非可控性结肠炎癌变过程的转录组动态变化及其分子机制研究

1、非可控性结肠炎癌变过程的转录组动态变化及其分子机制研究 分类号? 密级?博士学位论文非可控性结肠炎癌变过程的转录组动态变化及其分子机制研究作者姓名 唐岸柳学科专业 内科学学院系、所 中南大学湘雅三医院指导老师 沈守荣教授答辩委员会主席论文答辩日期立:中南大学二。一二年五月原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名:日期:丝年月日

2、堡缉学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库,并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名:阜辑导师签名谴速日期:坐年鱼月日驻:。謦本课题受如下基金资助国家自然科学基金项目:湖南省研究生科研创新项目:“工程”创新人才培育基金:博士学位论文中立摘要摘要【研究背景】非可控性炎症在肿瘤的启动、促进与进展中发挥重要作用。结直肠癌是世界第

3、三大癌,严重威胁人类健康。非可控性的结肠炎症,如溃疡性结肠炎,可显著增加罹患结直肠癌的风险,且结直肠癌的发生与炎症的严重程度、范围等因素呈正相关。结肠炎相关性癌与传统意义上的结直肠癌相似,为一涉及多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。而与经典结直肠癌的“腺瘤.腺癌”序列不同,溃疡性结肠炎发展至结直肠癌经历了“炎症.不典型增生.癌症”的序列演进。目前对溃疡性结肠炎相关性结直肠癌发病机制的研究才刚刚起步,尚缺乏针对连续病变阶段的动态组学研究,对其分子机制及其调控网络的认知电不全面。为从全基因组转录水平与蛋白表达水平两个层面全面、深入地探讨“炎.癌链”中的分子事件及其交互作用网络,本研究在构建化学诱导的

4、非可控性结肠炎及其相关性结直肠癌的小鼠模型基础上,采用全基因组表达谱基因芯片技术结合生物信息学分析、炎症因子抗体芯片蛋白芯片技术、实时定量以及免疫组织化学法,对“炎症一不典型增生一癌症”序列演进过程的转录组及“炎.癌”调控网络中的关键信号通路与分子的动态变化规律进行分析归纳,旨在为非可控性结肠炎及其相关性结直肠癌的发病机制和临床诊治提供理论依据。;可控性结肠炎及结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型的构建】通过单次小刺量地腹腔注射诱变剂氧化偶氮甲烷,周后予以循环饮用致炎剂葡聚糖硫酸钠,我们成功构建非可控性结肠炎及其相关博士学位论文 中文摘要性癌小鼠模型。该模型具有与人类溃疡性结肠炎及其相关性癌相似的特征

5、:临床表现上均有腹泻、大便隐血、粘液脓血便、体重不增或下降。病理学观察,给予葡聚糖硫酸钠后小鼠结直肠出现明显的炎症反应,大量炎性细胞浸润,糜烂与浅溃疡从大肠远端向近端发展:随着葡聚糖硫酸钠的循环饮用,形成非可控性的慢性肠道炎症,疾病进展呈现典型的“炎症一不典型增生.腺癌”的序列演进过程;不典型增生以扁平型为主,不典型增生与癌呈多灶性,且发生于炎症较重的部位。小鼠模型与人类溃疡性结肠炎及结肠炎相关性癌有相似的表达谱特征。以上发现证实该模型可较好地模拟人类溃疡性结肠炎与炎症相关性癌,有科学应用价值,可为后续试验提供保障。【非可控性结肠炎癌变过程的转录组动态变化规律】转录水平的变化是基因组遗传信息的

6、集中体现,为了全而地揭示溃疡性结肠炎相关性结直肠癌病变各阶段转录组的动态变化规律,本研究选取“正常一炎症一不典型增生一腺癌”各病理阶段的小鼠肠道黏膜进行全基因组表达谱芯片分析。研究发现,各病理阶段的基因表达呈现一定的规律性,尤以早期炎症期的分子变化最为显著,分别有与个基因探针在炎症组织中较正常组织发生了上调与调,形成一阵“转录风暴”。多种聚类分析显示炎症期的样本严格聚为一类,在主成分中占有绝对地位。对基因注释本体的富集度网络分析发现,该时期变化最显著的为炎症相关基因集,包括直接参与炎症反应的细胞因予、趋化炎症细胞的趋化因子、诱导白细胞粘附的粘附分子、参与组织修复的血管生成因子与基质重建因子、诱

