1酶与酶工程绪论0909

1、分子酶与酶工程绪论课程介绍课程介绍l教材：l酶与酶工程袁勤生、赵健主编，华东理工大学出版社l主要参考教材：l分子酶学工程导论张今、曹淑桂、罗贵民等主编，科学出版社l现代酶工程梅乐和、岑沛霖主编，化学工业出版社l生物催化基础与应用，andreas s.bommarius, bettina r. riebel,孙志浩、许建和译， 化学工业出版社微生物是地球上重要的可再生资源，有着重要的应用价值。微生物是地球上重要的可再生资源，有着重要的应用价值。1.1 关于酶关于酶enzymel酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物分子/蛋白质。l研究酶的结构与功能、酶的性质及作用机理对于阐明生命现象的本质具有十分

2、重要的意义。l从酶的水平去探讨生命活动的关系，探讨酶与代谢调节、疾病、生长发育等的关系，具有重要的科学意义和实践意义。酶是一类特殊的催化剂酶是一类特殊的催化剂l酶是高效催化剂。l典型的表观二级速率常数(kcat/km)为106108l/(mols)l能在温和条件下有效地催化很难、甚至不可能的化学转化(kcat/kuncat)可达1017。l酶是有高度选择性的催化剂。l酶对映体的选择性日益强劲地用于手性药物生产。l酶促反应副产物少、条件温和。酶具有高度的底物识别能力和产物的定向能力l酶的催化反应由于极大地简化了化学反应的条件，因而使化学试剂的应用和副产物大量减少，从而在很大程度上减少了对环境的污

3、染。l由于日益增加的环境和经济压力，生物催化剂得到了迅速发展。l微生物为酶提供了丰富的、可再生的资源l基因工程技术进一步解决了稀有酶的来源问题l目前已鉴定的酶有3000多种。temperature classesindustrial application of thermophilylindustrial enzymeslhigher speedllower costltaq dna polymerase and pcr ldna amplificationlrepetitive melting and annealing （退火）l95oc-52oc-72ochuman insulin p

4、roduced by engineered bacteria.l天然酶往往不完全具备应用所要求的所有特性（如操作稳定性、非水相催化、更高的立体选择性和专一性、对非天然底物的催化活性等）l分子酶工程为天然酶的改造提供了可行性antibiotic resistant markerl1982年cech小组发现rna本身可以是一个生物催化剂，称之为核酶ribozyme。l事先设计好的过渡态类似物为半抗原，按一般单克隆抗体制备程序获得具有催化活性的抗体。称之为抗体酶abzyme。酶是具有生物催化功能的生物大分酶是具有生物催化功能的生物大分子。子。 l酶有两大类别：l主要由蛋白质组成称为蛋白类主要由蛋白质

5、组成称为蛋白类酶（酶（p酶）；酶）；l主要由主要由rna或或dna组成，称为组成，称为核酸酶（核酸酶（r酶）。酶）。1.2 关于酶工程关于酶工程enzyme engineeringl酶工程是生物工程的主要内容之一。l是随着酶学研究的迅速发展特别是酶的应用推广使酶学和工程学相互渗透酶学和工程学相互渗透，结合而发展成的一门新的科学技术，是酶学、微生物学酶学、微生物学的基本原理与化学工程与化学工程有机结合而产生的交叉学科。 l它是从应用的目的出发研究酶在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用物质的技术，是生物工程的重要组成部分。l酶是生物体内进行自我复制新陈代谢所不可缺少的生物催化

6、剂。l由于酶能在常温、常压、中性ph等温和条件下高度专一有效地催化底物发生反应，所以酶的开发和利用是当代生物技当代生物技术革命中的重要课题。术革命中的重要课题。 l天然酶在工业上应用受到限制的主要原因有：l大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远；l酶的分离纯化工艺复杂；l酶制剂成本较高。l根据研究和解决上述问题的手段不同把酶工程分为化学酶工程和生物酶工程化学酶工程和生物酶工程。l化学酶工程：天然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用；l生物酶工程则是以酶学和以基因重组酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术技术为主的现代分子生物学技

