微囊藻毒素对孵化7天9天与11天鸭胚肝脏毒性影响

1、微囊藻毒素对孵化7天、9天和11天鸭胚肝脏的毒性影响摘要：蓝藻类是被认为生物进化过程中最早进入陆地的生物，并在自然界中广泛分布。近年来， 由于工业及生活的污染日趋严重，致使水体富营养化加剧，蓝藻大量繁殖。这不仅破坏的原有的生 态平衡，而且其所产生的微囊藻毒素(Microcysti n, MC)对动物及人类的健康构成了一定的威胁,因此也越来越受到人们的关注。本研究以樱桃谷鸭胚为材料，通过石蜡组织切片技术观察樱桃谷鸭 胚肝脏的组织变化，研究微囊藻毒素对樱桃谷鸭胚肝脏的影响。研究表明，微囊藻毒素对鸭胚的肝 脏造成了明显的损害。关键词：微囊藻毒素，鸭胚，肝脏Toxic Effects of Micro

2、cystins on 7 Day 9 Day and 11 DayDuck Liver08092206HAN Xia ng-Ru(School of Life Scienee , Huzhou Teachers College, Huzhou 313000 )Abstract: Cyanobacteria class is considered to be the first to enter the process of biological evoluti on of orga ni sms on land, and widely distributed in n ature .In re

3、ce nt years, in dustrial and domestic polluti on worse ning result in in creased eutrophicati on and algae blooms. This is not only destroy the ecological balanee of the original, but the microcystin (Microcystin, MC) it produced which also is a threatean to animal and human. So it gains more and mo

4、re attention in public. This study used Cherry Valley duck embryos via the tech no logy of paraffi n tissue to observe cha nges in it' liver tissue, and to study the effects of microcysti n on Cherry Valley duck embryo liver. This results showed that microcyst in caused sig ni fica nt damage on

5、duck embryo liver.Key words: microcyst ins, duck, liver1引言 12材料与方法 12.1实验材料 12.1.1藻种2.1.2 ELISA 试剂盒2.1.3种鸭蛋2.1.4化学药品和试剂2.1.5主要仪器和设备2.1.6其他实验用具2.1.7酶标仪设置2.1.8主要试剂的配制2.1.9载玻片的预处理2.2实验方法及步骤 32.2.1蓝藻毒素的提取2.2.2微囊藻毒素的ELISA检测2.2.3樱桃谷蛋的处理2.2.4鸭胚微囊藻毒素的处理2.2.5石蜡组织切片的制备 2.2.6显微观察、采图2.2.7数据处理3结果 103.1微囊藻毒素的检测结果

6、 103.2鸭胚的藻毒素处理结果 113.2.1樱桃谷种鸭蛋的平均重量322鸭胚的死亡情况323鸭胚胎发育过程与解剖特征3.3 MC肝组织切片观察结果 133.3.1 MC对肝脏的形态影响3.3.2 MC处理的肝脏组织观察4讨论 155总结与展望 16参考文献 16致谢 181.引言随着工农业的迅速发展，大量富含氮、磷等营养元素的工农业废水排入水体中，引起水体富营养化日趋严重，导致藻类特别是蓝藻的异常繁殖生长，从而出现蓝藻的水华现象。目前，蓝藻水华发生的频率和严重程度都呈现迅猛的增长趋势，发生地则遍布全球各地1-3。蓝藻水华的主要危害是有毒蓝藻细胞破裂后能释放多种不同类型的藻毒素，其中最为常见

7、的是微囊藻毒素（Microcystin.MC）。MC是一类具有生物活性的七肽单环毒素，主要由铜绿微囊藻（ Microcystis aeruginosa）、鱼 腥藻（Anabaena）和颤藻（Oscillatoria ）等产生。目前，已发现的 MC有80多种，以 MC-LR、 RR和YR最为常见（L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸） ，其中以MC-LR含量较高、毒 性最大。MC是一种具有自我强化机制作用的生态生长调节素，高浓度的MC不仅可以影响水生植物种群的多样性6，而且可以导致鱼卵变形、蚤类死亡、鱼类行为和生长异常及死亡。近年来，世界各 地由于蓝藻水华而引起鱼类、家畜和野生动物死亡的报道