7、导坏死细胞凋及促进肠上皮细胞存活与增殖的因子等等,而这些基因集在不典型增生及癌症期表达趋于缓和,表明机体在早期处于积极地防御状态,而至后期,机体逐渐对炎症与肿瘤细胞产生耐受,转录水平改变中立摘要趋缓:也提示肿瘤微环境对免疫细胞的改造作用。这种早期的剧变可能已经决定了细胞的命运与疾病的走向。在癌症期,仍有部分炎症因子的活跃,主要是促进细胞增殖、抑制凋亡、促进血管新生与基质降解的基因表达上调,充分体现出结直肠癌的恶性行为特征。【信号通路的阶段性活化是连接“炎.癌”的纽带】经基因表达谱芯片的生物信息学分析及免疫组化验证,本研究发现?、 及/.等信号转导通路在进程中存在阶段性活化。其中?.经典途径与两

8、条信号通路在“炎症.不典型增生.癌”的序列演进中呈现持续性活化,、磷酸化及其靶基因编码蛋白、一的表达均呈逐级升高的趋势;?旁路途径仅在炎症细胞中活化,且在炎症期最为活跃,而不典型增生期至癌症期表达信号的活化发生于炎症期及不典型增生期:在逐渐下调:肿瘤形成阶段 失活,而/一通路开始处于明显活化状态。这些结果表明,?.经典途径与旁路途径、及可能对炎症的启动和维持具有重要作用,参与炎症细胞的趋化、促炎因子的释放;而.经典途径、及诱导的持续性炎症反应又对肠上皮细胞的恶性转化产生积极作用,微环境当中的细胞中上述信号的激活导致细胞因子的持续产生,继续作用于转化细胞,促进其存活与生长;随着/.通路的激活被认

9、为是抑瘤基因,促瘤与抑瘤与 的失活的平衡终于被打破,在.经典途径与信号所营造的炎性背景下,肿瘤稳定形成与进展。【非可控性结肠炎癌变过程动态交互作用网络的关键节点】中立摘要博士学位论文结合表达谱芯片数据分析及血清炎症因子芯片的检测结果,我们找到非可控性结肠炎癌变过程各病变阶段的交互作用网络关键节点。炎症期,.、.、.及位于上调的分子网络中心,家族成员、紧密连接蛋白与肝细胞核因子位于下调的分子网络中心:不典型增生期,上调分子网络的关键节点为和.,下调分子网络的关键节点为家族和家族成员:癌症期,上调分子网络的关键节点包括.、一、等,下调分子网络的关键节点则由家族与家族成员组成。这些关键分子与众多的差

10、异分子发生交互作用,并与.、 及/一等信号通路紧密相联,形成特色的阶段性的动态调控网络,推动非可控性炎症介导的恶性转化。综上所述,利用小鼠模型研究“非可控性结肠炎一不典型增生结直肠癌”序列演进过程中不同病理阶段转录组变化规律,并在蛋白水平进行初步验证,为我们迸一步探索相关分子机制及其调控网络提供了有价值的理论和实验依据。本研究通过高通量的全基因组表达谱芯片分析发现了基因组的动态转录规律,在炎症早期形成的转录风暴似乎决定了疾病的走向,通过生物信息学分析和免疫组化验证,首次报及/.等关键信号通路的道了.、阶段性活化规律;而对血清炎症因子芯片的筛查则对上述结论提供了更有力的支撑。这说明在炎一癌演进的

11、多阶段过程中,关键信号通路及其下游靶基因的阶段性活化发挥主要推动作用。尽管小鼠与人类的同源性很高,对研究结论的推广尚需进行大量临床样本的验证。将人类疾病样本数据与动物模型数据进行整合,有望为临床上对溃疡性结肠炎及其相关性结直肠癌的早期诊治提供新的思路;并提示医务工作博士学位论空 中文摘要者应高度重视对慢性炎症的预防与治疗,阻止炎症的恶性转化。关键词非可控性结肠炎相关性结直肠癌,氧化偶氨甲烷/葡聚糖硫酸钠,动态转录组,信号通路,交互作用网络关键节点博士学位论立英文摘要, 卜 ?, , ,? ,? ,?.?“?” “?” , ”? ” , ,?,? ”?”, ?, 英文摘耍博士学位论文? ,:,:

