dna迁移率的因素：迁移率的因素： dna的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； dna构象；构象； 电场强度；电场强度； 碱基组成与温度；碱基组成与温度； 嵌入染料的存在；嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。电泳缓冲液的组成。 三、实验材料与设备：三、实验材料与设备：1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式

12、冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5ml 与与0.5ml eppendorf 管、管、tip头头 、烧杯、量筒、烧杯、量筒基因工程实验10 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水吸水纸，一次性塑料手套等；纸，一次性塑料手套等； e.coli dh5受体菌受体菌(r-m-)， ptre2hyg质粒质粒(ampr) lb培养基培养基:蛋白胨蛋白胨 10g/l，酵母提取物，酵母

13、提取物 5g/l， nacl 10g/l，琼脂粉，琼脂粉 15g/l（固体培养基），用（固体培养基），用10 mol/l的的naoh调节调节ph为为7.0，高压灭菌；，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mgml； 含有抗菌素的含有抗菌素的lb平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的lb固体培养基固体培养基高压灭菌后，冷却到高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50gml浓度浓度50-100gml）；）；基因工程实验11 0.1mol/lcacl 0.1mol/lcacl2 2：称取：称取1.1g1.1g进口无

14、水进口无水caclcacl2 2，溶于，溶于70ml70ml双蒸双蒸水中，定容到水中，定容到100ml100ml，过滤后灭菌；，过滤后灭菌； 0.1mol/lcacl0.1mol/lcacl2 2 1515甘油：甘油：100ml 0.1mol/l cacl100ml 0.1mol/l cacl2 2 溶液内溶液内含有含有15ml15ml甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌； 溶液溶液i: 50mmol/li: 50mmol/l葡萄糖，葡萄糖，10mmol/l edta (ph8.0)10mmol/l edta (ph8.0)， 25mmol/l tris-hcl (ph8.0)25mmol/l tr

15、is-hcl (ph8.0)； 溶液溶液ii: 0.2mol/l naoh, 1%sds (ii: 0.2mol/l naoh, 1%sds (现配现用现配现用) )； 溶液溶液iii: iii: 乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3m, ph=4.8)( 60ml(3m, ph=4.8)( 60ml的的5mol/l kac, 5mol/l kac, 11.5ml 11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5ml h2o)28.5ml h2o)； rnase arnase a： 10mg/ml10mg/ml； tete缓冲液缓冲液: 10mmol/l: 10mmol/l，tris-hcl, 1mmol/ltri

16、s-hcl, 1mmol/l，edtaedta，ph ph 8.08.0； 基因工程实验12 5tbe缓冲液：缓冲液：0.45mol/l tris硼酸，硼酸，0.01 mol/l edta, ph 8.0； 10loading buffer：1% sds, 0.05%溴酚兰，溴酚兰，50的甘油；的甘油； 无水乙醇；无水乙醇； 7070乙醇；乙醇； 标准分子量片段；标准分子量片段； 核酸内切酶核酸内切酶 ecor i (takara)； ecor i酶解缓冲液酶解缓冲液(10 buffer h)； 琼脂糖；琼脂糖； 溴化乙啶（溴化乙啶（eb）染色液）染色液(10mg/ml)。基因工程实验13 四

17、、操作步骤四、操作步骤: (一一) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1、从新活化的、从新活化的e.coli dh5平板上挑取一单菌落，接种于平板上挑取一单菌落，接种于35ml lb液体培养中，液体培养中，37振荡培养至对数生长期振荡培养至对数生长期(12h左左右右)； 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:50转接于转接于100ml lb液体培养液体培养基中，基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次测一次od600，至，至od600为为0.30.5时停止培养，时停止培养，并转装到并转装到1.5 ml离心管中；

18、离心管中； 3、培养物于冰上放置、培养物于冰上放置20min； 4、 04，4000g离心离心10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入1 ml冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞, 冰浴冰浴20分钟；分钟；基因工程实验14 cacl2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离心离心10min，倒净上清培养液，再用，倒净上清培养液，再用1.0 ml冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液溶液轻轻悬浮轻轻悬浮细胞，冰浴细胞，冰

19、浴20min； 6、 04， 4000g离心离心10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入100 l冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液，溶液，小心悬浮细胞小心悬浮细胞，冰上放置，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在如果在4放置放置1224h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高46倍倍；也可加入占；也可加入占总体积总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心离心管中，置于管中，置于-70条件下，可保存