8、屡见不鲜，甚至有因医用透析用水中存在MC而导致透析病人死亡的案例8。经进一步研究发现，肝脏是MC主要的靶器官，由于MC具有较强的肝毒性，并对心、肾及胃肠也有一定的毒性9，其对动物和人类均有一定的毒害作用，且动物和人类若直接接触或饮用含 MC的水，可引起中毒。动物的中毒症状主要有肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻、昏迷，中毒严重者在数小时至数天死亡；人类接触到含MC水后，会引起皮肤及眼睛过敏、发热、疲劳、急性肠胃炎，长期接触则会诱发皮肤癌、肝炎及肝癌，甚至导致死亡10。本课题在实验室条件下，以樱桃谷鸭胚为研究对象，孵化至第3天，在其卵黄部位注入 MC,然后立即用石蜡封口，继续孵化。孵化至 7天、9天和11

9、天，取其肝脏组织，进行 HE染色和组织 石蜡切片，观察对比实验组与对照组组织的情况，研究MC对肝脏组织的毒性影响。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1藻种（订购于中国科学院水生生物研究所）（订购于中国科学院水生生物研究所）（Beacon公司生产）（购于湖州塘甸建华种禽厂）1、 FACHB-910Microcystis aeruginosa2、 FACHB-911Microcystis aeruginosa2.1.2 ELISA 试齐U盒微囊藻毒素检测试剂盒2.1.3种鸭蛋樱桃谷种鸭蛋2.1.4化学药品和试剂化学药品和试剂见表2- 1所列:表2-1主要的化学药品和试剂名称纯度来源乙酸分析纯上海

10、申汕化工有限公司甲醇分析纯上海试剂总厂丙酮分析纯浙江杭州萧山化学试剂厂甲醛分析纯浙江三鹰化学试剂有限公司二甲苯分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠试剂国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠试剂国药集团化学试剂有限公司冰醋酸分析纯浙江三鹰化学试剂有限公司无水乙醇分析纯杭州萧山化学试剂厂95%乙醇分析纯杭州萧山化学试剂厂APES试剂福州迈新生物技术开发有限公司中性树脂试剂国药集团化学试剂有限公司苏木色精试剂北京拜尔迪生物公司伊红Y （水溶性）材料国药集团化学试剂有限公司石蜡（熔点是 60-62 C）试剂上海经济区如皋市红旗玻璃厂2.1.5主要仪器和设备主要的仪器和设备见表2-2所列:表2-2主要仪

11、器设备名称型号制造商或产地生物体视显微镜S27日本OLYMPUS公司海信BCD 206H冰箱海信集团有限公司JY96- n超声波细胞粉碎机宁波新芝生物股份有限公司伯乐680型酶标仪BIO-RAD 公司电子天平梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司himac CR21G立式大容量高速速离心机日立公司Grumbach孵化器南京皓海仪器仪表有限公司生物组织切片机 RM 2235德国LEICA公司电热鼓风干燥箱 101A-2上海浦东荣丰科学仪器有限公司超级恒温水槽 DKB-501A上海森信实验仪器有限公司普通显微镜 MOTIC B series厦门麦克奥迪光学仪器有限公司生物相差显微镜 MOTIC BA

12、400厦门麦克奥迪光学仪器有限公司2.1.6其他实验用具眼科镊子，解剖刀，解剖针，解剖剪，温度计，EP管，移液枪，铅笔，培养皿，切片盒，染色缸,染色架，吸水纸，标签纸，蜡杯，蜡铲，酒精灯,吸水纸，切片刀，毛笔，磨砂载玻片，展片台,盖玻片，树胶，滴官，各种量程的烧杯、量筒及容量瓶，脸盆，1000mL烧杯，500mL的烧杯，1000mL容量瓶，500mL容量瓶，100mL量筒，50mL量筒，5mL移液管，1mL移液管，锥形瓶，蒸馏水瓶，培养瓶，胶头滴管，试管，一次性注射器。2.1.7酶标仪设置“00000后, 接上电源，打开机器后面的开关，机器开启自检后，根据仪器上的提示输入密码 按输入键即可进入

13、机器的操作界面。 在电脑屏幕上打开酶标仪软件，如果试验的程序已编好，则可直接调出在储存的程序 直接读板。如试验的程序需重新编辑，则选择添加新检测项目进行新程序的设置。由于是定量实验选择定量后，根据试剂盒所配进行标准品浓度设置。 选择单波长，450 nm。读数的方式为步进。存为模板 排板：手工排板，按照检测中个样品的排列方式准确设置各孔，并设置一个空白孔。 检测品放入酶标仪，按读板，即可检测。2.1.8主要试剂的配制 新洁尔灭溶液配制：按水与苯扎溴铵体积比100:1混合配的，现配现用。4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液的配制：称取磷酸氢二钠16.4g，磷酸二氢钠4.0g，各自溶解后混合在一