12、, , ; :, , ,; , ”? ,”,; /.【.,”?” ,博士学位论文 英文摘要”. , , “ , ., , , , . :?.,“? ?,?“?.” ,一?一英文摘要 , ,/一? .一曲, 邵一 ,?, 一: 【? ,?.,一,一,一, ,一 ,博士学位论空 英立摘要,一, , /? , ?,“ ? , , .?, , /一, , ×英文摘要博士学位论文,.? 】: ./ ,. .博士学位论文 目录目录中文摘要英文摘要?主要缩略词简表第一章前言?技术路线第二章材料与方法材料方法第三章结果第一节非可控性结肠炎及其相关性结直肠癌小鼠模型的构建小鼠的一般状态、体重及疾病活动

13、指数评分组织病理学特征?第二节非可控性结肠炎癌变过程的转录组动态变化规律差异基因筛选芯片数据的聚类分析基因注释本体的富集度分析 第三节”炎一鼎链”动态网络的构建与关键节点的剖析 各期差异表达分子交互作用网络的构建信号通路分析.表达谱芯片结果的验证?.非可控性结肠炎癌变过程中血清炎症因子动态表达规律分析与网络数据库的对比研究 .第四章讨论一 第五章结论参考文献综述?一 致谢攻读学位期间主要成果 】博士学位论文 耍缩略侧简表主要缩略词简表缩略词 英文全称? ? ? 篓篡裟茹答霉鬻器詈黧。九障士学位论文 一要缩略词简表?一 ?/博士学位论文前言第一章前言炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的

14、防御反应,是一个受到精细调控的程序化过程,完成异物清除及组织修复后炎症将适时终结。一旦刺激因素持续存在或者任意调控环节出现异常.将导致炎症状态的持续,即“非可控性炎症”。尽管非可控性炎症可能并不是动脉粥样硬化、代谢综合征、炎症性肠病、类风湿关节炎甚至肿瘤等慢性疾病的根本原因,却很大程度上参与到这些。疾病的病因机制当中,严重影响人类健康自年德国病理学家】首次提出“肿瘤来源于慢性炎症组织“,至年杂志上”%调“肿瘤相关性炎症为肿瘤的第七大特征“,炎症与癌症的关系已成为肿稽研究领域的热点。世界上约%的肿瘤与非可控性炎症性疾病相关”】,幽门螺杆菌感染可致胃痛、慢性乙型肝炎病毒感染可致肝癌、长期吸入石棉导

15、致的慢性炎症与问皮瘤相关、炎症性肠病大大增加结直肠癌的发稿风险【】,而非甾体类抗炎药的应用可降低炎症相关性癌的发病率”。流行病学与临床研究数据充分显示,炎症与肿瘤的关系密切,炎症微环境在肿瘤的启动、促进与进展的全过程巾发挥熏要作用。,是消化道常见的恶性肿籀,其发病率高结直肠癌居世界第三位,每年约有百万人发生【,在发展巾国家其发病率也呈逐年%,高于全球平均递增速度。经典的肠道上升趋势。我国发病率年增加非可控性炎症性疾病?溃疡性结肠炎 .可显著增加的患病风险。在西方国家常见.尤在英美及北欧的发病率较高,近年来我国的发病率有增高的趋势。最新资料显示,大约%的患者可能最后发生,且是患者的主要死因之一。

16、大样结直肠癌,较一般人群高倍【%一%,年以上为本分析统计了璃变的累积发病率:年以上为%一%,年以上为 /俨%”,且与炎症的严重程度、范围等因素呈正相关【,高度提示炎症在结直肠肿瘤的发生发展中有着重要作用。目前为止,尽管已对结直肠癌进行了大量研究,普遍认为其发病是一个涉及多基因、多步骤、多阶段的复杂过程,但其具体的发病机制仍不清楚,尤其是对溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发病机制研究,还处于起步阶段。发展至经历了“炎症一不典型增生.痛症”的序列演进?,与传统意义上经历的“腺瘤。腺癌”序列不同,推断其分了机制也不尽相同。确实,研究发现、等基因的突变时序在两者间存在差异,这些差异可能源于肿墙微环境当前言

