最新ZTT动物细胞工程22PPT文档

1、思考与回忆： 1 1、动物细胞全能性特点？、动物细胞全能性特点？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。能变窄。细胞核仍具有全能性。 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？成动物个体？ 不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长

2、时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。的细胞培养。 3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？、动物的细胞培养的理论依据（原理）？ 细胞增殖细胞增殖动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础本节内容：本节内容：一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念：1 1、概念：、概念：动物细动物细胞培养就是从动物胞培养就是从动物有机体中取出相关有机体中取出相关的的组织组织, ,将它分散将它分

3、散成成单个细胞单个细胞, ,然后然后, ,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中, ,让这些让这些细胞生细胞生长和增殖长和增殖. .2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖定义：定义：人们通常将人们通常将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长贴壁生长长成单层细长成单层细胞。有胞。有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3：过程：过程图示图示原代培养原代培养强调一：细胞贴壁过程强调一：细

4、胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于帖附。于帖附。当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时, ,细胞就会停止分裂增细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细胞的胞的接触抑制接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制 定义：定义： 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后, , 用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理, ,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离

5、下下来来, ,然后加入新的培养液然后加入新的培养液, ,将细胞分离稀释将细胞分离稀释, ,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内, ,这这个过程称个过程称传代培养传代培养. .（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养归纳归纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制 培养培养 40-50 40-50代细胞代细胞 培养培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加加 液液遗传物质遗传物质 改变改变遗传物质遗传物质 改变改变动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物胰蛋白胰蛋白培养培养原代原代传

6、代传代未未已已原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件: :1）无菌、无）无菌、无毒的环境：毒的环境： 适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：ph：7.2-7.4液体合成培养基：（液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）因子、（水、无机盐、微量元素）等；通等；通常还需加入常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4）气体环境：）气体环境：2）营养：）营养：3）温度和）温度和ph：“95“

7、95空气空气+5+5coco2 2” ”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的； coco2 2维持培养维持培养液的液的phph。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞

8、培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适ph值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜，胰蛋白酶作用的适宜ph为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜ph为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在ph为为7.2-7.4

9、的动物细胞的动物细胞培养中无活性。培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质( (胶原蛋白等胶原蛋白等) )。问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？组培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培

10、养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在1010代代以内，为什么？以内，为什么？1010代以内的细胞遗传物

11、质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: :1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培

12、养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、 培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物动物血清血清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义： 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核, ,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中. .使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎

13、, ,这这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体. .3、分类：分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理： 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖1.）克隆羊多）克隆羊多利培育过程：利培育过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重

14、组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利特别注意：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如线粒体线粒体dna）来自于受体卵）来自于受体卵母细胞母细胞.二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。供体供体受体受体代孕代孕受体受体黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面

15、绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、写出、写出ab所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 2、实施细胞工程时，所需、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞受体细胞大多采用卵母细胞的原因：的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为

16、、若黑面绵羊的基因型为aa,aa,白白面绵羊的基因型为面绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊的基因型为的基因型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞. .为什么？为什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（m中中期期）为什）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激胚胎移植至胚胎移植至代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2.）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：

17、优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养） 1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件。质和营养条件。有人说它三个母有人说它三个母亲，对吗？亲，对吗？核移植流程核移植流程:1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减 数分裂进程。数分裂进程。6、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建 重组胚胎。重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核

18、卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛。4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题看书看书p49-50p49-50页页 1、单个细胞；生长；增殖、单个细胞；生长；增殖 2、制成细胞悬液；转入培养液；原代培养；传代培养、制成细胞悬液；转入培养液；原代培养；传代培养 3、(1)无菌无菌 (2)糖；氨基酸；促生长因

19、子；血清糖；氨基酸；促生长因子；血清 (3)36.5；7.27.4 (4)o2；co2 4、病毒；单克隆抗体、病毒；单克隆抗体 、1、细胞核；卵细胞、细胞核；卵细胞 2、(1)胚胎细胞核胚胎细胞核 (2)体细胞核体细胞核 3、(1)体细胞体细胞 (2)卵母细胞；减数第二次分裂中期卵母细胞；减数第二次分裂中期 (3)去核卵母细去核卵母细胞；融合；重组胚胎胞；融合；重组胚胎 (4)移植移植 4、(1)遗传改良遗传改良 (2)濒危濒危 (3)医用蛋白医用蛋白 (4)供体供体 (5)组织器官组织器官 15 cdabc 6、全部基因（全部遗传物质）；受精卵全部基因（全部遗传物质）；受精卵 细胞细胞分裂分

20、裂 分化分化 已分化的动物细胞核已分化的动物细胞核 核移植核移植 1 1、定义：、定义：指用自然或人工方指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细不同基因型的细胞之间的融合就是胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动物动物

21、细胞细胞融合融合2、诱导融合的因素诱导融合的因素 生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.(.(利用灭活仙台病毒是动物细利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。胞融合所特有的。 这是由于病毒这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。功能。) ) 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇pegpeg诱导融诱导融合合. . 物理法：物理法：电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒

22、颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞3 3、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。 人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是? ?将抗原注

23、入动物体将抗原注入动物体, ,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。能产生严重的过敏反应。 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 能否用单个能否用单个b b淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？产生单一类型的抗体呢？b b淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗

24、体的制备单克隆抗体的制备思思考考单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的b b淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦米尔斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科勒和科勒( (德国

25、德国) )因此在因此在19841984年获诺年获诺贝尔奖。贝尔奖。提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基v动物特异性免疫动物特异性免疫v分离分离b淋巴细胞（淋巴细胞（b）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（g）。注意）。注意b淋巴细淋巴细胞是一个系列。（胞是一个系列。（b1,b2,b3,-bn）v细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（bb;bg;gg）v第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有bg杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但bg杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如b1g,b2g-b

26、ng。而。而bb,gg在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）v第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤细胞。v选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。v提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：4 4

27、）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与b b细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质

28、，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有b b细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体 1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等, ,与常规抗体相比与常规抗体相比, ,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点. 2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。 生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+ +放射性同位素放射性同位素+ +化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）胞位置，原位杀死癌细胞。） 特异性强，灵