14、起，加入甲醛（40%） 100mL ,加蒸馏水定容至1000mL，倒入染色缸中室温保存。 乙醇-甲醛（酒精-福尔马林，AF ）固定液的配制：量取甲醛（40%） 100mL和95%乙醇900mL，倒入染色缸中室温保存。苏木精液的配制：称取苏木精2g,硫酸铝钾17g,碘酸钠0.2g，量取无水乙醇250mL ,蒸馏水750mL ,冰醋酸20mL。 先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后将该两液混合，加入碘酸钠待溶液变成紫 红色时，再加入冰醋酸，混匀倒入染色缸中室温保存。0.25% -0.5%伊红Y水溶性的配制：称取伊红Y0.5g，加蒸馏水100mL，加冰醋酸1滴，混匀倒入染色缸中室温保存

15、。70%酒精配制：先将浓度为100%的酒精注入量筒，取70mL ,然后加入蒸馏水至100mL o80%酒精配制：先将浓度为100%的酒精注入量筒，取80mL ,然后加入蒸馏水至100mL o90%酒精配制：先将浓度为100%的酒精注入量筒，取90mL,然后加入蒸馏水至100mL o2.1.9载玻片的预处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多，容易 出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用较好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制 备：APES现用现配，将干净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 APES中，停留20 -30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮

16、溶液或蒸馏水中洗去未结合的APES，置通风橱中晾干即可，处理后的玻片可保存半年以上，但要注意污染。2.2实验方法及步骤2.2.1蓝藻毒素的提取取新鲜藻样用冷冻超速离心机离心4 C, 10000 g离心10 min，得藻浆。取911和910 （1： 1） 的混合藻浆30 g放入烧杯中，加入 500mL体积分数为5%的乙酸溶液，超声波破碎 30 min , 4 C、 10000 g离心10 min，取得上清1;残渣用体积分数 80%的甲醇搅拌30 min，同样条件离心10min , 得上清2;残渣用体积分数80%的甲醇同样条件抽提 30 min ,得上清3;合并上清液1、2、3, 70 C, 蒸发

17、近干，用1mL生理盐水溶解。4 C冷冻保存待用。2.2.2微囊藻毒素的ELISA检测Beaco n微囊藻毒素检测试剂盒适用于水中微囊藻毒素的定量检测。检测原理Beaco n微囊藻毒素检测试剂盒由可以和微囊藻毒素及微囊藻毒素酶标记物结合的多克隆抗体 制成。样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素酶标记物竞争结合数量有限的抗体结点。检测过程中，先 加入微囊藻毒素酶标记物及含有微囊藻毒素的样品到测试孔中接着加入抗体，酶标记物与样品中的 微囊藻毒素竞争结合同样的抗体的结合点。测试孔中包被有抗兔IgG,用于捕获加入的兔抗微囊藻毒素抗体。孵育30min后洗掉小孔中所有没有结合的分子。每孔中加入干净的底物溶液，连接的

18、酶结合物可以将底物转化成蓝色化合物，一个酶分子可以转化多个底物分子。由于各个孔中抗体可结合位点是相同的，并且加入的微囊藻毒素酶标记物的量也是相同的，样 品中微囊藻毒素含量低的则酶标记物结合得多，颜色会显深蓝色。反之，样品中微囊藻毒素含量高 的则酶标记物结合得少，颜色会显浅蓝色。注意：颜色与微囊藻毒素的含量成反比。较深的颜色=较低的浓度；较浅的颜色 =较高的浓度特异性Beacon微囊藻毒素检测试剂盒没有区分微囊藻毒素-LR （作为标准品）及其他类型，然而可以测到微囊藻毒素的其它类型，以下表格中展示的相关值及交叉反应率（%CR）,以下所有浓度均为ppb级。见表2-3表2-3种类%CR微囊藻毒素-L

19、R100微囊藻毒素-RR87微囊藻毒素-YR48Nodularin31试剂盒组成 包被有羊抗兔抗体的的微孔板（12 >8条） 阴性对照品一瓶（0ppb微囊藻毒素-LR） 0.1 ppb, 0.3 ppb, 0.8 ppb, 2 ppb微囊藻毒素-LR标准品各一瓶 1.0ppb微囊藻毒素-LR质量控制液一瓶 微囊藻毒素HRP酶标记物一瓶 兔抗微囊藻毒素抗体溶液一瓶 底物一瓶 停止液一瓶（注意：1N盐酸，小心处理） 100 X清洗液需要设备酶标仪，薄膜，计时器或表，蒸馏水或去离子水，振荡器检测程序1. 将所有试剂及样品置于室温下。2. 从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子

