第20章 高效液相色谱法

1、第一节第一节 概述概述 高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性

2、差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%续前2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作

3、HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 四、四、HPLC的特点和应用的特点和应用 “三高” “一快” “一广” 一、塔板理论二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择 理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理effeffnLH/2212)(54. 5)(16WtWtnRReff0ttkR2)1(kknneff理 （填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL 续前2）涡流扩散项及其影响 nextuCAHHPLC：mDB2TDm相忽略大低，流动相柱温B

4、TRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，讨论：讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）nextdpA2dpA柱效，nHAdp图示back 续前3）传质阻抗项及其影响 ）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易产生气泡mmDTCDT图示1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择：

5、选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC） 1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等)1 (0mRVSKttmVSKk续前2固定相：与LC比，固定相粒径不同（17% 分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的

6、组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF 续前4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题） 1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 续前4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，

7、极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等 1反相离子对色谱法 2反相离子抑制色谱 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱

8、碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物1 22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相

9、k续前2对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气续前 3洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）图示1泵： 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用2进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室） GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀 续前3色谱柱：直径46mm,柱长