17、博士学位论文中的炎症刺激。但是,在“炎症一不典型增生.痛症”的序列演进过程中发生了怎样的分子事件这些分子事件之间又有怎样的联系哪些事件是调控网络中的关键环节仍是亟待解决的问题。因患者发生不典型增生及癌变的病程长、患者生存环境巾的影响因素不可控,而细胞实验又不能很好地模拟炎症/肿瘤微环境,建立有效的“非可控性结肠炎一结直肠癌”动物模型势在必行。本研究成功构建了氧化偶氨甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的非可控性结肠炎及其相关性结直肠癌的小鼠模型.建立了动物模型标本库:井在此模型基础上,利用全基因组表达谱基因芯片技术结台生物信息学分析、炎症因子抗体芯片蛋白芯片技术、实时定量以及免疫组织化学法,分别在全基因组转

18、录层面与蛋向表达水平分别对“非可控性结肠炎.不典型增生.结直肠癌”的序列演进过程进行了动态研究,全面、深入地探讨“炎一癌链一中的分子事件及其调控网络.为非可控性结肠炎及其相关性结直肠癌的发病机制和临床诊治提供理论依据。博士学位论文技术路线技术路线/处理建立小鼠盟 对照组小融:生理盐水/蒸馏水模型 规察记录两组小鼠体重、精神状态、粪便性状、脱肛等症状体征变化情况.进行评分不周时间点、及周末随机处死实验组小鼠¨只.对照组小鼠只处死前眼球取血取结直肠标;串,%多聚甲醛周定后进行病理切片一染色观察黏膜痫变情况取小同病理阶段结直肠黏膜包括正常黏膜、炎症、小典型增生、班变组织提取总 免疫组化验正

19、小同病 小鼠炎症园:露墓蒹桑纂盛篆 理阶段的信号通路活 子扎体芯片化情况: 构建血清炎疝分子时问动志表达谱信号通蹄中关键凼子的表逃南生物信息学分析:杨红回顾士完筛选各时段差异基因成聚炎分析?磷酸化宦集分析的表达分子交互作用络构建的表达分析与络数据库进行比对验证芯片数据探讨“非,控性炎瓶不执型增生一癌疵”序列演进过程巾关键分子投拜调控网络的动态变化规律第:章博士学位论文第二章 材料与方法书料.实验动物周龄雄性小鼠只,购于上海斯莱克实验动物科技服务部。饲养条件:无特定病原体 级,温度。,湿度%±%:白昼/黑夜±轮换,喂食普通小鼠饲料。饲养地点:巾南大学实验动物部。实验前体重。本

20、研究经中南大学湘雅三医院医学伦理委员会批准,课题中所使用的动物严格按照批准的研究方案开展研究工作。.主要试剂与溶液.小鼠模型构建氧化偶氨甲烷,葡聚糖硫酸钠 ,相对分子量 ?,联苯胺,上海远航试剂厂.基因襄达谱巷片,厨.。该小鼠全基因组寡核个已知小苷酸芯片由厨公司提供,个探针组中包含至少鼠基因, 个转录本。芯片采用寡聚核苷酸原位光蚀刻专利技术,应用独特的撩针设汁,使得芯片具有信息量大、特异性和灵敏度高的特点。总抽提?, ,” ,。,质量碱测: 甲醛上样染液,演化乙锭, .的合成及其探针标记博士学位论文 第二章?, , ? ./洗脱与染色蹄盼, ,/,/?,?/、?,/,/ 一? .,一丹,.,/

21、 , , ,/,/,/?/ ,一 % /.验证芯片结果,宝生物工程有限公司,实时定量试剂盒,上海吉玛,.用于检测的引物,应用在线软件设计,博尚生物技术有限公司合成:从】 从 ?丌丌 邢几从【 丌丌淼荔篇孑淼 【墨帆帆娜【墨【至【至【至 州晷暑君删耐量疵椰删 ;篡篡篡 丌博士学位论文第二章:一“:“ :.染色硬免疫组化多聚甲醛、二甲苯,天津科密欧化学试剂有限公司无水乙醇、%乙醇、%乙醇,天津恒兴化学试剂制造有限公司苏术紊、伊红染液,】昀,福州迈新生物技术开发有限公,福州迈新生物技术开笈有限公司叶性快干树胶,北京巾衫金桥生物技术有限公司:,抗体: .:,武汉博士德生物工程有限公司:.,:,北京博奥