20、以免微孔条受潮。3. 稀释100倍浓缩清洗液为1倍清洗液，例：取5 mL100倍清洗液到500mL洗瓶中并加入495 ml 蒸馏水。4. 稀释MCs，用生理盐稀释 M（溶液，稀释20000万倍。5. 吸取50山酶标记物到微孔板的每个孔中。6. 吸取50山标准，阴性对照，样品到对应微孔中，各孔依次为阴性对照、0.1 ng/mL标准品、0.3 g/mL标准品、0.8 ng/mL标准品、1.0 ng/mL标准品、2.0 ng/mL标准品和稀释20000万样品。7. 加入50山抗体溶液到每个小孔中。8. 快速震荡使孔中的溶液混合，并敷上薄膜，或者微孔板可以放在振荡器上震荡孵育，从而达 到在孵育期间持续

21、震荡的效果。9. 孵育 30min。10. 孵育完后，去掉封口膜将微孔中的溶液倒入水槽中，用1倍清洗液清洗完全充满微孔，震荡后倒掉，重复四次，总共五次洗板。在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干。11. 每个微孔中加入100山 底物溶液。12. 盖上小孔并孵育30 min。13. 按照加底物的顺序每孔中加入100山停止液。停止液为1 N盐酸，需小心操作。14. 450 nm下读板，如果酶标仪有双波长，可同时测605或650 nm双波长。15. 如果酶标仪可以处理数据，可用曲线拟合，有曲线计算出样品中的MC浓度，没有此功能则可用手动计算，计算方法如下： 读板之后，求标准，阴性对照，样品的平均吸光度值并按

22、以下方法计算% B0 :% B0=标准，阴性对照，样品吸光度值的平均值/阴性对照的平均吸光值 以% B。为Y轴，以微囊藻毒素标准浓度的半对数值为X轴，绘制曲线。 通过每个样品的% B。，在图上计算出微囊藻毒素的浓度。 如果样品% B。在设定的标准% B。范围之内，就可以得出一个具体的浓度值。如果样品% B。出了范围只能说明样品的浓度大于高浓度的标准或低于低浓度的标准。质量控制 1.0 ppb标准品的% Bo值应该处于下面的范围之内1.0 ppb Microcyst in con trol0.80-1.30 ppb 样品计算（见表2-4 ）表2-4物质吸光度值平均吸光度+/-SD%RSD%B0浓

23、度（ppb）阴性对照1.4781.515 ±.0523.4100N/A1.5521.2550.11.1941.225 ±.0433.580.8N/A0.9410.30.9320.937 ±.0060.6861.8N/A0.6260.80.6020.614 ±.0172.740.5N/A0.3892.00.3860.302 ±.0080.5425.6N/A样品0.6100.622 ±.0172.731.50.9090.6342.2.3樱桃谷蛋的处理将刚孵化的鸭蛋用清水清洗，洗净表面脏物等。将洗净的鸭蛋经消毒水（0.1%苯扎溴铵溶液）清洗

24、，然后用纱布一个个擦干。放入孵化框放入孵化箱。（注意检查鸭蛋外壳是否完好，破损的应即时蜡封或丢弃，防止污染其他鸭胚。）2.2.4鸭胚微囊藻毒素的处理处理方法先将鸭蛋孵化至3天，此时，已经可见卵黄囊血管区，待观察到胚胎活动时再注射藻毒素。通过体视显微镜观察鸭蛋可见鸭胚卵黄囊血管区，用铅笔画圈做标记，标记部位即为注射藻毒素的部位。用针筒吸取已配好的微囊藻毒素溶液，定量对各鸭胚进行注射，注射后用石蜡封口并放 入孵化箱，以防止鸭胚受冻死亡。实验设计实验组50枚，每枚注射50 L的微囊藻毒素；对照组 35枚，每枚注射50的生理盐水。注射器体积为1ml。每天照蛋检查1次，观察鸭胚的发育情况，出现死亡，则要

25、即时丢弃，并统计死亡量。孵化至7、9、11天时处死，观察实验组和对照组鸭胚的发育情况，分离肝脏，并立即用福尔马林溶液固定， 进行组织检测。鸭胚孵化参数 温度：1-14天胚龄38.5 C。 相对湿度：1-7天胚龄65-70 % , 8 -26天胚龄55 -60%。按照以上标准对孵化箱温度、湿度以及翻蛋频率进行调节，使鸭胚在理想条件下进行孵化。225石蜡组织切片的制备固定与包埋1.取材：用镊子拨开蛋壳空泡面，取出鸭胚，分离肝脏（如图 2-1可清楚的找到肝脏的分布位置）1.性腺；2.左肾的后部；3.输卵管分泌部；4.子宫部；5.阴道部；6.泄殖腔；7.心脏;8.左肺；9.肝脏；10.腺胃；11.肌胃