7、术相结合的产物，l主要包括：l用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；l修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；l设计新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶。1.3 分子酶学工程（分子酶学工程（molecular engineering）l是酶工程在分子水平上的体现。l分子酶学工程包括在分子水平认识酶的基础上改进、模拟酶和全新设计酶。l分子酶学工程的内涵是以天然酶的结构与功能为基础，以酶分子工程为核心，研究工程酶的理论、策略和方法，研究工程酶的催化效率和机制，开发酶的新功能、新性质，发现和创造经济实用的新型生物催化剂。分子酶学工程的概念分子酶学工程的概念 l分子酶学工程分子酶学工程可以看做是蛋白质工程（包

8、括分子进化）和酶工程相融合所产生的一门科学技术。l分子酶学工程包括在分子水平认识酶的基础上改进酶、模拟酶和全新设计酶。改进，模拟，设计改进，模拟，设计结构分析结构分析功能分析功能分析纯纯 化化工工 程程 酶酶分子酶学工程基本流程图分子酶学工程基本流程图天然酶天然酶分子酶学工程的概念分子酶学工程的概念l分子酶学工程的内涵:是以天然酶的结构与功能为基础，以酶分子工程为核心，研究工程酶的理论、策略和方法，工程酶的催化效率和机制，开发酶的新功能、新性质，发现和创造经济实用的新型生物催化剂。l分子酶学工程分子酶学工程的出现表明人们已经按照自己的意图来改进、模拟和设计新酶并且正在有效地把工程酶应用于经济建

9、设和科学技术研究中去。在了解催化机制的基础上人为地提高酶的催化效率是分子酶学工程的主要目标，并由此创造出高催化效率、经济实用的酶。分子酶学工程的基本策略和方法分子酶学工程的基本策略和方法l分子酶学工程研究主要涉及三个相互关系的内容：v一是发展构建工程酶的理论、策略和方法；v二是在考察和研究生物多样性的基础上发现新的酶及其工程化；v三是扩大工程酶的应用领域。 分子酶学工程的基本策略和方法分子酶学工程的基本策略和方法l1）在对酶结构与功能分析的基础上，应用基因工程、蛋白质工程（包括分子进化）技术改变或完善天然酶某些性质并构建出更加实用的新酶，如进化酶、模块酶和杂和酶等； l 2）在分子免疫学、有机

10、化学和分子酶学基础上，应用细胞工程、抗体工程及分子印记等技术从理论和实际两方面研究抗体酶、合成酶、印记酶和酶的化学修饰； 分子酶学工程的基本策略和方法分子酶学工程的基本策略和方法l3）非水相分子酶学工程的研究打破了酶只能在水相中催化的传统概念，不仅开辟了分子酶学工程的新领域，而且为酶在化学、材料科学、医药科学及生物检测中的应用展示了广阔的前景，同时也可能成为发展和实现“绿色化学”的一个关键的突破点； 分子酶学工程的基本策略和方法分子酶学工程的基本策略和方法l4）核酶和脱氧核酶也成为分子酶学工程的一个新领域，别构酶和脱氧酶的设计和应用将可能成为纳米技术中的重要内容；l5）生物传感器是分子酶学工程

11、不可分割的组成部分， 它正向生物芯片、生物计算机方向发展； 分子酶学工程的基本策略和方法分子酶学工程的基本策略和方法l6）组合生物催化（combinatorial biocatalysis）可以高效率产生新型化合物库，为酶的抑制剂和酶标药物的设计开辟一条新途径。基因组学与蛋白质组学的进展将会推动和基因组学与蛋白质组学的进展将会推动和帮助新酶的发现。帮助新酶的发现。 工程酶的分类工程酶的分类 蛋白质酶蛋白质酶非蛋白酶非蛋白酶模拟酶模拟酶核酶核酶(ribozyme, rnazyme)脱氧核酶脱氧核酶(detoxribozyme, dnazyme)肽酶肽酶(pepzyme)抗体酶抗体酶(abzyme

12、)合成酶合成酶(synzyme)印记酶印记酶(imprinting enzyme)杂合酶杂合酶(hybrid enzyme)模块酶模块酶(modular enzyme)进化酶进化酶(evolved enzyme)蛋白质工程酶蛋白质工程酶化学修饰酶化学修饰酶工程酶（水相，非水相）工程酶（水相，非水相）1.4 酶与酶工程的酶与酶工程的研究趋势l从发展方向分析，今后十年酶与酶工程领域的研究热门研究热门有以下几方面：l酶结构与功能的研究酶结构与功能的研究l生物催化过程的研究生物催化过程的研究l改造酶的催化特性及新酶设计改造酶的催化特性及新酶设计l应用酶工程应用酶工程1、酶的结构与功能的研究：、酶的结构