22、森生物技术有限公司.炎症园子抗体芯片.,?。该蛋白芯片可同时检测种小鼠炎症因子的表达水平。其核心原理是一个三明治式的免疫反应。个待检测的炎症因子抗体被固定在膜上,小鼠血清中的炎症因子将与该膜上相应的抗体结合.然后被生物素化的抗体混台液所识别。生物信号可以通过化学发光法被探测到。.主要仪器?珠磨式组织研磨器,台式低温高速离心机,仪,一,紫外分光光度计,.,凝胶成像仪,九.目.检测系统,.冷化学发光成像系统,正置荧光显微镜,转移脱色摇床,江苏省金坛市正基仪器有限公司高速离心机.,北京时代兆利离心机有限公司第二章博士学位论文控温磁力搅拌器,?,江苏金坛市金城国胜实验仪器.及冰箱,中国容声公司超低温冰

23、箱,电子天平.仪器上海有限公司微量移液器,公司漩涡混合器,江苏大功率磁力加热搅拌器.?,江苏恒温水浴箱,.软件及数据库.基因芯片实验操作及数据分析软件毋.: /一/。:/?.高通量基因寰达谱分析工具:主成分分析 ,在线软件/:/. 自组织映射图,生成软件:版本生物分子功能注释系统 , :/. /“叫及其插件可视化工具:/./:/蛋白质交互作用网络预测软件:/ /.基因信息查询网蛄与数据库:/. /:./,与人类:.数据对接研究数据来自与 /:/.博士学位治文 第二章/ .:/. /, ;本研究的芯片原始数据已经上传,可通过数据获取号获得:/¨. / 。.实时荧光定量实验操作厦数据分析

24、软件。配套 荧光定量仪方法.小鼠非可控性结脑炎相关性结直肠癌模型的构建厦观察、标本采集.小模型构建小鼠环境下适应性饲养一周后,于周龄时按体重随机分为两组:实验组/组只,对照组生理盐水.蒸馏水组只。实验组小鼠第一天予以腹腔注射/一次,一周后予%连续饮用% 天.随后无饮用蒸馏水,上述/蒸馏水循环次后两次为天蒸馏水天.此后继续予以饮用蒸馏水,构建非可控降结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型。对照组小鼠于周龄时予腹腔注射同体积的生理盐水,并连续饮用蒸馏水。阿组均予正常饮食。.动物的处理及标本采集.小鼠处死时间点的选择以腹腔注射之日为第天,分别于第周末、周末、周末、周末、周末、周末、周末及周末共个间时点详见图随

25、机处死实验组小鼠?只,对照组小鼠只。.标本采童小鼠血清的采集:水合氯醛腹腔麻醉,持麻醉成功后,取小鼠眼球血八 中,室温下水平放置, ,取上清分离心装入 中冰箱存放。肠道组织及其他内脏器官的采集:脱颈处死小鼠,沿腹巾线纵行剖开腹腔,游离结肠和远端回肠.取肛门至盲肠末端的全结直肠。观察各组小鼠结肠的大体形态.测量结直肠长度小肠与盲肠汇合端至月门。沿结肠带纵行剖开结直肠,用预冷无菌生理盐水将结直肠冲洗干净.观察肠道内壁情况,计数病变数日.于其末端距日 处剪取 长肠段段,分别放八盛有适量相当于组织倍体积的冻存管中,液氯保存。其余部分做瑞士卷,%多聚甲醛浸泡过夜,石蜡包埋、切片该部分由杨红第二章博士学位

26、论文园硕士完成,用于染色行病理检查以及免疫组织化学染色。其他组织器官包括肝、脾、肺及肿大淋巴结也同样用%多聚甲醛浸泡过夜,石蜡包埋、切片,进行病理学观察。.结肠炎活动程度评估每观察小鼠的体重、大便性状和便血情况.用联苯胺法检测大便隐血,即在待检粪便上滴滴%联苯胺冰醋酸溶液联苯胺,加冰醋酸至,置棕色瓶巾,滴%过氧化氧溶液.若粪便变蓝则为阳性。参照等的标准”,计算每只小鼠的疾痫活动指数,见表?。体重下降分数大便性状分数便血分数/。正常大便为干而小的颗粒状,松软便为糊状但不粘肛门.稀便为液状且粘附于肛门。袁? 评分标准塑堕坠兰 壁坐堡 望竺竺型 竺一一注:指大便隐血.组织病理学观察处死小鼠并纵行剖开