26、；12.小肠；13.盲肠。图2-1 鸭胚解剖直观图2.固定：4 %中性甲醛（10%中性福尔马林）固定 4-6h。组织大时18-24h或更长。3.水洗:用流水冲洗已经固定的组织块30min。4.脱水（常温下）I乙醇一甲醛（AF ）液固定：60mi nn80%乙醇：120mi n出95%乙醇I:120mi nIV95%乙醇II :120mi nV无水乙醇1:60mi n屮无水乙醇II :60mi nVII无水乙醇III :60mi n注意事项：未经充分固定的组织不得进入脱水程序； 用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5 -10倍以上； 自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水； 脱水试剂应及时过滤、更

27、换（500 mL乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换） 较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水； 组织块置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）； 丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。5.透明I二甲苯1:20minn二甲苯II:20min出二甲苯iii :20min注意事项： 二甲苯的容积应为组织块总体积的5-10倍以上； 组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异（组织块呈现棕黄或暗红色透明即可）； 二甲苯应及时过滤、更换； 组织块经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或

28、脱水不充分，应查找原因并妥善处理。6.浸蜡I石蜡1(60 -62 C):60minn石蜡II(60 -62C):60mi n出石蜡iii(60 -62C):60mi n注意事项： 融化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内（65 °）进行，不得用明火加温； 熔蜡的容积应为组织块总体积的5-10倍以上； 组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中； 浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时间组织硬脆； 熔蜡应及时过滤、更换。7.包埋I用加热的镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下包埋。注意事项： 将

29、熔化的石蜡倾入切片盒中，应将组织块平整地置放于切片盒底面的中央处； 包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上； 腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。n待包切片盒内的熔蜡表面凝固后，立即将切片盒移入冷水中加速凝固。川从切片盒中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块），用刀片去除组织块周围的过多石蜡IV用铅笔对包埋有组织的石蜡进行编号，要求标出组织块来源，还应清晰可见。V把修整好的蜡块放入冰箱，以备切片注意事项： 应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的编号（包括组织块种类和器官） 必须严防各种异物污染，勿将无关组织如缝线、纸屑或其他异物（尤其是硬质异 物）埋入蜡块内。

30、 包埋过程里要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。8. 切片：调节切片机（一般厚度调至3 um刀片倾斜角5度）,进行切片。切出的蜡片应连续呈带状，完整无缺，厚度适宜（3- 5 um）、均匀、无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等。9. 展片：用镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚度均匀的蜡片，放入伸展器的温水中（37 C），使切片全面展开（注意：必须水温适宜、洁净尤其是水面；每切完一个蜡块后；必须认真清理水面，不得遗留其他病例的组织碎片，以免污染）。对于展片困难的切片经 30%的乙醇初展后再用载玻片捞起蜡带放人展片仪水盒内可使切片更易展平。10. 贴片：用经APES处理过的载玻片捞展得好的片子，蜡

31、片与载玻片之间无气泡。11. 烤片：保持电热鼓风干燥箱的温度在60 C,烘烤60 min。苏木精伊红（HE）染色1.二甲苯1:5min2.二甲苯II:5min3.无水酒精1:3min4.无水酒精II:3min5. 95% 酒精 1:3min6. 95% 酒精 II :min7. 80%酒精：1min8.蒸馏水：1min9.苏木素液染色：30min （注意：染色的效果做好在显微镜下观察一下，如果效果不好，再加长时间，时间长了要更换苏木素液）10.流水洗去苏木精液：30min （注意：染色的效果做好在显微镜下观察一下，如果效果不好.再加长时间，时间长了要更换0.5%伊红液）11.稍水洗：2s12.

