生物物理技术-2

1、1Infrared spectroscopy and Raman spectroscopy2bond distanceVibrationR0R1R2nmEnergyintrinsic property3AB =2 1k -1 = MA-1 + MB-1 :与化合物与化合物组成组成和和结构结构有关有关ABR0R1R2键长Stretching vibration :折合折合质质量量k :化学化学键键的的键键力常数力常数401E=(n+ )hn+ )h n=0,1,2,3, n=0,1,2,3, 21能量能量量子化量子化 能能级级2振振 动动 激发激发态态 =21k5Spectroscopyreso

2、nance6偶极子在光波电场矢量中的运动偶极子在光波电场矢量中的运动dipole电场电场时间时间+7分子振动与吸收分子振动与吸收Single bond: k = 4 -6Ncm-1 Double bond: k = 8-12Ncm-1 Triple bond: k = 12-18Ncm-1 C-C, 1190cm-1C=C, 1683cm-1 CC, 2060cm-1 89IR units: wavenumbers (cm-1)10 micron wavelength 1000 cm-11 eV 8100 cm-1 1 THz 33 cm-1300 Kelvin 210 cm-1The Inf

3、rared Part of the EM SpectrumNear-IR: 4000 14000 cm-1Mid-IR: 500 4000 cm-1 Far-IR: 5 500 cm-1 IR covers 1 meV to 1 eV10The Science Museum, UKAround 1800, Herschel studied the spectrum of sunlight using a prism. He measured the temperature of each color, and found the highest temperature was just bey

4、ond the red, what we now call the infrared. 11分子振动与红外吸收分子振动与红外吸收Single bond: k = 4 -6Ncm-1 C-C, 1190cm-1300000 300000 25002500nmnm30 30 4000cm 4000cm-1-1红外共振吸收红外共振吸收12分子的能级分子的能级Energy Levels与跃迁与跃迁TransitiongroundstateexcitedstateInfrared01v0v1UV-absorption213多原子分子多原子分子14对对称伸称伸缩缩3652cm-1反反对对称伸称伸缩缩375

5、6cm-1弯曲弯曲,1595cm-1水的红外光谱水的红外光谱15多原子分子的运动及其多原子分子的运动及其自由度自由度OOHHOHHHOHOHHHOH整个分子重心的平动整个分子重心的平动 (3 (3 freedom)freedom)整个分子绕其重心的转动整个分子绕其重心的转动 (3 (3 freedom)freedom)每个原子相对于其它原子的运动（振动）每个原子相对于其它原子的运动（振动）一个点一个点: 3: 3自由度自由度NN个点个点: 3: 3NN自由度自由度 (linear molecule)xyz分子分子: N个原子个原子空间的空间的运动运动：3N freedom16symmetric

6、alasymmetricalscissoringrockingwaggingtwistingstretchingbending多原子分多原子分子的子的振动振动17振振动动自由度自由度 3N-6?18An Example: CO2Symmetric StretchCOOAsymmetric StretchBending ModeIR AbsorbanceWavenumber (cm-1)13883N-5=42349667?19An Example: CO2Symmetric StretchCOOAsymmetric StretchBending ModeIR AbsorbanceWavenumb

7、er (cm-1 Dipole Moment = charge imbalance in the molecule(Has dipole moment so IR active)(Has dipole moment so IR active)(Dipole moment = 0 so not IR active)138820dipole电场电场时间时间偶极矩为零的振动偶极矩为零的振动没有红外吸收没有红外吸收21C=O224000 4000 cmcm-1-1 1300 1300 cmcm-1-1 1.1.最有分析价值的基团频率最有分析价值的基团频率, ,这一区这一区域称

8、为基团频率区、官能团区或特征域称为基团频率区、官能团区或特征区区。 2.2.区内的峰是由区内的峰是由伸缩振动伸缩振动产生的吸收产生的吸收带，比较稀疏，容易辨认，常用于鉴带，比较稀疏，容易辨认，常用于鉴定官能团。定官能团。 23指纹区指纹区1800 1800 cmcm-1-1 （1300 1300 cmcm-1-1 ） 600 600 cmcm-1-1在此区域内，除在此区域内，除单键的伸缩振动单键的伸缩振动外，还有外，还有因因变形振动变形振动产生的谱带。这种振动与整个产生的谱带。这种振动与整个分子的结构有关。当分子结构稍有不同时，分子的结构有关。当分子结构稍有不同时，该区的吸收就有细微的差异，并

9、显示出分该区的吸收就有细微的差异，并显示出分子特征。这种情况就像人的指纹一样，因子特征。这种情况就像人的指纹一样，因此称为此称为指纹区指纹区。指纹区对于指认结构类似。指纹区对于指认结构类似的化合物很有帮助，而且可以作为化合物的化合物很有帮助，而且可以作为化合物存在某种基团的旁证。存在某种基团的旁证。24影响基团频率的因素影响基团频率的因素 电子效应电子效应 氢键氢键 振动耦合振动耦合 费米共振费米共振25红外红外光谱仪光谱仪26双光束光谱仪双光束光谱仪检测池检测池: : NaCl, KBr, NaCl, KBr, CaFCaF2 2, , LiFLiF生物样品一般选用不溶于水的后二种盐池生物样