27、腹腔及胸腔,重点观察结直肠:测量结直肠长度,其后沿肠系膜纵行剪开结直肠,观察大体形态,初步评估炎症、溃疡程度,计数黏膜隆起等病变数目。%多聚甲醛固定标本行脱水、石蜡包埋、切片,苏木精一伊红染色.普通光镜下观察结肠组织的病变情况,包括黏膜的完整性、黏膜内炎症细胞的浸润、隐窝结构的改变程度及炎症范围、不典型增生程度和肿瘤形成情况,并按照等¨剐的形态学评分标准表.分别对近端及远端大肠进行炎症组织学评分。不典型增生及癌变评判分别按照”和唑亭制定的标准进行。同时,观察肝、脾、肺等重要脏器的大体形态.称重.观察腹腔淋巴结是否肿大,取肝、脾、肺组织及肿大淋巴结行病理学观察。以上病理学描述均由两位病

28、理学专业人员采用亩法施行。博士学位论文第二青表炎拄组织学评分标准标准竺生堕?/四 龃.表达谱芯片实验.组织样本取/组小鼠腹腔注射后周末急性炎症黏膜、周末不典型增生、周末腺癌、周末腺癌及周末腺癌结直肠黏膜和正常对照组第天为生理盐水腹腔注射小鼠直肠黏膜各例用于基因表达谱分析,总共 例芯片。其余组织用作后续的验证分析。组织详细信息见表.。第章博士学位论文表用于牟基因组表选特芯片检测的组织样本.组织样本抽提送蹄芯片的组织抽提及痕量基因组消化:/冰冻粉碎组织, 加入适量组织,.组织研磨器充分匀浆。匀浆后的样品于室温静置一,适量氯仿 氯仿/,充分混匀,冰上放置。“,离心,将卜清转移举新的离心管。加入等体积

29、异醇,充分混匀,冰上放置, ,弃上清。.离心沉淀中加入 %.醇.轻管壁使沉淀悬浮,冰上放置。.,离心,弃上清。博士学位碱文 第二章沉淀于守气中自然干燥后.加入?,使其充分溶解。在微量离心管中配制下列消化反应液,水浴 。组织 .性×踮 ?, /? 于上述反应液中加入 ,使得总体积为】.。然后加入等体积平衡酚.充分混匀.冰上放嚣, ,离心,将上清转移至新的离心管。加入等体积氯仿,充分混匀,冰上放置,离心,将上清转移至新的离心管。余步骤同。用于验证的组织:使用公司的抽提,具体步骤如下:溶液配制:每中加入巯基乙醇:将 %乙醇加入“中的组织匀浆:冰冻粉碎组织,?组织研磨器进行匀浆。立即向匀浆组

30、织中加入./,混匀.室温静置此后的操作均在室温下完成。裂解产物,吨离心。于裂解产物中加入等体积的%醇,漩涡震荡充分混匀,使沉淀物充分分散。一次吸取不吵过的样品至离心柱管芯中,离心。弃去过滤液,重复上述步骤直至所有样品被过滤。管芯中加入,离心,将滤液及离心管一起丢弃,管芯放入新的收集管中。管芯巾加入 ,离心.弃去滤波.该步骤重复一次。管芯.离心.弃去滤液及收集管。将管芯置八回收管中,加入?,室温下放第一章置。三.离心,回收管中得到纯化的,标记,置慌保存。.组织样品质检%甲醛变性琼脂变性琼脂糖凝胶电泳观察组织样品有无降解:配制混匀,加至点样孔,电压调糖凝胶,取组织样品与至 ,电泳约 后,于紫外透射检测仪上观察组织样品的、条带是否清晰,点样孔有无残留,以此判断有无降解及污染。分光光度计测定组织样品的浓度和纯度:取 组织样品,应用分光光度计测定与的吸光值。通过的吸光值计算组织样品的浓度,计算公式为:× 咖:通过计算与的比值评价组织样品的纯度。经检测.纯度:/ :总量三;完整性:经甲醛变性胶电泳检测,样品电泳条带清晰,:条带亮度大于或接近:纯度、总量及质量均符合表达谱芯片实验要求见图一】.表。窜亭毒享亨拿争享享享于挚害窖事挚拿图组织琼脂糖凝胶电泳圈个小鼠结肠组织样本.巷琼脂糖凝胶电泳,条带清晰,无降解,且无痕量污染.芯片实验.靶标制备台成制备?稀