32、 0.5%伊红液染色:20mi n13.蒸馏水稍洗：2s14. 80% 酒精：2s15. 95%酒精 I:3min16. 95%酒精 II :3min17. 无水酒精1:5min18. 无水酒精II :5min19. 无水酒精III :5min20. 二甲苯1:5min21. 二甲苯II :5min22. 二甲苯III :5 min23. 中性树胶封固：干涸前封好（注意：封片要速度快，以免二甲苯挥发完了影响切片的色泽 效果，最好在10S中完成）。2.2.6显微观察、采图将制作好的切片放在荧光倒置显微镜下观察，实验组与对照组进行比较。2.2.7数据处理通过使用SPSS 13.0统计软件处理数据。

33、3.结果3.1微囊藻毒素的检测结果ELISA检测样品浓度：检测结果：tf本遇择伍=11际丰Sc空自对阴.E t fflttW HC f阳性对坦忙 厂圜控斥粛厲 t? i® S ST试樱式空防？试厦叶皿遗试日期画 调皿疲検胭 靈牴頻军I申 iSteSTKaii-ti-T-b空白枫:|o阴性刃鑿；p亓厂 團性別照-oEEDFF；厂箍号：HSujtjmh抑合曲険曲:|EMpgjcClQO. L473M / Q£ = W.TOID4) = (=D. 83«916)0 畤性:|0.999&3®423Lee5_入库打印査:5应.台苣戟心退岀:当苛所有昱示的叩

34、值巳空fi!逛去了空白.ffl*V2|3<寵15TLZST234CL56-81E*Ei0.TI90.帕0.5270. 324一£1£1Er召0.53*0.20.2130.1140.2Q30.0990.111D.0&5D. tilHQ牺1*陶1U言營式：Ekp LojCKi.- f-o IDffTJU) - (-U 03«I5H f 0 CEKEf)ft?摞SR ： |晦临；便性3 Itt : |瞇310M)0 5E70.1a樹0.3O.£L30.3D.LLL2.0曲域拟合图3-1 ELISA检测标准曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：E

35、xp(Log(0.147304/(x-(-0.78704)-(-0.834916)/0.020366)，相关系数为：0.9998。由公示计算可得微囊藻毒素溶液在不同稀释倍数下的浓度(见表3-1)表3-1样品/标准品吸光度浓度ppb藻毒素原始浓度 ®/ml稀释(1/5)140.4430.18979379374115.8稀释(1/5)130.4050.23491983419143.3稀释(1/5)120.3240.36032222853219.9稀释(1/50)110.2110.64423504185393.2由上表可知， MC平均浓度为：218.05用/ml3.2鸭胚的藻毒素处理结果3

36、.2.1樱桃谷种鸭蛋的平均重量实验共购得樱桃谷种鸭蛋350枚，破18枚，其中未受精的共82枚，受精率为75.30%，随机抽取受精蛋中的45枚进行称重(见表3-2)。表3-2樱桃谷种鸭蛋的平均重量鸭蛋质量(g)72.3971.0881.5773.6165.1977.7475.5671.1175.2367.0379.4682.6365.6466.4570.8173.8375.3772.6673.5870.0877.1773.8776.2673.2781.3787.4878.6769.6863.2866.5264.5665.9367.2573.6467.5072.5278.7981.1875.378

37、4.9876.0771.6968.9767.0366.70本实验从350枚樱桃谷种鸭蛋中随机抽取 45枚进行称量，鸭蛋的平均重量73.13 ±.87 (SEM )。使 用SPSS 13.0统计软件使用单一样本 T检验分析可得(见图3-2),显著性Sig=0.998>0.05，所以，樱 桃谷种鸭蛋的个体差异对实验结果没有影响，实验可信度高。T-TestOne-Sample StatisticsNMeanStd. DeviationStd. ErrorMeanweight4573.12825.B1657.8670SOne-Sample TestTest Valuer 73.13td

38、fSig C2-tailed)Mean Difference95% ConfidenceInterval oftlie DifferenceLowerUpperweight-.00244.998-.001 73-1.74931.7457图3-2 T检验分析结果322鸭胚的死亡情况每天照蛋并统计鸭胚的死亡率（见表3-3,图3-3）表3-4不同孵化天数的死亡率组别不同孵化天数的死亡率4天5天6天7天8天9天10天11天总死亡率实验组5.56%8.82%12.9%3.70%23.08%00044.44%对照组1.00%2.02%1.03%01.08%2.17%02.22%9.00%鸭胚死亡率率亡死*

39、实验组-对照组天数图3-3鸭胚死亡率323鸭胚胎发育过程与解剖特征表3-4鸭胚胎发育的过程与特征鸭蛋孵化天数（天）照蛋时的特征胚蛋解剖时的特征1-1.5蛋黄表面有一颗颜色稍深、四周稍亮 的圆点，俗称“鱼眼珠”或“白光珠”未解剖2.5-3已经可以看见卵黄囊血管区，其形状 很像樱桃，故称“樱桃珠”未解剖4卵黄囊血管的形状像静止的蚊子，俗称“蚊虫珠”。卵黄颜色稍深的下部似月牙状，又称“月牙”未解剖5蛋转动时，卵黄不易跟随转动，俗称 “钉壳”。胚胎和卵黄囊血管形状像一只小的蜘蛛，故又称“小蜘蛛”未解剖5.5能明显看到黑色的眼点，俗称“起 珠”、“单珠”、“起眼”未解剖7胚胎形似“电话筒”，一端是头部，