10、品一般选用不溶于水的后二种盐池水的红外水的红外“窗口窗口”: 结合重水结合重水D2O解决解决27单色器单色器优优缺点缺点棱镜棱镜岩盐镜易吸潮岩盐镜易吸潮,分辨率低分辨率低光栅光栅扫描速度慢扫描速度慢Michelson(迈克尔逊迈克尔逊)分辨率高分辨率高,扫描速度快扫描速度快,Fourier变换变换28Fourier Transform Infrared spectrometer优势优势: : 可在短时间内得到频可在短时间内得到频率范围内的干涉图率范围内的干涉图, ,通通过多次扫描提高信噪过多次扫描提高信噪比比. . S/N n S/N n-2-2 Resolution: 0.1cmResolu

11、tion: 0.1cm-1-12. 2. 附加功能：平滑、差附加功能：平滑、差谱、二阶导、去卷积谱、二阶导、去卷积和曲线拟合等和曲线拟合等. .检测器检测器29A Fourier Transform!30Sample preparation for IR1. Solution: solvent, cell, concentration2. Solid: KBr,石蜡石蜡3. Gas:弯曲弯曲,1595cm-131结构因素结构因素结构的对称性越高结构的对称性越高,吸收越弱吸收越弱环境因素环境因素氢键氢键 =21k32 吸收带的位置吸收带的位置( ( max , cm-1) :红外光谱是红外吸红外

12、光谱是红外吸收随入射光波数变化的曲线收随入射光波数变化的曲线. . 谱峰强度谱峰强度: : 由于消光系数对环境敏感，特征基由于消光系数对环境敏感，特征基团在不同分子中波动很大，因此红外的团在不同分子中波动很大，因此红外的谱峰强谱峰强度度只用强只用强strongstrong、中中mesomeso、弱、弱weakweak表示。表示。33Application34H2Oprotein紫外紫外吸收谱吸收谱红外光谱红外光谱35Cefradine 头孢拉定36Melamine3738吸收带cm-1振动模式指认酰胺A3300N-H伸缩振动酰胺B3100酰胺的一次泛频，费米共振酰胺1660C=O伸缩振动酰胺1

13、570N-H面内弯曲振动和C-N伸缩振动酰胺1300C-N伸缩振动和N-H面内弯曲振动酰胺630O=C-N面内弯曲振动酰胺730N-H面外弯曲振动酰胺600C=O面外弯曲振动酰胺酰胺带带80%来自于来自于C=O基的弱基的弱伸缩振动和伸缩振动和C=O旁的旁的C-N伸缩振动伸缩振动以及以及N-H平平面内弯曲振面内弯曲振动的偶合动的偶合 39cmcm-1-1对应二级结构对应二级结构162416244 4伸展肽链伸展肽链163116313 3伸展肽链伸展肽链163716373 3伸展肽链伸展肽链164516454 4无规卷曲无规卷曲165316534 4螺螺 旋旋166316634 4转转 角角167

14、116713 3转转 角角167516755 5伸展肽链伸展肽链168316832 2转转 角角168916892 2转转 角角169416942 2转转 角角40Conformational transition: from alpha-helix rich to beta-sheet richPrPc朊蛋白朊蛋白 PrPsc朊病毒（朊病毒（致病因子）致病因子） 41IR Image IR Image 42 Lipids (cell walls) Nucleic acids (DNA, RNA) Proteins Each of these major classes of cellular

15、 components have distinct IR markersInfrared spectra are obtained from individual living cells.Infrared Spectromicroscopy of Individual Living Cells43脑功能成像脑功能成像44Raman spectroscopy45hh = Rayleigh scattering Prof. C.V. Raman Raman scattering1930年诺贝尔奖46拉曼散射效应的进展：拉曼散射效应的进展：拉曼散射效应是印度物理学家拉曼（C.V.Raman）于19

16、28年首次发现的，本人也因此荣获1930年的诺贝尔物理学奖。 19281940年，受到广泛的重视，曾是研究分子结构的主要手段。这是因为可见光分光技术和照相感光技术已经发展起来的缘故；19401960年，拉曼光谱的地位一落千丈。主要是因为拉曼效应太弱（约为入射光强的10-6），并要求被测样品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等等。所以到40年代中期，红外技术的进步和商品化更使拉曼光谱的应用一度衰落；1960年以后，激光技术的发展使拉曼技术得以复兴。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等优点，成为拉曼光谱的理想光源。随探测技术的改进和对被测样品要求的降低，目前在物理、化学、医药、工业等各个领域拉

17、曼光谱得到了广泛的应用，越来越受研究者的重视。47瑞利瑞利散射散射电子能电子能级基态级基态电子能电子能级激发级激发态态反反StokesStokes线线虚能态虚能态StokesStokes线线IRVirtual state481) 在示意图中斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布于瑞利线的两侧，这是由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。2) 反斯托克斯线的强度远小于斯托克斯线的强度，这是由于Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。高频高频低频低频49505152拉曼光谱参量拉曼光谱参量 峰位峰位: :是电子能级基态的振动态性质的一种反映。以入射光和散射光波数差表示。 峰位的移动与激发光的频率无关，反映的是分子振动能级的性质。2. 2. 强度强度: : 与浓度成正比53541.对同一物质而言二光谱常常相当近似。2.拉曼光谱一个很重要优点:水不水不会会干干扰扰其其测量测量，更适 合于测试生物样品。3.玻璃和石英容槽皆可使用，