20、半年至一年条件下，可保存半年至一年。基因工程实验15 （二）质粒（二）质粒dna的转化：的转化： 1、每、每100l感受态细胞悬液中加入感受态细胞悬液中加入1l质粒质粒dna,轻轻摇匀，轻轻摇匀，同时设置三组对照：同时设置三组对照：(1)不加质粒，不加质粒，(2)不加受体菌，不加受体菌， (3)加已加已知具有转化活性的质粒知具有转化活性的质粒dna，具体操作按下表进行：具体操作按下表进行：*阳性对照，用已知具有转化活性的ptre2hyg质粒dna进行转化 编号编号组组 别别质粒质粒dna/lte buf / l0.1mol/l cacl2 / l受体菌受体菌/ l1受体菌对照受体菌对照1100

21、2质粒对照质粒对照1（ g）1003转化组转化组i1（ g）1004转化组转化组ii *1（ g）100基因工程实验16 2、冰上放置、冰上放置2030min，然后，然后42水浴热激水浴热激90120 sec，迅速冰上冷却迅速冰上冷却2min； 3、 立即向上述立即向上述ep管中加入管中加入0.8ml lb液体培养基，摇匀液体培养基，摇匀后于后于37振荡培养约振荡培养约1530min ，使受体菌恢复正常生长状，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因；态及表达抗性基因； 4、取培养液、取培养液50l接种于含抗菌素的接种于含抗菌素的lb平板培养基上，平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；用玻璃涂棒涂匀；

22、5、将培养皿放在、将培养皿放在37恒温培养箱培养恒温培养箱培养30 min,待菌液完待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养恒温培养箱内培养过夜过夜(14-16h) ；（三）碱裂解法小量制备质粒（三）碱裂解法小量制备质粒dna:基因工程实验17 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37震荡培养震荡培养1216小时；小时； 2、将、将1.5ml菌液加入菌液加入ep离心管中，离心管中，12000 g离心离心30 sec，弃上清液，弃上清液，在吸水纸上扣干；在吸水纸上

23、扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮。离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮。 3、加入、加入100 l预冷的溶液预冷的溶液i ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；量使细胞分散； 溶液溶液i中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，减少提取过程中的机械中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体剪切力，防止染色体dna 的断裂；的断裂；edta的作用是与二价离子（的作用是与二价离子（ca2）结合，降低结合，降低dnase对对dna的降解。的降解。 4、加入、加入200 l新配制的溶液新配制的溶液ii, 盖紧

24、管口盖紧管口,快速颠倒离心管快速颠倒离心管,以混匀内容以混匀内容物物,冰上放置冰上放置35min; 溶液溶液ii中的中的naoh与与sds可裂解细胞，使可裂解细胞，使dna变性以及变性以及sds使蛋白变性使蛋白变性并形成交联的网状结构。并形成交联的网状结构。基因工程实验18 5、加入、加入150 l溶液溶液iii, 加盖后颠倒加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置23min； 溶液溶液iii为低为低ph的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和naoh，以便使部，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体dna不能正确复性。不能正确复性。 6、1200

25、0 g离心离心6 min，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的ep管中；管中； 7、加、加2倍上清体积倍上清体积(约约1ml)的无水乙醇的无水乙醇, 振荡混匀，室温振荡混匀，室温放置放置2min. 8、 12000g离心离心10min，弃上清液，再用，弃上清液，再用70的乙醇洗的乙醇洗涤一次，涤一次， 12000g离心离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入、加入40 l含含20 g/ml rnase a的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或te 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解缓冲液溶解提取

26、物，室温放置直到质粒完全溶解(约约8min)，存于存于20或直接用于酶切。或直接用于酶切。基因工程实验19 基因工程实验20 (四四)提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1、在、在0.5ml ep管中依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于0.5ml离心管中离心管中 提取质粒提取质粒dna 3.0 l 10 buffer h 1.0 l ecor i 2.0 u dd h2o 5.8 l 10 l 1u: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在20 l 反反应液中反应应液中反应1h，使，使1 g dna完全消

27、化所需的酶量完全消化所需的酶量. 2、 轻轻混匀轻轻混匀, 4000g离心离心10秒秒 ，置于，置于37水浴中酶解水浴中酶解1.5h。 3、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入1.2 l 10上样缓冲液上样缓冲液(或或2 l 6上样缓冲上样缓冲液液), 混匀混匀. 4、称取、称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml 0.5tbe或或1tae缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。琼脂糖溶解。基因工程实验21 5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60左右的琼脂糖凝胶液左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴加入一小滴eb，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板，