40、 另一端为弯曲增大躯干部，俗称“沉”。正面已布满扩大的卵黄和血 管正面：胚胎较易看到，像在羊水中浮 游一样，俗称“浮”背面：卵黄扩大 到背面，蛋转动时两边卵黄不易晃 动，俗称“边口发硬”胚胎已现明显的鸟类特征，颈伸长，翼、喙明显，脚上生岀趾，呈水禽结构样。卵黄增大到最大，蛋白重量相应下降9胚胎的肋骨、肺、肝和胃明显，四肢成形趾间有蹼。用放大镜可以看到羽毛原基分布于整个体躯部分10-11蛋转动时，两边卵黄容易晃动，俗称 “晃得动”。接着背面尿囊血管迅速伸展，越岀卵黄，俗称“发边”胚胎眼裂呈椭圆形，脚趾上岀现爪，绒毛原基扩展到头、 颈部，羽毛突岀明显，腹腔愈合，软骨开始骨化。尿囊 迅速向小头伸展，

41、几乎包围整个胚胎。气室下边血管颜色特别鲜明，各处血管增加3.3 MC肝组织切片观察结果3.3.1 MC对肝脏的形态影响把鸭蛋破壳后，取出鸭胚并分离得到新鲜的肝脏，观察发现对照组鸭胚肝脏有多片肝小叶且清 晰可见；而其他实验组经藻毒素处理后的鸭胚肝小叶多数处于凝结现象，甚至与肠等部分内脏器官 黏连在一起，只有少数清晰可见。结果显示，与对照组相比，肝小叶逐渐变小且颜色灰暗，弹性不 强，硬度增大且有充血和肿胀的现象。3.3.2 MC处理的肝脏组织观察图3-5对照组第7天肝脏组织切片（400 X）图3-6实验组第7天肝脏组织切片（400 X）通过实验对照图可以观察到鸭胚孵化至7天后，对照组鸭胚的肝脏组织

42、清晰，有细胞核等各种细胞器，且排列整齐、规则、胞质丰富，细胞显得较为饱满，细胞膜边界清晰，肝窦状间隙较小； 而经MC处理后的鸭胚肝脏组织中出现细胞膜边界模糊，细胞排列不规则等现象。图3-8实验组第9天肝脏组织切片（400 X）10urn图3-7对照组第9天肝脏组织切片（400X）通过实验对照图可以观察到鸭胚孵化至9天后，对照组鸭胚组织清晰， 有细胞核等各种细胞器，且细胞排列整齐、规则、胞质丰富，细胞显得较为饱满，细胞膜边界清晰，肝窦间隙较小；而经MC图3-9对照组第11天肝脏组织切片（400 X）图3-10实验组第11天肝脏组织切片（400 X）处理后的鸭胚肝脏组织中出现细胞膜边界模糊，肝窦间

43、隙扩大等现象。通过实验对照图可以观察到鸭胚孵化至11天后，对照组鸭胚组织清晰，有细胞核等各种细胞器,且细胞排列整齐、规则、胞质丰富，细胞显得较为饱满，细胞膜边界清晰，肝窦间隙较小；而经MC处理后的鸭胚肝脏组织中出现细胞膜边界模糊，肝窦间隙扩大等现象。4.讨论肝脏是脊椎动物一个很重要的器官，它不仅可以分泌胆汁帮助脂肪消化，且还参加物质代谢， 具有解毒和造血的功能11。MC极易从血液中转移到肝脏，其进入肝细胞膜可能有两条途径：一条 是经过胆酸转运系统；另一条是通过有机阴离子转运多肽超家族的成员进行运输12-14。当MC作用与肝细胞和肝巨噬细胞，就会抑制干细胞中蛋白磷酸酶的活性，高剂量MC可破坏肝细