13、与功能的研究：l研究酶的结构与功能、酶的催化作用机理永远是酶学研究的主题。l酶的结构尤其是动态结构、功能尤其是空间结构与功能的关系共同构筑了分子酶学的主要内容，功能酶学和蛋白质组学的渗入和参与为酶学研究增加了新内涵。2、生物催化过程的研究：、生物催化过程的研究：l通常生物催化过程不受通用的技术或底物和产物性质的限制。新的催化过程的可行性往往由生物催化剂效率决定。l生物催化过程不同于常规的化学过程，它经常受到在技术条件下的蛋白质稳定性及在细胞中生理生化作用的影响。 过程底物产物经济情况经济情况产物回收产物回收生物催化剂选择生物催化剂选择生物催化剂表征生物催化剂表征生物催化剂工程生物催化剂工程应用

14、筛选筛选酶或细胞酶或细胞动力学动力学反应条件反应条件结构信息结构信息细胞工程细胞工程过程工程过程工程酶工程酶工程蛋白质工程蛋白质工程新反应新反应稳定性稳定性固定化固定化辅因子再生辅因子再生多相系统多相系统下游下游原位回收原位回收生物催化过程的开发流程l生物催化过程又是典型的高度不均一过程，理论上l需要特殊设计的硬件部分，l需要有高催化效率的生物催化剂，l需要实施计算机控制的软件，l需要能降低成本的回收和再利用技术，l这是生物催化过程，尤其是工业生物催化的四个“必需”。3、改造酶的催化特性及新酶设计、改造酶的催化特性及新酶设计 l改造酶的特性最有效的方法是定位突变（site-directed m

15、utagenesis）和定向进化（directed evolution in vitro）。l定位突变技术只对某些氨基酸残基进行替换、删除、天加或修饰，并不能从根本上改变酶的高级结构，故有一定的局限性。l体外定向进化不需要酶的结构、功能关系和催化机制方面的信息。l它采用随机过程，用易错pcr（error-prone pcr）产生基因突变从而进行筛选。体外重组或dna改组（dna shuffling）促进了定向进化的发展。l这些方法迅速地组合了有益突变并拓展了顺序的多样性。 l获得l-天冬氨酸进化酶的活力比天然酶高28倍；l天冬氨酰酶二肽酶进化酶的活力比天然酶提高47倍；l对海藻糖-6-磷酸合成

16、酶的操纵子的定向进化，建立shuffling-pcr方法，使海藻糖的产量提高12.3倍。 l定位突变和定向进化两种方法各有优缺点，如果将两者组合，会出现优势互补。l试验已经证实，定向进化方法可以有效地扩大定位突变，定位突变可以把关键氨基酸或结构片段引入酶分子中，这是定向进化办不到的。l反之，定向进化也可以与定位突变结合起来，用定位限制随机以减少筛选的库容；用随机扩大定位以增加突变位点。此方法是通过控制合成的底物和浓度比例来实现碱基对的错配。l构建新酶是酶工程研究的前沿和热点，如根据过渡态理论采用诱导法、拷贝法、插入法、化学修饰法和基因工程法制备抗体酶。l随着催化作用机理及化学合成技术的发展，使

17、用分子印迹和生物印迹技术制备的人工合成酶将会在诸如氧化还原反应、有机相酶反应及特殊催化反应中大显身手。l核酶可催化四种反应。除rna有催化活性外，近年来发现dna也有酶活性，此外还发现rna具有催化自身复制的功能。lrna具有信使编码功能与催化功能，实现遗传信息的复制、转录和翻译，是生命进化中最简单、最经济的与催化自身复制加工的rna世界的原始方式，这种高度序列特异的核酶很大的应用价值。4、 应用酶工程应用酶工程l研究重点放在：l开辟酶或微生物法转化合成有用化合物的新途径。在有机合成中重点解决不对称合成和拆分醇、醛、酮、酸、胺、氨基酸、抗生素等手性化合物及药物。l非水相介质中酶促催化是新热点。非水相介