44、胞骨架，导致肝细胞和窦状隙发生形态学改变，肝脏广泛出血，低血溶量休克而造成动物死亡，低剂量主要是 促发肝癌。此外，MC可以在贻贝和扇贝的消化腺内积累，并可以通过食物链进入鱼、鸟、哺乳动 物和人类15。本实验通过 MC来处理鸭胚，以研究 MC对鸭胚肝脏的毒性影响，而实验结果也显示了MC对鸭胚肝脏组织具有明显的损害。本实验所采用的MC是蓝藻在特定培养条件下提取的到的，未对其产毒量与产毒效率是否受其他环境因素影响进行探讨。本实验主要运用 ELISA对MC进行定量的检测。ELISA检测法是一种固相测定，将抗原包被于聚苯乙烯微孔板后，每孔加入待测抗体孵育。如 待测抗体能与抗原反应，即可产生抗体-抗原结合

45、物。而后加入酶标二抗再经孵育，即生成抗原-抗体-酶标二抗结合物，随之加底物显色，用酶标检测消光值大小，根据标准曲线可算出欲测抗体的浓度，或按抗体的倍比稀释度计算出效价。本法灵敏度极高，检测限很低，定量检测水体总毒素，可达到 p9级水平，且需要样品量少，前处理简单。本实验选择孵化 3天后的鸭胚，再对其注射藻毒素，是由于三日龄的鸭胚可在鸭蛋中浮动，如 果长时间将打孔过的鸭蛋放置而未对其进行藻毒素的注射，胚胎会浮游到打孔处，此时在对鸭蛋注 射藻毒素可能会破坏鸭胚组织，导致注射后死亡率成倍的上升，而不能确定是否是浓度过高造成的 死亡，对实验产生误导，影响实验结果。此外，三日龄的鸭胚处于开始发育阶段，部

46、分器官开始形成，有些已经有雏形，通过毒素处理可以有效的使毒素分布在与鸭胚发育过程中形成的各个器官。同时，也可较为明显的发现藻毒素对各器官的不同影响情况和器官细胞形态的变化的不同状况。实验所采用的石蜡切片技术观察细胞组织的形态变化。活细胞或组织多为无色透明，各组织间 和细胞内各结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别；然离开机体后就会很快死亡，且发 生组织腐败，失去原有的正常结构。因此，组织需经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞 组织死亡，且又能清晰辨认其形态结构。而本实验采用的HE染色主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，细胞质和细胞外基质着红色，与石蜡组织切片技术相结合可

47、以很好的观察组 织或细胞的一般形态及特点16-21。通过石蜡切片与 HE染色观察发现，经 MC处理后肝细胞呈现组织模糊，细胞排列不规则、胞 质较少、细胞萎缩、细胞膜边界模糊、肝窦间隙较大，且随着鸭胚的长大而呈现明显的增长趋势。此外，本实验在鸭胚的发育阶段、鸭胚死亡率及分析肝细胞组织变化时均设置了实验组与对照 组，通过反复比较及统计学软件的应用确定实验的最佳方案，从而减少了实验误差，确保了实验结 果的可靠性。5总结与展望肝脏是MC积累和作用的主要靶器官，本实验主要研究了MC对鸭胚肝脏的毒性影响，但其对其他器官也有一定的积累作用，对于阐明其具体的致毒机理有待进一步的研究。我国是蓝藻水华的 多发地带

48、，对于加强水源藻类毒素污染的防治尤为重要。此外，肝癌的流行病学调查研究结果也证 实了 MC促进肿瘤形成的假说19-21。因此，对于水禽产品及饮用水的安全问题，也必须引起人们的 足够重视。参考文献1 Lee T H, Che n Y M, Chou H N. First report of microcyst ins in Taiwan J. Toxico n, 1998,36 :247-255.2 Brittai n S, Mothamed Z A, Wang J. Isolatio n and characterizati on of microcysti ns from a River N

49、ile strain of Oscillatioria ten uis Agardh ex Gomon t J. Toxico n,2000 (38):1759-1771.3 Mez K, Han selma nn K, Preisig H R. Environmen tal con diti ons in high moun ta in lakes containing toxic ben thic cya nobacteria J. Hydrobiologia, 1998 (368):1-15.4 Chu F S, Huang X, Wei R D. Product ion and cha

50、racterizati on of an tibodies aga inst microcyst ins 1989.5 Harada K-I, Mayumi T, Shin ada T, et al. Co-product ion of microcyst ins and aerugi no pepti ns by n atural cyan obacterial bloom. En viro n. Toxicol. , 2001, 16:298-305.6 Bojian S, Gorazd K, Jana B B, et al. The role of microcystins in heavy cyanobacterial bloom formation J. J Pla nkton Pes, 1998,20 (6):691-708.7 Tore L, Petra O, Katrii na K-H, et al. Toxic algae and fish mortality in a brackish-water lake in Ala nd, SWFi nland. Hydrobiologia, 1999, 397: